专利名称：重组仙台病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组仙台病毒及其制备方法。
仙台病毒也被命名为日本血凝病毒(HVJ)，分类到I型副流感病毒中，属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的副粘病毒(Paramyxovirus)属。
仙台病毒颗是多形的，其具有包装在直径为150-200nm的被膜中的无作为翻译模板功能的基因组RNA(下文称为“负链RNA”)。在历史上，仙台病毒也曾被看作是一种工业用病毒，通过利用病毒细胞融合能力而被广泛使用，特别是用于生产异核体和杂交细胞。并且曾研制细胞融合脂质体来作为用于基因治疗的载体。此外，仙台病毒也被用作各种干扰素的诱导物。
根据基于基因组核酸的核型的分类，仙台病毒属于RNA病毒中的负链RNA病毒的负的单链RNA病毒这一类。RNA病毒被分成三类，dsRNA病毒(双链RNA病毒)、正链RNA病毒和负链RNA病毒。dsRNA病毒类包括呼肠孤病毒、轮状病毒、phytoreovirus等，且具有分节段的多个丝状dsRNA基因组。正链RNA病毒包括脊髓灰质炎病毒、新培斯病毒、Semliki forest病毒以及日本乙型脑炎病毒，其具有作为基因组的单条正义RNA。基因组RNA可起到mRNA的作用，并且能够产生RNA复制和依赖于宿主细胞的翻译作用的颗粒形成所需的蛋白。换句话说，正链RNA病毒的基因组RNA本身能够传播。本说明书中，“传播能力”是指“形成感染颗粒或其相当的复合体并在核酸通过感染或人工技术转移至宿主细胞并且在所述核酸在细胞内复制以后继续将其传播至其他细胞的能力。归入正链RNA病毒的新培斯病毒和归入负链RNA病毒的仙台病毒均有感染性和传播能力。另一方面，归入细小病毒种的腺伴随病毒具有感染性但无传播能力(病毒颗粒形成需要腺病毒的混合感染)。而且，来自体外人工转录的新培斯病毒的正链RNA是传播性的(在转染到细胞中时形成感染病毒颗粒)。相反，体外人工转录的仙台病毒RNA，不仅其负链而且其正链都不是传播性的(在转染到细胞中时形成不感染的病毒颗粒)。
近来，已将病毒载体用作基因治疗的载体。为了将其用作基因治疗的载体，必需建立起用于重建病毒颗粒的技术。(“病毒颗粒的重建”是指病毒基因组核酸的人工形成以及原或重组病毒在体外或胞内的产生)。这是因为，为了将外源基因转移至病毒载体，应该从病毒基因组和通过基因操作整合的外源基因重建病毒颗粒。一经建立起病毒重建技术，就可以产生携带目的外源基因或用缺失的或灭活的目的基因的病毒。
并且，一经建立起病毒重建体系，而且病毒基因操作成为可能，所述体系就似乎成了用于从遗传上分析病毒功能的有力工具。从医学上的疾病等的预防和治疗的观点看来，病毒功能的遗传分析是很重要的。例如，如果通过利用病毒代谢和宿主-细胞代谢之间的差异，阐明病毒核酸的复制机制，可以研制作用于病毒核酸复制过程且对宿主细胞损伤更小的杀病毒剂。通过阐明病毒基因编码的蛋白的功能，也可以研制出针对与病毒感染力和颗粒形成有关的蛋白的抗病毒药物。此外，通过修饰涉及膜融合的基因并制备具有高度的膜融合能力的脂质体，可以将其用作基因治疗的载体。又及，正如由干扰素所表现的那样，病毒感染可能诱导宿主基因激活来抗病毒，导致宿主的抗病毒性增加。病毒功能的遗传分析可以就宿主基因的激活提供更多重要的信息。
具有作为基因组核酸的DNA的DNA病毒的重建已进行了一些时间，并且可以通过导入纯化的基因组本身，如将猴病毒(SV 40)导入猴细胞中来进行[“实验细胞研究杂志”(J.Exp.Cell Res.)，43，415-425(1983)]。由于基因组RNA也起着mRNA的作用，已通过正链RNA病毒进行含有RNA基因组的RNA病毒的重建。例如，在脊髓灰质炎病毒的情况下，1959年已证实纯化基因组RNA本身的传播能力[“实验医学杂志”(Journal of ExperimentalMedicine)，110，65-89(1959)]。后来，达到了通过利用宿主细胞的依赖于DNA的RNA聚合酶的活性将克隆的cDNA导入宿主细胞来重组Semlikiforest病毒(SFV)[“病毒学杂志”(Journal of Virology)，65，4107-4113(1991)]。
而且，利用这些病毒重建技术，已研制出基因治疗的载体[“生物技术”(Bio/Technology)，11，916-920(1993)；“核酸研究”(Nucleic Acids Research)，23，1495-1501(1995)；“人类基因治疗”(Human Gene Therapy)，6，1161-1167(1995)；“细胞生物学方法”(Methods in Cell Biology)，43，43-53(1994)；“细胞生物学方法”，43，55-78(1994)]。
