编码11-顺式视黄醇脱氢酶的核酸分子的制作方法

专利名称：编码11-顺式视黄醇脱氢酶的核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有11-顺式视黄醇脱氢酶活性的蛋白质，该蛋白质与表达于例如视网膜色素上皮细胞(RPE)中的细胞质视黄醇-结合蛋白(RBP)的膜受体的特异性部分形成复合物，本发明更具体地涉及32KDa的具有11-顺式视黄醇脱氢酶活性的蛋白质，该蛋白质与63KDa的结合RBP的膜蛋白形成复合物。本发明还涉及32KDa蛋白质(p32)的分离，以及编码p32的核酸分子或与该编码序列互补的核酸分子，和这些物质的多种应用。
背景技术：
Retinoid(维生素A-衍生物)在多种生物学过程中具有重要的生理学功能。在胚胎生长和发育过程中，以及在成年生物体的生长和分化过程中，retinoid行使激素的功能并参与调节多种细胞类型的基因表达，见Lied等人，Trends Genet.,17:427-433(1992)。据信这些作用是通过两类受核配体控制的转录因子介导的，它们是视黄酸受体(RAR)和retinoid X受体(RXR),Benbrook等人，自然，333:669-672(1988)；Brand等人，自然，332:850-853(1988)；Giguere等人，自然，330:624-629(1987)；Mangelsdorf等人，自然，345:224-229(1990)；Mangelsdorf等人，Genes Dev.6:329-344(1992)；Petkovich等人，自然，330:440-450(1987)；和Zelent等人，自然，339:714-717(1989)。
除了在细胞生长和分化中作为激素起作用以外，retinoid也参与视觉过程，这是因为视黄醛的立体异构体11-顺式视黄醛是视色素的生色团，例见Bridges,The Retinoids,vol.2,pp125-176,Academic Press,Orlando,Florida,(1984)。
在正常的生理状态下，大多数细胞(眼和非眼细胞)得到全反式视黄醇作为它们retinoid的主要来源。尽管不同的组织中发生着许多不同的代谢事件，但已知已逐渐形成了共用的视黄醇胞外转运机。具体地说，在细胞质中视黄醇由细胞质视黄醇结合蛋白(RBP)转运，见Goodman等人，The Retinoids,Academic Press,Orlando,Florida,vol.2,pp41-88(1984)，然后，通过使用特殊机制的细胞转变产生视黄醇的活性衍生物，即非眼组织中的视黄酸和对于眼组织而言，大多为11-顺式视黄醛。迄今为止，在分子水平上仍未完全确定任何一个这种机制，所涉及的几种酶也只是通过酶解活性得以鉴定，见Lion等人，Biochem.Biophys.Acta.384:283-292(1975)；Zimmermann等人，Exp.Eye Res.21:325-332(1975)；Zimmermann等人，Exp.Eye Res.23:159-164(1976)和Posch等人，生物化学，30:6224-6230(1991)。
关于retinoid的摄取，极化的视网膜色素上皮细胞(RPE)是独一无二的，因为全反式视黄醇通过两种不同的机制进入这些细胞。由RBP积累的视黄醇可通过碱性侧的质膜摄入，而可能由间质中的视黄醇结合蛋白(IRBP)在漂白视色素之后摄入的全反式视黄醇可通过顶端的质膜进入，见Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)；Alder等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.108:1601-1608(1982)；Lai等人，自然，298:848-849(1982)；和Inu等人，Vision Res.22:1457-1468(1982)。
视黄醇由RBP转移至细胞不能完全被理解，在包括RPE的大量细胞类型中，已鉴定出RBP的特异性膜受体，这与视黄醇的受体-介导的摄入机制是一致的。例如，在与两种机制中的第一种相关的参考文献中教导了分离的视黄醇结合蛋白受体，编码这些受体的核酸分子和与这些受体结合的抗体，见Bavik等人，生物化学杂志，266:14978-14985(1991)；Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)；Bavik等人，生物化学杂志，267:20540-20546(1993)；和共同待审的美国申请流水号083,539以及国际公开WO93/23538，上述文献都列入本文的参考文献中，也见Heller，生物化学杂志，250:3613-3619(1975)；和Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)。
