吡喃糖氧化酶在烘烤面包中的用途的制作方法

专利名称：吡喃糖氧化酶在烘烤面包中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种包含酶的面包-改良或生面团-改良组合物，并涉及采用所说的组合物制备生面团和／或烘烤产品的方法。
背景技术：
在生产面包的工艺中，添加面包-改良和／或生面团-改良添加剂到面包生面团中去为人们所熟知，特别是添加剂的作用导致面包改良的质地、体积、味道和新鲜度，以及生面团改良的可加工能力。
近年来，许多酶作为生面团和／或面包改良剂已经被使用，特别是在生面团中大量存在的对组分起作用的酶。在淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶和(半)纤维素酶(包括戊聚糖酶)中可以找到这些酶的例子。
EP321811和EP338452公开了在烘烤面包中葡萄糖氧化酶与其它酶(巯基氧化酶、半纤维素酶、纤维素酶)结合使用。葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖氧化生成D-葡糖酸-1，5-内酯和过氧化氢。
吡喃糖氧化酶是伴随着过氧化氢的释放在C2位置催化一些单糖氧化的酶。葡萄糖以其吡喃构型易于是优选底物。然而，这种酶也能够氧化许多其它底物，例如，木糖之类的呋喃糖。葡萄糖氧化反应的产物是2-酮基-葡萄糖；木糖氧化反应的产物是2-酮基-木糖。吡喃糖氧化酶与葡萄糖氧化酶(E．C．1．1．34)明显不同。葡萄糖氧化酶是通过葡萄糖酸的伴随形成在C1位置催化葡萄糖氧化的酶。
吡喃糖氧化酶广泛存在，但尤其是存在于担子菌类真菌中。吡喃糖氧化酶已经从下列来源被确定特征和分离，例如大隔孢伏革菌(Huwig等，1994，生物技术杂志32，309-315；Huwig等，1992，Med．Fac．Landbouww，Univ．Gent 57／4a，1749-1753；Danneel等，1993，欧洲生物化学杂志214，795-802)，属于非褶菌目的属(Volc等，1985，叶片微生物学30，141-147)，Phanerochaete chrysosporium(Volc等，1991，微生物学进展156，279-301，Volc和Eriksson，1988，酶学方法161B，316-322)，Polyporuspinsitus(Ruelius等，1968，生物化学生物物理学报，167，493-500)和Bierkandera adusta和Phlebiopsis gigantea(Huwig等，1992，op，cit．)吡喃糖氧化酶在烘烤面包中的应用以前从来没有提出过。
本发明的目的是利用吡喃糖氧化酶来改良生面团和／或烘烤产品的特性。
发明的简要描述因此，本发明的第一方面涉及一种包含吡喃糖氧化酶的面包-改良和／或生面团(dough)-改良组合物。
在本文中术语“面包-改良组合物”“和”“生面团-改良组合物”意指除了所述的酶组分以外，还可以包含其它物质(常规用于烘烤中以改良生面团和／或烘烤产品的特性)的组合物。这种组合物的例子在以下给出。
如果不受任何理论的限制，目前预期，当吡喃糖氧化酶被添加到生面团(预期用来制备烘烤产品)中去时，它可能对生面团的组分发挥氧化作用，从而达到例如改善生面团和／或烘烤产品中面筋结构的强度，并且由此改善生面团的强度(除改善生面团的液流特性和处理特性外)。
更具体地说，当所说的酶伴随过氧化氢形成催化单糖(存在于面粉或生面团中)氧化时，这种氧化作用就认为实现了。