但是，如以上所述，虽然仙台病毒有很多成为工业用病毒的优点，还未建立起重建体系，因为其是负链RNA。这是由于通过病毒的克隆cDNA重建病毒颗粒有相当大的难度。
如上所述，已清楚地说明仅仅导入负链RNA病毒(vRNA)的RNA或其互补RNA链(cRNA)至宿主细胞不支持负链RNA病毒的增殖。这与正链RNA病毒的情况完全不同。虽然在Tokkai H4-211377中公开了“用于制备相应于负链RNA病毒基因组的cDNA和感染的负链RNA病毒的方法”，后来发现描述于“欧洲分子生物学联合会杂志”(EMBO.J.)9，379-384(1990)中的所述文件的全部实验不能再现，因而作者本人不得不撤回所有的文章内容[见EMBO.J.，10，3558(1991)]。因此，显然Tokkai H4-211377中所述的技术与本发明的有关领域不一致。已报导了用于流感病毒的负链RNA病毒重建体系[“微生物学年评”(Annu.Rev.Microbiolo.)，47，765-790(1993)；“当今遗传学和发育学观点”(Curr.Opin.Genet.Dev.)，2，77-81(1992)]。流感病毒是具有8个分节段基因组的负链RNA病毒。根据这些文献，首先将外源基因插入到一个所述基因组节段的cDNA中，并且随后把由含外源基因的所有8个节段的cDNA转录的RNA和来自病毒的NP蛋白装配成核糖核蛋白(RNP)。然后，通过向宿主细胞提供RNP和依赖于RNA的RNA聚合酶来达到重建病毒。后来，又报导了属于弹状病毒科的狂犬病毒的负的单链RNA病毒的重建[“病毒学杂志”(J.Virol.)，68，713-719(1994)]。
因而，虽然从根本上说来公众已知道重建负链病毒的技术，但就仙台病毒的情况而言，直接应用这些技术不支持病毒的重建。而且，就弹状病毒报导的病毒颗粒的重建仅仅是通过标记基因、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等来证实的。此外，产物不能满足实际运用。另外，为提供病毒在宿主细胞中重建所需的因子，一般将诸如野生型病毒、重组痘苗病毒等辅助病毒与待重建的病毒的核酸一起导入宿主细胞中。因此，从那些有害病毒分离重建的目的病毒的难度提出了一个难题。
本发明的目的是建立一个有效的重建仙台病毒体系，使仙台病毒能进行基因操作并提供足以用于基因治疗等领域的仙台病毒载体。
为运用到仙台病毒的重建试验，本发明人首次用源自仙台病毒缺损干扰(DI)颗粒[参考EMBO.J.，10，3079-3085(1991)中的缺损干扰颗粒]的cDNA或仙台病毒的小基因组进行了各种研究。结果，他们发现了有关待导入宿主细胞的物质，包括cDNA、涉及转录和复制的cDNA以及提供T7RNA聚合酶表达单位的重组痘苗病毒之间的重量比的有效条件。此外，本发明人获得了正链和负链的全长cDNA，构建了诱导仙台病毒的正或负链RNA的细胞内生物合成的质粒，并将所述质粒转移到表达涉及转录和复制的cDNA的宿主细胞。结果，他们成功地从仙台病毒颗粒的cDNA重建了仙台病毒颗粒。本发明人还首次发现，对于有效重建病毒颗粒，环形的导入宿主细胞的cDNA比链形的更为优选，并且在高度成功地重建病毒颗粒的细胞内转录方面，正链RNA优于负链RNA。
另外，本发明发现即使不用重组痘苗病毒作为T7RNA聚合酶表达单元，也可能重建仙台病毒。即，在体外转录的仙台病毒的全长RNA被转移至细胞中且编码用于初转录和复制的酶的cDNA在T7启动子的控制下转录时，重建病毒颗粒。这表明，如果建立起表达初转录和复制所需的所有酶的细胞，可以完全不用诸如痘苗病毒的辅助病毒来产生重组的仙台病毒。由于已描述表达初转录和复制所需的所有酶的细胞[“病毒学杂志”(J.Virology)68，8413-8417(1994)]，本领域的那些熟练技术人员能够参考所述文章制成这样的细胞。所述参考中描述的细胞是染色体上携带仙台病毒基因的三种基因如NP，P/C和L并表达由这三种基因NP，P/C和L编码的蛋白的293细胞系的一种衍生型。
如果能够从核酸有效重建病毒颗粒，显然由多例病毒载体本领域中的那些熟练技术人员能够容易地替换所需的基因、插入外源基因或灭活或缺失目的病毒基因。即，对于本领域的那些熟练技术人员来说，显然通过本发明在重建仙台病毒颗粒方面的首次成功已使仙台病毒的基因操作成为可能。
即，本发明包括下列内容1.一种重组的仙台病毒，其具有带有插入的目的外源基因或缺失或灭活的目的基因的基因组，并保留了传播能力。
2.描述1的重组仙台病毒，其中，一个以上的编码功能蛋白的基因被修饰。
3.描述1或2的重组仙台病毒，其含有能在宿主细胞中表达的外源基因。
