专利名称：突变单加氧酶细胞色素P450cam的制作方法
技术领域：
本发明涉及单加氧酶细胞色素P450cam的突变体。
单加氧酶用氧催化激活的和未激活的碳-氢键发生选择性氧化作用1，因此在有机合成中有很大用途。但是，由于很难分离足够量的单加氧酶和/或相关的电子转移蛋白而使该领域的发展受到阻碍。尽管得到了150多种不同细胞色素P-450单加氧酶的氨基酸序列，但是迄今为止只知其中3种的结构2,3,4，而且在细菌系统中尚未很成功地过度表达5。
一种细胞色素P-450单加氧酶是可溶性的，而且可以足够的量表达出来，它是来自P.putida的高度特异性的P-450cam，可催化樟脑的区域选择性和立体选择性羟基化反应而生成5-外型羟基樟脑6。已确定了P-450cam的高分辨晶体结构2，由于认为该细菌酶的作用机制与其哺乳动物对应物的相似，因此，用其作为哺乳动物酶的结构模型的框架。
已经描述了P-450cam的核苷酸序列和相应的氨基酸序列5,7。该酶活性位点的位置是已知的，而且已研究了结构-功能之间的关系8,9。已描述了在101和185、247以及2959,10,11和87位12的P-450cam突变体。还描述了酪氨酸96(Y96)变成苯丙氨酸96的突变体(Y96F)11,13,14,15。但在所有情况下，文献只报道了突变对分子氧化反应的影响，所述分子是已确定的野生型酶的底物。而没有说明如何利用该突变作用来提供用于不同新底物氧化作用的生物催化剂。
为了开发新的生物催化剂，我们开始了目的在于再设计P-450cam的项目，以便该酶可更有效地特异性氧化有机分子，而不论所述分子是否是野生型蛋白质的底物。
如
图1所示，P-450cam的三维结构表明活性位点提供与樟脑的疏水基团以紧密范德华力接触。特别重要的是樟脑与亮氨酸244、缬氨酸247和缬氨酸295侧链之间的接触。三个芳香族残基(Y96、F87和F98)归类在一起，排列成底物结合穴，同时酪氨酸96与樟脑羰基氧之间的氢键使底物保持正确的方向，以确保反应的区域特异性和立体特异性。
Lipscomb和同事16在1978年证明野生型P-450cam有二聚的倾向，但他们也报道了单体和二聚体对樟脑氧化作用的催化活性没什么差别。由于二聚反应可由硫还原剂逆转，因此他们得出结论有分子间半胱氨酸二硫键(S-S)形成所致。他们不能确定二聚作用中是否每个P-450cam分子涉及1个以上的半胱氨酸。由于那时既不知道P-450cam的氨基酸序列，也不清楚其晶体结构，因此他们无法确定与该反应有关的关键半胱氨酸残基(一个或多个)。
我们利用分子模型设计来研究对活性位点穴中3个芳香族残基(Y96、F87、F98)点突变的可能影响。我们注意到用较小的、疏水非芳香族侧链残基取代这些芳香族残基中的任何残基，均可产生可用于结合更多疏水底物的“芳香族穴”。用程序GRID17计算芳香族探针与细菌色素P-450cam可能的突变体之间的作用能，在所述突变体中，将这些残基变成了丙氨酸(F87A、Y96A和F98A)。然后用分子模型程序包Quanta18图解检测结果。
在接近芳香族探针的活性位点穴内，突变体F98A的结合相互作用似乎最强，而Y96A稍弱，且F87A相当小。在第一种情况下，将酪氨酸96突变为丙氨酸，因为它更接近结合穴的中心，而苯丙氨酸98在穴的一侧。另外，由于失去了结合底物的氢，因此酪氨酸96的除去会降低该酶对樟脑的特异性。
本发明的一个方面是提供单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中除去了334位的半胱氨酸残基。
优选所述除去是用除半胱氨酸以外的另一种氨基酸取代半胱氨酸残基。
另外，所述除去是从该酶中删除整个半胱氨酸334残基。
将突变体96位的酪氨酸残基适宜地用除酪氨酸以外的任何氨基酸残基取代。