在RPE的顶部摄取视黄醇以再生11-顺式视黄醛的特征未能被较完善地鉴定。然而，不论全反式视黄醇的来源如何，11-顺式视黄醛的合成和顶部分泌似乎是RPE中积累的视黄醇的主要途径。目前，关于细胞通过碱性侧和顶部质膜摄取视黄醇是否使用相似的机制仍是未知的。可利用的资料只显示出RBP的功能性受体全部表达于RPE-细胞的碱性侧质膜上，Bok等人，Exp.Eye Res.22:395-402(1976)。
还已知色素RPE表达63KDa的蛋白质(p63)，除非另有说明，此分子量和所有其它的分子量是参照SDS-PAGE测出的。通过化学交联还显示出此蛋白质可能是寡聚体蛋白质复合物的一部分，所述复合物作为RPE中细胞质视黄醇结合蛋白(RBP)之膜受体行使功能，或者是RPE细胞中retinoid摄取机的组分。见Bavik等人，生物化学杂志，266:14978-14985(1991)；Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)；和美国申请流水号083,539以及PCT申请WO93/23538。已分离出p63蛋白，并已克隆出相应的cDNA，见Bavik等人，生物化学杂志，267:20540-20546(1993)。然而，这些参考文献中都没有暗示具有本发明特征的蛋白质的存在。
发明概述根据本发明，已发现RPE膜相关蛋白，通过SDS-PAGE测定，其分子量约为32KDa。被称为“p32”的这些蛋白质与以前鉴定的p63蛋白形成寡聚体蛋白质复合物，所述p63蛋白是RBP膜受体的成分。本发明还公开了编码p32蛋白的核酸分子，序列分析表明p32蛋白属于短链醇脱氢酶家族，并表现出11-顺式视黄醇脱氢酶的活性，该酶在辅因子NAD+的存在下可催化11-顺式视黄醇立体特异性地转变成11-顺式视黄醛。
p32还将显示出许多重要的用途，例如，由于其与膜结合的11-顺式视黄醇脱氢酶活性，它可催化11-顺式视黄醇转变成11-顺式视黄醛，这种转变是RPE-细胞中retinoid代谢的主要代谢步骤，可导致色素性视网膜炎的retinoid的积累和代谢可能直接或间接地依赖于p32的存在，和/或p32的激活或抑制。由于还发现p32是短链醇脱氢酶特大家族的成员，很多已知的醇脱氢酶抑制剂(和激活剂)可以用于开展活性测定，从而开发针对视黄醇摄取和眼retinoid代谢的诊断材料。
本发明的另一部分是编码如人，牛和鼠形式的哺乳动物形式蛋白质的核酸分子。本发明的另一部分是根据本文所述核苷酸序列的探针。
在以下具有附图的详细讨论中将更完整地讨论本发明的这些和其它方面。
附图的简述

图1A表示得自RPE膜并用抗p63的mAb A52免疫沉淀的经放射性标记的蛋白质的SDS-PAGE分析。
图1B表示与mAb A52免疫亲和柱结合和穿过柱洗脱下来的RPE膜蛋白的SDS-PAGE分析，在从免疫亲和柱洗脱下来的级分中存在p32。
图2A表示使用寡核苷酸混合物OM1和OM3得到的61 bp PCR-扩增片段在琼脂糖凝胶电泳中的显示，所述两种寡核苷酸都衍生自肽321，肽321是从经胰蛋白酶消化的p32的部分氨基酸序列测定中推导的。
图2B表示使用寡核苷酸混合物OM2和OM3得到的330 bp PCR-扩增片段在琼脂糖凝胶电泳中的显示，所述两种寡核苷酸分别衍生自肽p323和p321，所述肽是从经胰蛋白酶消化的p32的部分氨基酸序列测定中推导的。
图3阐明了pλ321的核苷酸序列和p32推导的氨基酸序列，部分氨基酸序列测定自分离自经胰蛋白酶消化的p32的肽。
图4阐明了p32和一些属于短链醇脱氢酶家族的相关蛋白质的氨基酸序列的排列。
图5阐明了p32氨基酸序列的分析。
图6阐明了体外合成的p32的膜相互作用。
图7阐明了对应于p32的转录本的受限制的表达。
图8A阐明了为了11-顺式视黄醇脱氢酶活性的进一步的酶解活性分析，在经转染的细胞中表达p32。
图8B阐明了在NAD+的存在下，11-顺式视黄醇脱氢酶活性的表达，这种表达可由11-顺式视黄醛的形成来表示。
图8C阐明了在辅因子NADP的存在下11-顺式视黄醇脱氢酶活性的缺乏。
图8D阐明了不能表达p32的对照细胞，该细胞不具备将11-顺式视黄醇氧化成11-顺式视黄醛的能力。
图9表示人11-顺式视黄醇脱氢酶基因的结构。