4.一种RNA分子，其含有描述1-3中任一项的重组仙台病毒中所具的RNA。
5.一种RNA分子，其含有描述1-3中任一项的重组仙台病毒中所具的RNA的cRNA。
6.一种试剂盒，其由以下两种成分组成a.一种DNA分子，其含有可转录描述4或5的RNA的模板cDNA，以及b.一种可在体外或胞内以所述DNA作模板转录描述4或5的RNA的单元。
7.一种试剂盒，其由以下两种成分组成a.一种宿主，其表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白(每种蛋白均可被具相当活性的蛋白替代)，以及b.描述4或5的一种RNA分子。
8.一种用于产生描述1-3的重组仙台病毒的方法，其包括把描述4或5的RNA分子导入宿主细胞，该宿主细胞表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白(每种蛋白均可被具相当活性的蛋白替代)。
9.一种试剂盒，其由以下三种成分组成a.一种表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白的宿主，b.一种含能转录描述4或5的RNA或cRNA的模板cDNA的DNA分子，以及c.一种能够在体外或胞内以所述DNA作为模板转录描述4或5的RNA的单元。
10.一种用于产生描述1-3的重组仙台病毒的方法，包括以将含有能转录描述4或5的RNA的模板cDNA的DNA分子和一种能在体外或胞外以所述DNA为模板转录描述4或5的RNA的单元导入表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白的宿主。
11.一种用于制备外源蛋白的方法，其包括用描述3的重组仙台病毒感染宿主并回收所表达的外源蛋白的步骤。
12.一种培养基或绒毛膜尿囊液，其含有表达的外源蛋白，而该外源蛋白可通过把描述3的重组仙台病毒导入宿主并回收所述培养基或绒毛膜尿囊液而得到。
13.一种DNA分子，其实现由整合到仙台病毒载体中的外源基因编码的蛋白表达，该仙台病毒载体含有以转录编码所述蛋白的反义RNA的方向插入到启动子下游的所述外源基因，以及所述的启动子。
可以获得本发明的重组仙台病毒载体，例如，通过体外转录编码基因技术产生的重组仙台病毒载体基因组的重组cDNA，产生重组仙台病毒基因组DNA，并将所述RNA导入宿主并同时表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白(每种蛋白均可以是具有相当活性的蛋白)。或者可通过将a)编码基因技术产生的重组仙台病毒载体基因组的重组cDNA，以及b)一种能在胞内以所述DNA作模板转录RNA的单位导入宿主同时表达仙台病毒的NP、P/C和L蛋白(每种蛋白均可以是具相当活性的蛋白)而获得本发明的重组仙台病毒载体。在这一情况下，所述重组cDNA a)可以插入到特异启动子的下游，并且所述转录单位b)可以是表达作用于所述特异启动子的依赖于DNA的RNA聚合酶的DNA分子。
作为插入所需外源基因，或者缺失或灭活所需基因的本发明起始材料，仙台病毒可以是一个归类于I型副流感病毒的毒株，如仙台病毒Z毒株或Fushimi毒株。此外，诸如DI颗粒、合成的寡核苷酸等的不完全病毒可以是使用的部分材料。
而且，只要本发明的重组仙台病毒保留传播能力，任何外源基因都可以插入到所述重组子所含RNA的任何位点，并且可以缺失或修饰任何基因组基因。待插入的外源基因可以以编码能在宿主中表达的各种细胞因子和肽类激素的基因为例。为表达所需的蛋白，插入了编码所述所需蛋白的外源基因。优选在仙台病毒的RNA中于序列R1(5′-AGGGTCAAAGT-3′)和R2(5′-GTAAGAAAAA-3′)之间插入一段6个数目扩增的碱基的序列。[“病毒学杂志”(Journal of Virology)，67卷，第8(1993)，4822-4830页]。插入到载体的外源基因的表面水平可以由基因插入位点和所述外源基因的侧翼碱基序列来调节。例如，在仙台病毒RNA的情况下，已知随着所述基因离NP基因的距离减小，插入基因的表达量增加。优选的用于表达所需蛋白的宿主可以是任何易受重组仙台病毒感染的细胞，例如哺乳动物细胞和鸡卵。可能通过用整合可表达外源基因的重组仙台病毒感染这些宿主并回收表达的基因产物来有效地产生外源基因产物。例如，这样表达的蛋白可在培养的细胞是宿主时从培养基以及鸡卵是宿主时从绒毛膜尿囊液用标准方法回收。
当外源基因插入用于表达负链仙台病毒RNA的质粒时，需要以用于转录编码蛋白的所述外源基因的反义RNA的方向将所述外源基因插在启动子的下游。通过本发明，已首次使可以获得这样的“用于表达由整合到仙台病毒载体的外源基因编码的蛋白的DNA分子，其中该仙台病毒载体含有以用于转录编码所述蛋白的所述外源基因的反义RNA的反义方向插入在启动子下游的外源基因和所述启动子”，这样构成所述发明的一部分。