所述氨基酸通常选自下列任何一种丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，其中例外情况是在334位是半胱氨酸时，所述氨基酸不得是半胱氨酸，而在96位是酪氨酸的情况下，所述氨基酸不得是酪氨酸。
优选在位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396的一个或多个氨基酸残基由另一氨基酸残基取代。
我们用模型设计程序Quanta从公开的结晶原子配位资料分析了得到的P-450cam的结构。我们确定有5个靠近P-450cam表面的半胱氨酸(半胱氨酸58、85、136、148、334)可能参与了导致蛋白质二聚作用的分子间二硫键的形成。我们进行定点诱变以便将这些半胱氨酸均以丙氨酸取代，由此得到5个Cys-Ala表面突变体。
研究野生型P-450cam以及5个Cya-Ala表面突变体中蛋白质二聚的程度。可通过在Resource Q柱(Pharmacia)上的阴离子交换快速蛋白质液相色谱和在Superose 12柱(Pharmacia)上的凝集过滤大小排斥色谱检测野生型P-450cam和C58A、C85A、C136A和C148A突变体中的二聚体。另一方面，对于334A突变体来说，甚至在高浓度(0.1mM左右)也没有检测到二聚体(参见图2中的数据)。我们得出结论，野生型P-450cam通过两个蛋白质分子间表面的半胱氨酸334的分子间形成S-S二硫键进行二聚作用。
C334A突变明显有利于除去不想要的蛋白质二聚作用，由此确保在任何时候溶液中均只存在单一物种。另外，我们还发现了该突变有完全意想不到的好处。象所有蛋白质一样，野生型P-450cam在放置后有聚集现象。蛋白质聚集的原因尚不清楚，但P-450cam聚集物是不可溶的，而且没有催化活性。在4℃，甚至在-20℃50％甘油溶液中贮存后，野生型和C58A、C85A、C136A和C148A突变体均有二聚作用和聚集现象。在转换过程中，特别是在任何有经济前途的工业应用，如合成有机分子所需的较高P-450cam浓度不会发生聚集作用。而C334A突变体甚至在室温下以mM浓度，3天内也没有聚集的迹象。因此，C334A突变在蛋白质加工、贮存以及提高催化剂半衰期方面有积极的效果。
我们相信在96位的突变是关键，这使得该突变酶能够催化相当宽范围内有机底物的氧化作用。也可突变邻近所述酶活性位点的其它氨基酸，以便改变活性位点的形状和特异性。这些其它氨基酸包括在位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396的氨基酸。设想这些位置的一个或多个氨基酸可进行下列置换用小的疏水氨基酸以便扩大活性位点；或用大的疏水氨基酸以便缩小活性位点的大小；或用带芳香环的氨基酸，所述芳香环会与底物的相应芳香环相互作用。
就氧化反应而言，反应条件在所附参考文献中有所介绍。所述酶系统除突变体酶外，通常还包括假单胞氧还蛋白和假单胞氧还蛋白还原酶，以及作为辅助因子的NADH。在下列试验部分描述了环己基苯的氧化作用。下面研究并描述了各种类型的有机化合物。我们注意到野生型P-450cam对以下部分中的许多分子的氧化作用均有活性。但是在所有情况下，突变体P-450cam蛋白质均有高得多的转换活性。ⅰ)有机化合物是芳香化合物，是在不使酶失活或变性的条件下使用的烃或化合物。由于所述突变作用是以在酶的活性位点产生结合芳香族的穴为目的，因此突变体酶能够催化各种各样芳香族化合物的氧化。在下文试验部分举例证明了芳香族和多芳香族化合物的氧化作用，而且很令人意想不到的是，已指出野生型酶只能催化樟脑家族成员的氧化，而对其它一些分子如苯乙烯19、乙苯9,10、四氢萘酮衍生物20和烟碱21的活性低。ⅱ)有机化合物是例如脂族或脂环族的、带有功能基团的烃(见反应方案1)。