在本文中所说的术语“改良的特性”意指通过吡喃糖氧化酶的作用可以改良的所有特性。除了上面提到的增强面筋强度的作用(或作为结果)外，使用吡喃糖氧化酶可能导致增大的体积和改良的面包屑结构及烘烤产品的软度，以及提高强度，稳定性和减少生面团的粘性，于是导致提高了可加工能力。当使用劣质面粉时，对生面团的这种作用可能特别有利。这种提高的可加工能力对于工业加工的生面团特别重要。
按照本发明，通过与不添加吡喃糖氧化酶制备的生面团和／或烘烤产品相比较可以评价这种改良的特性。
第二方面，本发明涉及一种制备生面团和／或从这种生面团制备的烘烤产品的方法，该方法包括将吡喃糖氧化酶(可以存在或可以不存在于面包-改良或生面团改良组合物中)添加到生面团和／或任何生面团配料和／或任何生面团配料混合物中。
再有，本发明分别涉及用本方法生产的生面团和烘烤产品，以及包含吡喃糖氧化酶的预混物。在本文中术语“预混物”需理解为其常规的含义，例如作为烘烤剂混合物(通常包含面粉)，其不但可以用于工业生产烘烤面包的工厂，而且可以用于零售的面包店。
最后，本发明涉及吡喃糖氧化酶在制备生面团和／或烘烤产品中的用途。发明详述正如前面在本发明背景部分中提到的，已经发现吡喃糖氧化酶广泛存在，特别是在担子菌类真菌中。在本发明中使用的吡喃糖氧化酶对于发挥它的生面团和／或烘烤产品的改良能力来说，预期其来源不是关键性的。因此，在本发明生面团-改良和／或面包-改良组合物中的吡喃糖氧化酶可能有各种来源。
例如这种吡喃糖氧化酶可以来源于微生物，如真菌，例如丝状真菌或酵母菌，特别是担子菌纲真菌。这种吡喃糖氧化酶可以来源于属于蘑菇目的属，如小奥德蘑属或小菇属；属于非褶菌目的属，如栓菌属，例如Trameteshirsuta，杂色栓菌，偏肿栓菌，香栓菌，Trametes ochracea，绒毛栓菌；或者属于Phanerochate，Lenzites属或Peniophora属，并且可以是在前面发明背景部分提到的参考文献中描述的各种特定的吡喃糖氧化酶。
利用合适的技术，从正被讨论的生物体中可以得到吡喃糖氧化酶。例如，使用现有技术中已知的重组DNA技术可以得到吡喃糖氧化酶制剂。这种方法通常包括在允许这种酶表达的条件下，在培养基中培养用重组DNA载体转化的宿生细胞(其能够表达和携带编码正被讨论的吡喃糖氧化酶的DNA序列)，并从培养物中回收这种酶。所说的DNA序列可以是基因组DNA，cDNA或合成DNA来源的，或者可以是这几种DNA的任何混合物，并且可以是按照现有技术中已知的方法分离或合成的。吡喃糖氧化酶也可以从天然产生这种酶的生物体或其相关部分提取。
包含在本发明的面包-改良和／或生面团-改良组合物中的吡喃糖氧化酶可以是适合于所述用途的任何形式，例如，干粉形式或颗粒形式(特别是非粉末颗粒形式)，液体形式(特别是稳定液体形式)，或者被保护的酶形式。
例如，在US4，106，991和US4，661，452(二者都是Novo Industri A／S的专利)中公开的方法可以产生酶颗粒，并且可以选择性地用现有技术中已知的方法包覆。例如，按照已建立的方法添加营养学上可接受的稳定剂(如糖、糖醇或其它多元醇、乳酸或其它有机酸)可以稳定液态酶制剂。按照EP 238，216公开的方法可以制备被保护的酶。
正常情况下，对于预混物或面粉中的包涵来说，所说的吡喃糖氧化酶以干燥产物形式(如非粉末颗粒状)是有利的；然而，对于与液体包涵在一起来说，以液体形式是有利的。