例如，为灭活免疫原性基因或增加RNA转录和复制的有效性，也可以修饰部分与仙台病毒RNA复制有关的基因。具体地说，例如，可以修饰至少一个复制因子，NP、P/C和L蛋白以增强或减弱转录和复制能力。HN蛋白，一种结构蛋白，具有如血凝素和神经氨酸酶的双重活性。例如，前者活性的减弱可能增加血流中的病毒稳定性，且后者活性的修饰可使能够调节病毒感染性。介导膜融合的F蛋白的修饰也可能用于改善通过将重建的仙台病毒和包裹所需药物或基因的人工脂质体融合构建的膜融合脂质体。
本发明已使得能在基因组RNA的任何位点导入点突变和插入，并且被寄厚望加速有关病毒功功能的遗传信息的累积。例如，一旦阐明病毒RNA复制机制，研制一种对宿主细胞损害小并通过利用病毒和宿主细胞的核酸代谢的差异而针对核酸复制过程的杀病毒剂就可以成为可能。另外，对病毒基因编码蛋白的功能的阐明可能有助于研制针对涉及感染力和病毒颗粒形成能力的杀病毒剂。具体说来，例如，这些技术可被用于分析可能起着细胞表面的抗原分子的作用的F和HN蛋白的抗原逞递表位。在关于病毒抗性的宿主细胞基因被病毒感染激活导致病毒抗性增加时，有关宿主基因的这种激活机制的重要资料可以通过对病毒功能的遗传分析来获得。由于仙台病毒在诱导干扰素方面是有效的，其被用于各种基础研究。通过分析诱导干扰素所需的基因区域，可以产生非病毒干扰素诱导物。本发明的技术可用于疫苗的研究。通过将弱化突变的重组仙台病毒接种到含胚鸡卵可产生活的疫苗。这样获得的信息可以应用到极需活疫苗的诸如麻疹病毒和腮腺炎病毒的其他负链病毒。此外，本发明也使得可用重组仙台病毒作为基因治疗的载体。由于本发明的衍生于仙台病毒的病毒载体在临床应用和传播中是高度安全的，并且预计是以相对低剂量就有治疗效果的。另外，在治疗结束或在治疗期间需要抑制病毒载体复制时，通过给药依赖于RNA的RNA聚合酶的抑制剂，可仅特异抑制病毒载体复制而不损害宿主。
图1是对质粒pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的图示。
图2是对质粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA.的图示。
图3是对用SeVgp120感染的CV-1细胞后的时间和HAU以及gp120表达量之间的关系的图示。
在下文中，将参考到实施例来具体描述本发明但本发明不限于这些实施例。
实施例1仙台病毒转录单元pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的制备。
通过顺序地将含T7RNA聚合酶启动子、设计的以待转录成负链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因的DNA分子插入到pUC18载体，构建质粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA。并通过将顺序地含T7RNA聚合酶启动子、设计待转录成正链RNA的仙台病毒cDNA和核酶基因的DNA分子插入pUC 18载体构建质粒pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA。pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA的构建分别示于图1和2中。
实施例2由cDNA重建仙台病毒的实验将以常规方式用胰蛋白酶消化的LLC-MK2细胞(2×106)置于直径60mm的塑料平皿中，并在MEM培养基(补充10％FBS的MEM培养基)(2ml)中于5％CO2环境中37℃温度下温育24小时。除去培养基并用PBS(1ml)洗涤后，以感染复数(moi)2将表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3的PBS(0.1ml)悬液加入到细胞。每15分钟将平皿轻搅一次以充分分散病毒溶液，感染1个小时。除去病毒溶液并用PBS(1ml)洗涤后，将如下制备的含cDNA的培养基加到平皿上。
把表1和2中所示核酸(含表达复制仙台病毒、pGEM-L、pGEM-P/C和pGEM-NP所需因子的质粒)置于1.5ml的样品管中，并用HBS(Hepes缓冲盐水；20mM pH7.4的含150mM NaCl的Hepes)。这些表中，(-)和(+)cDNA分别表示质粒pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC18/T7(+)HVJRz.DNA，/C和/L分别表示在用限制酶MLuI处理后将环形和线形cDNA导入细胞中。