在氧化反应前，将芳香族保护基与功能基团相连，在氧化反应后，将其从功能基团上除去。适宜的芳香族基团是苄基。保护基有两个目的第一，它可以使底物更疏水，从而提高与疏水酶穴的结合；第二，它有助于使底物固定在活性位点。因此，通过使用正确的芳香族保护基，可同时实现底物的区域选择性和立体选择性羟基化反应。单功能基化烃的实例是环己基、环戊基和烷基衍生物(反应方案1)。这些化合物的氧化产物是很有价值的有机合成原料，特别是用于同手型化合物生产。可使用许多芳香族保护基，如苄基或萘基醚和苯甲酰醚和酰胺(反应方案1)。用苯并噁唑基作为羧基保护基，用N-苄基噁唑烷基作为醛保护基也在研究之列。在酶促氧化作用后，很容易裂解这两种基团，而且以前在有关醛和酸的微生物氧化的文献22中已有描述。ⅲ)有机化合物是C4至C22的脂族或脂环族烃。在下文试验部分说明了环己烷和直链以及支链烃的氧化。我们发现野生型P-450cam也能够氧化这些分子，但活性低，而在所有情况下，突变体的活性都更高。ⅳ)有机化合物是卤代的脂族或脂环族烃。下文还描述了高丙体六六六(六氯环己烷)的氧化。
构建突变体，其中活性位点取代与334位半胱氨酸表面突变为丙氨酸相结合，并包括代替96位酪氨酸(Y96)的丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸。最后将数个活性位点突变与表面突变结合起来以构建带有多个突变的突变体酶。用聚合酶链反应(PCR)，从P.Putida的总细胞DNA扩增编码细胞色素P-450cam及其天然电子转移配对物假单胞氧还蛋白和假单胞氧还蛋白还原酶的基因。所用的表达载体/大肠杆菌宿主组合是用于P-450cam的菌株JM109中的pRH109123，用于假单胞氧还蛋白的菌株JM109中的pUC118，以及用于假单胞氧还蛋白还原酶的菌株DH5中的pGLW11。用Zoller和Smith的方法24，用M13 mp19亚克隆进行寡核酸指导的点特异性诱变，用Kunkel的方法25完成突变体的筛选。
用分光光谱法研究可能的底物结合。在没有底物的情况下，野生型酶是6-配位的低自旋形式，弱结合水占据了第六个配位位点，在418nm有特征性的索瑞(Soret)最大峰。与樟脑以及底物类似物金刚烷酮、金刚烷和降冰片烷的结合将血红素完全转变为5配位的高自旋形式，该形式在392nm有特征性的索瑞谱带。血红素的这种自旋状态的改变伴有血红素还原电位的增加，从而使生理电子转移配对物假单胞氧还蛋白能够还原P-450cam并引发催化羟基化循环26。因此，血红素自旋状态的改变，可以定性的表示表1和2所示分子被野生型和突变型体P450cam酶氧化的可能性。
在30℃，将通常为3ml的含10μM假单胞氧还蛋白、2μM假单胞氧还蛋白还原酶、1μM细胞色素P-450cam单加氧酶(野生型或突变体)、200mM KCl、50μg/ml牛肝过氧化氢酶(Sigma)以及1mM靶有机化合物，如环己基苯(作为0.1M乙醇储备液加入)的缓冲液(50mM Tris.HCl,pH7.4)预保温5分钟。通过加入NADH达到2mM的总浓度，来启动酶促反应。再将4等份NADH(每次将NADH的浓度提高1mM)以10分钟间隔，于30分钟内加入到保温液中，同时加入一等份底物(提高浓度1mM)。在60分钟后，通过加入0.5ml氯仿并旋转混合物来骤熄反应。4℃离心(4000g)进行相分离。用气相色谱分析氯仿层。
对于许多底物化合物，如环己基苯，由于并不是所有的P-450cam介导的氧化产物都是可以购买到的，因此在氮气流下，将氯仿提取物蒸发至干，用己烷提取残留物，用高效液相色谱分离这些氧化产物，用己烷/异丙醇梯度洗脱。然后用质谱，特别是核磁共振光谱鉴定纯化的产物。