本发明的面包-改良或生面团-改良组合物可以还包含一种或多种其它酶。其它酶的例子是纤维素酶，半纤维素酶，例如戊聚糖酶或木聚糖酶(对戊聚糖部分水解增加生面团延展性有用)，脂肪酶(对存在于生面团或生面团组合物中的脂肪的修饰，以使生面团变软有用)，其它氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，过氧化物酶(对于使面筋变软，特别是当使用硬小麦面粉时有用)，肽酶和／或淀粉酶，例如α-淀粉酶(对于用酵母菌发酵提供葡萄糖有用)。
所说的其它酶组分优选地来源于微生物，并且通过前面提到的本领域使用的常规技术可以得到。
这种面包-改良和／或生面团-改良组合物也可以包含正被讨论的吡喃糖酶(由外酶产生，该外酶可以也可以不与提高其作用的内酶组合在一起)的附加底物。这种外酶和内酶的例子包括α-淀粉酶，β-淀粉酶，麦芽糖酶，以及b-木糖酶+内-木聚糖酶和半乳糖苷酶+半乳聚糖酶的组合体。
通过使用一种或多种上面提到的外酶和／或内酶，对于兴趣吡喃糖氧化酶来说，更多的底物成为可以利用的，从而延长所说的酶活性。
对于吡喃糖氧化酶可以利用的不同碳水化合物底物的具体量依赖于许多因素，例如，用于烘烤面包的工艺，混合时间的长短，发酵，发面(proof)和／或烤焙，酵母菌的质量和／或使用的面粉，以及现有内源酶和外源酶的活性。
特别的兴趣底物是麦芽糖，已经表明它是吡喃糖氧化酶的底物(Danneel，H-J，等，1993，同上)。因为通过发酵工艺生产的麦芽糖的水平通常都很高，所以吡喃糖氧化酶对这种底物的活性在烘烤面包工艺中能够增加产生的过氧化氢的量和／或延长产生过氧化氧的时间。比较说明，麦芽糖作为其它氧化酶(如葡萄糖氧化酶)的底物的明显反应性还没有报道过。已经报道吡喃糖氧化酶对D-葡糖酸-1，5-内酯表现出明显的活性(参见，Olsson和Mandenius，1991，酶与微生物技术13 755-759；Ruelius等，1968，同上)，借助葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖可以生成D-葡糖酸-1，5-内酯。因此结果是，当吡喃糖氧化酶与葡萄糖氧化酶结合在一起时，对前者有更多的可以利用的底物，因而延长吡喃糖氧化酶的活性和增加产生的过氧化氢的总量。
市售的酶在这种方法中能够增加吡喃糖酶的活性，这些市售的酶包括Novamyl(一种来自Novo NordiskA／S的市售的麦芽糖α-淀粉酶)；抗腐剂StalingaseTM(可以从Gist-brocades N．V．获得)；Grindamyl MaxlifeTM和GrindamylTM系列产品的其它产品(来自Grindsted Products A／S)；VeronTM系列产品的酶产品(来自Rhm GmbH)；β-淀粉酶(得自植物，如黄豆，小麦和大麦)，市售的β-淀粉酶(如来自Genencor Inc．的Nagase和Speezyme)。
除了其它酶组分以外(或作为一种选择)，这种生面团-改良和／或面包-改良组合物可以包括一种通常使用的烘烤剂，例如，一种或多种下面的组分奶粉(提供面包皮颜色)，面筋(改良劣质面粉的气体保持力)，乳化剂(提高生面团的延展性和在某种程度上改良最后的面包的坚固性)，颗粒脂肪(与面包的软度和坚固性有关)，氧化剂(用于增强面筋的结构；例如抗坏血酸、溴酸钾、碘酸钾或过硫酸铵)，氨基酸(如半胱氨酸)，糖和盐(例如使生面团变硬一些的氯化钠、乙酸钙、硫酸钠或硫酸钙)，面粉或淀粉。
合适的乳化剂的例子是甘油单酯或甘油二酯、甘油单酯或甘油二酯的二乙酰酒石酸酯、脂肪酸糖酯、脂肪酸多聚甘油酯、甘油单酯乳酸酯、甘油单酯乙酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、磷脂和卵磷脂。