另一方面，在一枚聚苯乙烯管中放置Hanks平衡盐溶液(HBS，0.07ml)，N-[1-(2，3二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯(DOTAP)(Boehringer Mannheim)(0.03ml)。向此管加入上述核酸溶液，并将混合物如此静置10分钟。然后，向此混合物加入上述细胞培养基(2ml，补充10％FBS的MEM)，然后加入痘苗病毒抑制剂、利福平和阿糖胞苷C(C/Ara/C)至终浓度分别为0.1mg/ml和0.04mg/ml，结果制成含上述cDNA的培养基。
于37℃下把上述平皿于5％CO2环境中温育40小时。用橡皮刮棒收获平皿中细胞，转移到Eppendorf管中，以6,000rpm离心5分钟沉降并于PBS(ml)中重悬。将等份如此或稀释后的细胞悬液接种到10天龄的发育着的含胚鸡卵。即，用PBS将细胞悬液稀释至表1中所示的细胞数目，并于35℃下温育用0.5ml等份接种的卵72小时，然后于4℃下过夜。用带有针管的注射器从这些卵回收绒毛膜尿囊液得病毒。
如下分析所回收的病毒溶液的血凝素单位(HAU)和蚀斑形成单位(PFU)。
如下测定(HAU)。于400×g离心鸡血10分钟并弃去上清。将如此获得的沉淀悬浮于100体积的PBS中并于400×g离心10分钟以弃去上清。重复这一过程两次以制备0.1％血细胞溶液。制备病毒溶液两倍系列稀释液，将0.05ml的每种待测稀释液分别加到96-孔微孔板的每孔中。再将血细胞溶液(各0.05ml)加到每孔中，轻摇以确保充分混合，并置于4℃下40分钟。引起用肉眼可观察到的血凝的最高病毒稀释度被作为HAU。
如下测PFU。将CV-1细胞生长至在6-孔培养板上成单层。弃去培养基后，37℃下将10倍系列稀释的病毒溶液(各0.1ml)分加到培养板的每孔中以感染细胞1小时。在感染中，制备无血清的2×MEM和熔化的2％琼脂(55℃)的混合物，并把胰蛋白酶加到混合物中至终浓度为0.0075mg/ml。感染1小时并除去病毒溶液后，将与琼脂混合的培养基(各3ml)加到培养板的各孔中，并于37℃下于5％CO2的环境中温育3天。向每孔加入酚红(0.1％)(0.2ml)，于37℃下温育3小时并随后除去。计数未染色的空斑以估计病毒滴度PFU/ml。
表1示转染至LLC-2细胞中的仙台病毒模板cDNA，RNA复制所需cDNA因子、pGEM-L、pGEM-P/C、和pGEM-NP的量、温育时间、接种到鸡卵中的细胞数目，HAU和PFU值。
表1模板cDNA 总量pGEMpGEMpGEM 培养细胞数目HAU PFU(微克)-L -P/C-NP时间(微克) (微克) (微克) (小时)(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105512 2×109(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105256 9×108(+)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×106256 9×108(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(+)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×104＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×106＜2 ＜10(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×104＜2 ＜10(-)cDNA/C 10 4 2 4 40 1.00×105＜2 ＜10(-)cDNA/L 10 4 2 4 40 1.00×10648×103通过超离心沉淀显示HAU和PFU的样品、重悬、以20％-60％的蔗糖密度离心纯化并通过12.5％SDS-PAGE分级分离。这些样品中的每种蛋白的大小与仙台病毒的相同。
这些结果证实可通过将cDNA导入细胞重建仙台病毒，与那些转录负链RNA的cDNA相比，通过导入转录正链RNA的cDNA，更有效地重建了病毒颗粒，并且通过导入环形而不是线形cDNA更进一步有效地重建了病毒颗粒。
实施例3仙台病毒重建所需的RNA复制因子的测定进行实验以检测表达L，P/C和NP蛋白的三种质粒是否全部为仙台病毒的重建所需。除将pGEM-1，pEGM-P/C和pGEM-NP质粒中两种的任意组合或仅其中一种而不是实施列2中的所有这三种组合被与模板cDNA一起导入细胞之外，实验方法与实施例2中所述的那些相似。