对于在含水缓冲液中有不同溶解度的不同底物来说，加入到保温混合物中的底物的最终浓度可以为0.2mM至0.4mM。可在340nm监测NADH浓度，而且在所有情况下，均是在保温过程中加入更多底物和NADH。
用上述试验技术，本发明人研究了相当多的可作为野生型P-450cam和突变体Y96A之底物的有机化合物。研究工作还包括命名为Y96V、Y96L、Y96F、C334A的突变体；组合突变体F87A-Y96G-F193A,和组合活性位点与表面突变体的Y96A-C334A；Y96V-C334A；Y96L-C334A；Y96F-C334A；F87A-Y96G-F193A-C334A。C334A和C334A-Y96A的结果列于表1和表2，在表中将结构上相关的分子归类在一起。
表1详细说明了突变体Y96A-C334A在氧化小的直链、支链和环状烃时，NADH的消耗。表2(a)至2(h)详细描述了到目前为止已阐明的突变体和底物组合所得产物分布。
可用任何熟知的、可自由得到的标准限制性技术使位置334上的半胱氨酸缺失，因此本文不再作详述。反应方案1
表1K2pp(μM)aWTY96A
a使用Sligar法(S.G.Sligar,Biochemistry,1976,15,5399-5406)，两次独立测定的平均值。Kapp值与缓冲液中K+浓度完全无关。当〔K+〕＞150mM时，就野生型和Y96A而言，对樟脑的Kapp均为0.6μM。该表数据于磷酸盐缓冲液中(pH7.4)，在〔K+〕=70mM时测定，以避免较高离子浓度下底物产生盐析。b未达饱和。
表2(a)
表2(b)
表2(c)
表2(d)
表2(e)
表2(f)
表2(g)
表2(h)
表3由P450cam突变体催化的小烷烃的转变下列所有突变体均含有C334A突变。用NADH消耗率(nmol NADH/nmol P450cam/s)表示转变率。<
>用P450cam活性位点突变体氧化底物后的产物结构和分布。
“本底”一般本底NADH氧化率是0.07nmol NADH(nmol P450cam)-1秒-1。
表4(a)用P450cam活性位点突变体氧化底物后的产物结构和分布。下列所有突变体均含有C334A突变。
表4(b)
表4(c)
表4(d)
表4(e)
表4(f)
表4(g)
表4(h)<
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权利要求
1．单加氧酶细胞色素P-450cam的突变体，其中除去了位置334上的半胱氨酸残基。
2．根据权利要求1的突变体，其中所述除去是用除半胱氨酸以外的另一种氨基酸取代半胱氨酸残基。
3．根据权利要求1的突变体，其中所述除去是所述酶中使整个的半胱氨酸334残基缺失。
4．根据前述任一权利要求的突变体，其中用除酪氨酸以外的任何其它氨基酸取代突变体中96位上的酪氨酸残基。
5．根据权利要求1、2或4的突变体，其中所述氨基酸选自下列任一氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷胺酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
6．根据前述任一权利要求的突变体，其中用另一氨基酸残基取代位置87、98、101、185、193、244、247、295、297、395和396上任一或多个氨基酸残基。
7．实质上如本文前面附图和/或实施例所述的单加氧酶细胞色素P-450cam突变体。
全文摘要
单加氧酶细胞色素P450cam的突变体,其中除去了334位的半胱氨酸残基。
文档编号C12N9/02GK1212015SQ9619923
公开日1999年3月24日 申请日期1996年11月1日 优先权日1995年11月1日
发明者L·L·王, S·L·弗利施, D·P·尼克尔森, A·J·哈特 申请人:Bg公开有限公司