本发明的面包-改良和／或生面团-改良组合物典型地以相当于0．01-5％的量(特别是以0．1-3％的量)包括在生面团中。
按照本发明的方法，其中的吡喃糖氧化酶被用于制备生面团和／或烘烤产品，这种酶本身被添加到生面团的原料的配料混合物中。此外，吡喃糖氧化酶可以作为上述的生面团-改良和／或面包-改良组合物的一种组分而被添加。
吡喃糖氧化酶必须以足以提供所需的作用(例如，正被讨论的改良特性)的量使用。因此，在本发明方法中使用的酶的量应该适合于正被讨论的生面团的性质和组成以及使用的吡喃糖氧化酶的性质。一般地，这种酶制剂以相当于每kg面粉0．01-1000mg酶蛋白的量添加，优选地，每kg面粉0．1-100mg酶蛋白，更优选地，每kg面粉0．1-10mg酶蛋白，最优选地，每kg面粉1-5mg酶蛋白。
就酶活性面言，为了发挥生面团和／或烘烤产品的合乎需要的改良作用，给定的吡喃糖氧化酶的合适用量将依赖于正被讨论的酶和酶底物。技术人员基于本领域已知的方法可以确定出合适的酶单位用量。
按照本发明的方法，当添加一种或多种其它活性酶时，作为本发明的面包-改良和／或生面团-改良组合物可有可无的组分，这些活性酶可以单独地或与吡喃糖氧化酶制剂一起添加。其它活性酶可以是上述酶的任何一种，并且可以按照完善的烘烤实施方案确定用量。
类似地，按照本发明的方法，当添加吡喃糖氧化酶底物时，作为本发明的面包-改良和／或生面团-改良组合物可有可无的组分，这种底物可以单独地或与吡喃糖氧化酶制剂一起添加。
正如上面提到的，吡喃糖氧化酶被添加到生面团配料的任何混合物中、生面团中、以及包含在生面团中的任何配料中去。换句话说，合适时在生面团制备的任何步骤中都可以添加吡喃糖氧化酶并且可以一步、两步或更多步添加。
对于正被讨论的生面团和／或烘烤产品的处理都可以用任何合适的方法进行，典型的步骤包括揉捏生面团，将生面团进行一次或多次发面处理，在合适的条件(即合适的温度、充足的时间)下烘烤产品。例如，使用普通的直接生面团工艺、捏塑生面团工艺、过夜生面团工艺、低温长时间发酵工艺、冰冻生面团工艺、Chorleywood Bread工艺或Sponge和Dough工艺可以制备生面团。
按照本发明的方法制备的生面团和／或烘烤产品一般是以小麦粉或面粉为原料，并且可以也可以不与其它类型的粗粉或面粉组合在一起，如玉米粉、黑麦粗粉、黑麦面粉、燕麦面粉或粗粉、大豆粉、高梁粗粉或细粉或土豆粗粉或细粉。
在本文中，术语“烘烤产品”意指包括用生面团制备的各种产品，要么是柔软的，要么是松脆的。可以通过本发明有利地进行生产的烘烤产品(或者是白色，浅色类型，或者是深色类型)的例子是面包(特别是白色的全麦面包或黑面包)，典型的是圆锥形面包或面包卷，法国baguette型面包，pita面包，tacos，蛋糕，锅饼，饼干，松脆面包和同类的烘烤产品。
本发明的生面团可以是前文讨论过的任何类型，并且可以是新鲜的或冰冻的。
从下面的公开明显地可以看出，本发明的生面团一般是已发酵过的生面团或正在发酵的生面团。可以采用不同方式发酵生面团，例如添加碳酸氢钠或同类物，或者添加发酵剂(正发酵的生面团)，但是，优选的是添加合适的酵母菌培养物(例如酿酒酵母(面包酵母)的培养物)发酵生面团。可以采用任何市售的酿酒酵母菌株。
正如上文提到的，本发明还涉及生面团和／或由生面团生产的烘烤产品的预混物(如以面粉组合物形式)，其中所说的预混物包含吡喃糖氧化酶。通过将吡喃糖氧化酶制剂或本发明的包含吡喃糖氧化酶的面包-改良和／或生面团-改良组合物与合适的载体(如面粉、淀粉、糖或盐)混合可以制备预混物。预混物可以包含其它面包-改良和／或生面团-改良添加剂，例如包含前面提到的任何添加剂，包括酶。