表2示导入LLC-MK2细胞的仙台病毒模板cDNA，包括pGEM-L，pEGM-P/C和pGEM-NP在内的为RNA复制所必需的cDNA因子的量，培养时间，接种到鸡卵中的细胞数目以及HAU和PFU值。
表2模板cDNA 总量 pGEM pEGM pGEM 培养 培养细胞 HAU PFU(微克) -L -P/C -NP 时间 的数目(小时)(+)cDNA/C 1042 440 1.00×105256 6×108(+)cDNA/C 1042 440 1.00×106512 4×109(+)cDNA/C 1002 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1042 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1042 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1000 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA1000 440 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1002 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 040 1.00×106＜2 ＜10(+)cDNA/C 1040 040 1.00×106＜2 ＜10如表2中所示，通过将这三种因子中的两种的任意组合导入细胞未观察到任何重建，证实这三种蛋白L，P/C和NP都为病毒重建所需要。
实施例4在体外由转录的RNA重建仙台病毒的实验既然实施例2中描述了由功能cDNA克隆重建仙台病毒，那么进一步检测所述cDNA的体外转录产物，即，vRNA和cRNA是否能支持同样的重建。
在用限制酶MluI将仙台病毒转录单元pUC 18/T7(-)HVJRz.DNA和pUC 18/T7(+)HVJRz.DNA线性化后，用这些DNA作模板，用纯化的T7聚合酶制剂(EPICENTRE TECHNOLOGIESAmpliscribe T7转录试剂盒)于体外进行RNA合成。用于体外合成RNA的方法实际上是按照随试剂盒提供的方法。用这样获得的RNA产物替代实施例2中的cDNA，进行相似的实验，通过HA实验评估病毒产物。结果示于表3。
表3模板cDNA 总量 pGEM pEGM pGEM 培养 培养细胞 HAUPFU(微克) -L-P/C -NP时间的数目(微克) (微克) (微克) (小时)体外 104 2 4 401.00×106512 2×109(-)RNA体外 104 2 4 401.00×106512 ND(-)RNA体外 104 2 4 401.00×10625×103(+)RNA体外 104 2 4 401.00×106＜2 ND(+)RNA这些结果表明能够通过将负或正义链RNA导入细胞来重建病毒。
实施例5插入到仙台病毒载体中的外源基因在宿主细胞中的表达1.插入外源基因(HIV-1 gp120)仙台病毒载体“pSe Vgp 120”的制备用含引物a(5′-TGCGGCCGCCGTACGGTGGCAATGAGTGAAGGAGAAGT-3′)(序列1)和引物d(5′-TTGCGCCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTTATTACTACGGCGTACGTCATCTTTTTTCTCTCTGC-3′)(序列2)的一套引物，用标准的PCR技术于“pN1432”上扩增HIV-lgp120基因。PCR产物被进行TA克隆，用NotI消化，并且然后插入到“pSeV18+”的NotI位点。然后用重组质粒转化E.coli细胞。以“小量制备法”由E.coli的每一克隆提取DNA，用DraIII消化，然后电泳。通过证实含由该插入所预计大小的DNA片段来选择阳性克隆。在证实DNA片段具真正的核苷酸序列后，通过氯化铯密度梯度离心纯化DNA。下文将插入有gp120基因的pSeV18+称作“pSe Vgp120”。
2.含pSeVgp120(SeVgp120)的仙台病毒的重建和对gp120表达的分析除开在pGEM-NP，pGEM-P/C和pGEM-L之外，还将pSeVgp120转染到LLCMK2细胞中，除此之外完全如实施例2中所述由含胚鸡卵回收绒毛尿囊液并分析病毒HAU。再如下通过ELISA检测回收病毒的gp120表达把样品(各100μl)分加到已用抗HIV-1的单克隆抗体包被过的96-孔板的每一孔中，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔加入HRP-连结的抗HIV-1抗体(各100μl)，并于37℃下培养60分钟。用PBS洗涤后，向每孔加入四甲基联苯胺，通过按照450nm处的光密度测定酸性条件下由HRP作用转化的反应产物的量来估计gp120的表达量。结果示于表4的左栏中。