本发明另一方面涉及吡喃糖酶在改良生面团和／或以生面团生产的烘烤产品的特性上的用途。前文详细描述了这种类型的吡喃糖氧化酶以及可以被使用的这种方式。
本发明最后涉及吡喃糖氧化酶在制备生面团(pasta)(优选的是从硬质小麦面粉或以类似质量的面粉制备的生面团)上的用途。通过使用常规的技术和上述同等用量的吡喃糖氧化酶可以制备这种生面团。吡喃糖氧化酶可以有上述的各种类型。人们期望，当在生面团的制备中使用时，吡喃糖氧化酶导致面筋结构加强，生面团粘性减少和生面团强度提高。
附图简要描述参照附图进一步阐述本发明，其中

图1显示了包含吡喃糖氧化酶的生面团和不包含这种酶的参照生面团的面筋中的动态剪切贮存模量G’；和图2显示了图1限定的两种生面团的面筋中的粘弹性相角δ。材料与方法吡喃糖氧化酶活性的测定利用下面的比色分析法测定吡喃糖氧化酶的活性。吡喃糖氧化酶在氧存在下氧化D-葡萄糖为D-阿拉伯-2-己酮糖(2-酮基-D-葡萄糖，D-葡萄糖酮)，结果产生过氧化氢。生成的过氧化氢在过氧化物酶存在下氧化ABTS(2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯))。经过固定反应时间后在418m处测定形成的蓝绿色的吸光度，其测定值是过氧化氢量的函数。
将180微升底物(在50mM磷酸盐缓冲液(pH6．0)和0．05％吐温20中的50mM葡萄糖)添加到20微升酶的稀释液中，于30℃下温育反应混合物20分钟。移去100微升这样的反应混合物，并添加到在0．2M磷酸盐缓冲液(pH7．0)中的0．65mM ABTS(2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯)中，向所说的缓冲液中加入过量的过氧化物酶。1分钟后，在615nm测定吸收值。线性范围内的酶活性从来源于过氧化氢稀释的标准曲线计算。用UNITS(U)表示吡喃糖氧化酶的活性，其中1U是指在标准条件下每分钟生成1微摩尔过氧化氢所需要的吡喃糖氧化酶的量。
可以使用其它单糖(例如，如木糖一类的吡喃糖)来代替葡萄糖。生面团和面包试验按照本发明，使用下面的方法在生面团和面包中可以试验添加的吡喃糖氧化酶的作用。
配方水 60％小麦面粉100％酵母菌 4％盐 1．5％糖 1．5％小麦面粉得自Meneba 964型小麦。
面包的制备步骤1．混合生面团(螺旋形混合机)在700RPM下混合3分钟在1400RPM下混合8分钟由熟练的面包师来确定和调整混合时间，使得在使用的试验条件下得到最适的生面团稠度。
2．第一步发面30℃-80％RH，20分钟；3．过秤，并使其具有一定形状；4．最后一步发面32℃-80％RH，40分钟；5．焙烤225℃，面包卷，20分钟；圆锥形面包，30分钟。
生面团和烘烤产品的评估生面团和烘烤产品可以通过如下的方法评估面包的比体积利用传统的油菜籽方法测量四个面包体积的平均值。按照每克面包的体积(ml)来计算比体积。参照物(没有酶)的比体积定义为100。相对比体积指数的计算如下比体积指数=四个面包的比体积／四个参照面包的比体积×100按照下列尺度可以目视评估生面团的粘度和面包屑的结构生面团粘度几乎是液体1太粘 2粘3一般 4干5面包屑结构很差 1差2不均一3均一／好 4很好 5冲击试验第二次发面后，使装生面团的容器从20cm高的地方落下来。焙烤生面团和测定最后面包的体积。
面筋的增强通过动力液流测量法可以测量在小麦面粉生面团或面筋生面团中特定生面团调节剂的增强作用。这些测量方法能够在摆动下显示出生面团的强度。小麦面粉生面团和面筋生面团都是粘弹性物质。在摆动测量法中，小麦面粉生面团和面筋生面团的粘弹特性能够被分成两部分，动态剪切贮存模量G’和动态剪切丢失模量G”。丢失模量和贮存模量的比率在数值上等于粘弹性相角δ(Delta)的正切值。贮存模量G’的增加和相角δ的减小表明有更强和更多的弹性生面团。
利用Bohlin流变仪系统测量动态剪切贮存模量G’和粘弹性相角δ。然后比较用从Trametes hirsuta得到的吡喃糖氧化酶(以8U/kg面粉的剂量)处理过的生面团的面筋和没有用酶处理过的参照生面团。在混合生面团之前，将酶添加到面粉中去。面粉生面团在32℃下温育11／2小时后，从包含有所说的调节剂的面粉生面团中洗出面筋。图1和2描述了试验的结果。
正如图1所显示的，惊奇地发现，包含吡喃糖氧化酶的生面团贮存模量(G’)明显地高于参照生面团。因此，这个结果表明，通过所说的酶的作用明显地加强了面筋并由此加强了生面团。
图2显示当吡喃糖氧化酶存在时，处理过的生面团的粘弹性相角(δ)明显地低于参照生面团，这表明通过所说的酶的作用其面筋具有更大的弹性流变特性，并且由此也使得这种生面团的弹性流变特性更大。
权利要求
1．一种包含吡喃糖氧化酶的面包-改良或生面团-改良组合物。
2．按照权利要求1的面包-改良或生面团-改良组合物，其中所说的吡喃糖氧化酶是微生物来源的。
3．按照权利要求2的面包-改良或生面团-改良组合物，其中所说的吡喃糖氧化酶是真菌来源的，特别是担子菌类真菌来源的。
4．按照权利要求3的面包-改良或生面团-改良组合物，其中所说的吡喃糖氧化酶来自属于非褶菌目(Aphyllophorales)的属，例如栓菌属(Trametes)。
5．按照权利要求1的面包-改良或生面团-改良组合物，该组合物还包含其它酶，例如纤维素酶、半纤维素酶、戊聚糖酶、脂肪酶、过氧化物酶、蛋白酶、氧化酶、肽酶和／或淀粉酶。
6．按照权利要求1的面包-改良或生面团-改良组合物，该组合物还包含其它面包或生面团-改良剂。
7．一种制备生面团和／或从这种生面团制备的烘烤产品的方法，该方法包括将吡喃糖氧化酶添加到生面团和／或任何生面团配料和／或任何生面团配料混合物中。
8．按照权利要求7的方法，其中所说的吡喃糖氧化酶存在于权利要求1-7所限定的面包-改良或生面团-改良组合物中。
9．按照权利要求7或8的方法，其中以相当于每千克面粉0．01-1000毫克酶蛋白的量添加所说的吡喃糖氧化酶。
10．按照权利要求7的方法，其中将所说的其它酶或其它面包改良和／或生面团-改良剂添加到所说的生面团，任何生面团配料和／或任何生面团配料混合物中。
11．一种用按照权利要求7-10之任一的方法制备的生面团或从生面团制备的烘烤产品。
12．一种生面团预混物，其包含吡喃糖氧化酶或按照权利要求1-7之任一的生面团-改良组合物。
13．吡喃糖氧化酶作为生面团-改良或面包-改良剂的用途。
14．吡喃糖氧化酶在制备生面团中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种包含吡喃糖氧化酶的生面团或面包－改良组合物以及该组合物在制备生面团和烘烤产品上的用途。
文档编号A21D8/02GK1205614SQ96199200
公开日1999年1月20日 申请日期1996年12月20日 优先权日1995年12月20日
发明者P·瓦格内, J·Q·斯 申请人:诺沃挪第克公司