把这样获得的病毒溶液接种到CV-1细胞中并如下同样检测。把CV-1细胞以5×105细胞/板分散到培养板，生长，然后弃去培养基。用PBS(-)洗涤后，以感染复数10将病毒溶液加到细胞中，并于室温下培养1小时。弃去病毒溶液后，用PBS(-)洗涤，向细胞加入普通的(plain)MEM培养基(补充了抗生素阿糖胞苷和利福平和胰蛋白酶的MEM培养基)，并于37℃下培养48小时。反应后回收培养基，测HAU(以与实施例2中所述相同的方法)并测gp120的表达(通过ELISA)。结果示于表4的栏中。此外，再把CV-1细胞培养基的上清液接种到含胚的鸡卵中，对这样获得的病毒溶液测HAU并检测gp120表达(通过ELISA)。结果示于表4的右栏中。
表4(微克/毫升)绒毛膜尿囊液 CV-1培养基 绒毛膜尿囊液(F1)gp120(HAU) (F1)gp120(HAU) (F2)gp120(HAU)0.10(4) 3.46(128)0.15(32) 1.81(128) 1.56，1.21(512，512)0.05(32) 2.20(128)如表4中所示，检测到培养中CV-1细胞中相当高浓度的gp120(表的中栏)，在再用病毒接种的含胚鸡卵的绒毛尿囊液中也一样(表的右栏中)。表的左栏和中栏中示三个克隆的平均值。
此外，以Western印迹分析gp120的表达。于20,000rpm离心以SeVgp120感染的CV-1细胞的培养基1小时来沉淀病毒后，于冰上用TCA(10％，v/v)或于-20℃下用70％乙醇处理上清液后，于15,000rpm离心15分钟。于90℃下混合这样沉淀的蛋白质以和“SDS-PAGE样品缓冲液”(DaiichiChemicals)反应3分钟，然后于10％SDS-PAGE上进行电泳。把这样分离的蛋白转移到PVDF膜(Daiichi Chemicals)上，于室温下和单克隆抗体902反应1小时，然后用T-TBS洗涤。于室温下把该膜和抗-mIgG(Amersham)反应1小时，并用T-TBS洗涤。然后于室温下把该膜与HRP-连接的蛋白A(Amersham)反应1小时，用T-TBS洗涤，加入4-氯-1-萘酚(4CNPLus)(Daiichi Chemicals)以检测gp120。结果，在与预计的gp120分子量相应的位置显色蛋白质带。
此外，分析了用SeVgp120转染的CV-1细胞的感染后时间对HAU值和gp120表达量的效应。以感染复数10用SeVgp120感染分散到10-厘米板的CV-1细胞(5×106)，于感染后30，43，53和70小时时回收培养基(各1ml)，与等体积新鲜培养基混合，进行HAU实验，gp120表达检测(通过ELISA)和Westem印迹。结果示于图4。如图3中清楚地所示，gp120的产量趋向于随仙台病毒的HA滴度增加而增加。
实施例6对各种类型的细胞中SeVgp120增殖以及gp120表达水平的分析除用不同类型的细胞外，使用与实施例5中的那些相同的方法，测试HAU和gp120表达水平(通过ELISA)。结果示于表5。
表5细胞类型 时间(感染后) HAUrgp120(微克/毫升)CV-1 96 322.5LLCMK2 48 160.5CHO55 4 0.46NTH3T3 48 4 0.25MT424 160.8MOLT4/ 24 161.2该表的左栏示用SeVgp120感染的各种类型的细胞的感染后时间。结果，在所有被测试的类型的细胞中检测到了SeVgp120增殖和gp120表达。
实施例7对宿主细胞中插入到仙台病毒载体中的荧光素酶基因的表达的研究为分离插入到载体的荧光素酶基因，用一套引物[5′-AAGCGGCCGCCAAAGTTCACGATGGAAGAC-3′](30个碱基(mer))(序列3)和[5′-TGCGGCCGCGATGAACTITCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGATTATTACAATTTGGACTTTCCGCCC-3′(69个碱基)(序列4)，以“pHvluciRT4”作模板，通过标准的PCR构建在两个末端连接有工程NotI位点的荧光素酶基因。将PCR产物克隆到pSeV18+的NotI窗口以获得插入了荧光素酶基因的仙台病毒载体。然后，将重组载体转染到LLCMK2细胞中，并接种到含胚鸡卵中。切下发育的卵的绒毛尿囊膜，用冷PBS(-)洗涤两次，并在加入裂解缓冲液(Picagene WAKO)(25μl)并充分混合后，于15,000rpm离心2分钟。向上清液(各5μl)加入底物(IATRON)(50μl)，并将混合物分散到96-孔板的各孔中。用发光计(Luminous CT-9000D，DIA-IATRON)测荧光强度，酶活性表达为每秒的计数(CPS)。结果，在感染后24小时时，以CV-1细胞检测到了相当高的荧光素酶活性(表6)。在这些实验中，将不携带荧光素酶基因的仙台病毒用作对照(表中以“SeV”表示)。由两个克隆得到的结果示于该表中。
表6荧光强度(计数/10秒)绒毛膜尿囊膜CV-1(感染后24小时)Luc/SeV 66918728915608707815SeV69 4823 49工业上的可应用性通过本发明，已建成了一个用于从仙台病毒cDNA有效重建病毒颗粒的系统，这使得对能仙台病毒的基因操作以生产含带有插入的目的外源基因或缺失或灭活的目的基因的基因组但保持传播能力的重组仙台病毒。
序列表序列1长度38个碱基对类型核酸链型单链拓朴结构线性分子类型其他核酸(合成的DNA)序列TG CGGCCGCC GTACGGTGGC AATGAGTGAA GGAGAAGT38序列2长度69个碱基类型核酸链型单链拓朴结构线性分子类型其他核酸(合成的DNA)序列TTGCGGCCGC GATGAACTTT CACCCTAAGT TTTTVTTACTACGGCGTACG TCATCTTTTT TCTCTCTGC69序列3长度30类型核酸链型单链拓朴结构线性分子类型其他核酸(合成的DNA)序列AAGCGGCCGC CAAAGTTCAC GATGGAAGAC 30序列4长度69类型核酸链型单链拓朴结构线性分子类型其他核酸(合成的DNA)序列TGCGGCCGCC ATGAACTTTC ACCCTAAGTT TTTCTTACTACGGATTATTA CAATTTGGAC TTTCCGCCC69
权利要求
1.一种重组仙台病毒，其含有具插入的目的外源基因或缺失或灭活的目的基因的基因组，但保留了传播能力。
2.权利要求1的重组仙台病毒，其中一或一个以上编码功能蛋白的基因被改变。
3.权利要求1或2的重组仙台病毒，其含有一个能在宿主中表达的外源基因。
4.一种RNA分子，其含有权利要求1-3中任一项的重组仙台病毒中所具有的RNA。
5.一种RNA分子，其含有权利要求1-3中任一项的重组仙台病毒中所具有的RNA的cRNA。
6.一种试剂盒，其含有a.一种DNA分子，其含有能转录权利要求4或5的RNA的模板cDNA，以及b.一种能在体外或胞内以所述DNA作模板转录权利要求4或5的所述RNA的单元。
7.一种试剂盒，其含有a.一种表达仙台病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主(每种蛋白均可被其相当活性的蛋白替代)，以及b.权利要求4或5的RNA分子。
8.一种用于生产权利要求1-3中任一项的重组仙台病毒的方法，包括把权利要求4或5的RNA转染到表达仙台病毒的NP，P/C和L蛋白(每种蛋白均可被具相当活性的蛋白替代)的宿主中。
9.一种试剂盒，其由以下三种成分组成，a.一种表达仙台病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主，b.一种DNA分子，其含有能转录权利要求4或5中任一项的RNA或cRNA的模板cDNA，以及c.一种能在体外或胞内以所述DNA为模板转录权利要求4或5的RNA的单元。
10.一种用于生产权利要求1-3中任一项的重组仙台病毒的方法，其中所述方法包括把一种含能转录权利要求4或5的RNA的模板cDNA的DNA分子和一种能在体外或胞内以所述DNA作模板转录权利要求4或5中的RNA的单元导入一种表达仙台病毒的NP，P/C和L蛋白的宿主中。
11.一种用于生产一种外源蛋白的方法，其包括用权利要求3的重组仙台病毒感染宿主并回收表达的外源蛋白的步骤。
12.一种培养基或绒毛尿囊液，其含有可通过将权利要求3的重组仙台病毒转染到宿主并回收所述培养基或绒毛尿囊液而获得的表达的外源蛋白。
13.一种用于表达由整合到仙台病毒载体的外源基因编码的蛋白的DNA分子，该仙台病毒载体含有以插入到启动子下游的所述外源基因，插入是以用于转录编码所述蛋白和所述启动子的反义RNA的(反义)方向。
全文摘要
一种用于重建仙台病毒颗粒的方法,其包括将仙台病毒基因组导入其中所有早期复制基因已经表达的宿主中。该方法使能进行仙台病毒的基因操作,并因而使得可能有效利用仙台病毒作为载体。
文档编号C12N5/10GK1207124SQ9619947
公开日1999年2月3日 申请日期1996年10月22日 优先权日1995年11月1日
发明者永井美之, 加藤笃, 村井深, 坂田恒昭, 长谷川护, 盐田达雄 申请人:株式会社载体研究所