优选实施方案的详细讨论已知细胞质视黄醇结合蛋白(RBP)能与视网膜色素上皮细胞膜(RPE)上63 KDa蛋白质(p63)受体的高分子量复合物化学交联，形成RBP-RBP受体复合物，该复合物具有表观分子量约为Mτ150,000-450,000的类似大小的球状蛋白质的洗脱特性，见Bavik等人，生物化学杂志，266:14978-14985(1991)和Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)。负责结合RBP，其表达局限于RPE的蛋白质已被鉴定为63 KDa的蛋白质(p63)。通过产生针对63 KDa蛋白质的能与RBP-RBP受体复合物和p63结合的单克隆抗体A52(mAb52)，并进行免疫亲和层析分析，大部分p63被洗脱成单体，发现蛋白质的重要部分位于对应于较高分子量类型的位置。这表明p63以具有其它蛋白质成分的寡聚体蛋白质复合物的形式存在。Bavik等人，生物化学杂志，266:14978-14985(1991)和Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)。因此，使用下列方法研究这种寡聚体蛋白质复合物的分子特征，以及p63是否与特异于RPE的其它蛋白质形成复合物，结果表明32KDa的膜相关蛋白(p32)实际上与p63形成了复合物。实施例1按列入本文参考文献的Bavik等人，生物化学杂志，266:14978-14985(1991)的描述分离牛RPE细胞，并制备膜组分。然后用含有1％3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲胺]-1-丙磺酸(CHAPS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(20mM磷酸钠，pH7.2，含有150mM NaCl)以1mg总膜蛋白/ml缓冲液的浓度溶解RPE-膜蛋白。通过以100,000×g的转速超速离心1小时除去残留的物质，接着，在用含有1％CHAPS的PBS平衡过的Sepharose6柱上凝胶过滤500μl溶解膜的等分试样。以0.2ml/min的流速操作柱，收集500μl级分。然后，使用众所周知的氯胺T方法，用Na125Ⅰ放射性标记洗脱到对应于Mτ150,000-400,000的球状蛋白质级分中的蛋白质。通过在填充于巴氏吸管中的Sepahadex G-25上凝胶过滤除去未掺入的125Ⅰ。
然后用含有1％CHAPS和1％牛血清白蛋白的PBS稀释经放射性标记的蛋白质的等分试样，随后使用针对p63的mAb A52(每次保温5μg)或使用两种针对p63的多克隆兔抗血清(每次保温3μl血清)对上述蛋白质进行免疫沉淀，见Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)。使用不相关的mAb和预免疫的兔血清在平行的保温中监测非特异性的免疫沉淀。在保温中进入50μl 50％的A蛋白-Sepharose悬浮液达30分钟，随后用含有1％CHAPS的PBS小心洗涤珠，制备经洗脱的物质以供SDS-PAGE分析，制备过程按照Blobel等人，细胞生物学杂志，67:835-851(1975)的描述进行。
参照图1A，SDS-PAGE凝胶的放射性自显影表明两种类型的试剂都能与p63反应，而不相关的mAb或预免疫的兔血清不能沉淀p63。在含有经免疫沉淀的p63的所有泳道中，富集了Mτ32,000蛋白质。由于针对p63的mAb A52和兔抗血清对于p63具有高度的特异性(例见Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992))，因此可得出结论在前述的分析中Mτ32,000蛋白质(p32)通过与p63结合得以共沉淀。分析也鉴定出与p32和p63一起沉淀的M,50,000-52,000的双带(图1d,e)。实施例2然后进行实验以鉴定p32，可利用的事实是如上文所述p32能与p63特异性地相互作用，因此，使去污剂溶解的RPE-膜蛋白穿过含有mAb A52的免疫亲和柱。参照图1B，泳道b，洗涤步骤之后，用含有CHAPS的缓冲液在高pH下洗脱结合的蛋白质，经洗脱的级分的SDS-PAGE分析和考马斯染色揭示了p63被特异性地保留并从免疫亲和柱上被洗脱下来。另外，在得自A52柱的洗脱液中显示出对应于p32的弱染色的带。如图1B所示，溶解的RPE膜和A52柱经洗脱级分的总蛋白质分布图的比较表明p32蛋白不能在其中有效地被保留。然而，p32在A52柱的经洗脱级分中出现，但不在含有不相关Ig的柱的经洗脱级分中出现，这表明p32与p63的特异性的相互作用。此结果与以前的免疫沉淀资料是一致的，并显示出p32与p63复合，由于此复合物的形成使p32被保留于免疫亲和柱上。
将p32鉴定为RPE膜中与p63的复合物中的成分之后，如下文实施例3中所述，通过得自A52免疫亲和柱的溶解的RPE膜的经洗脱级分的SDS-PAGE来分离p32蛋白自身。实施例3如上文所述，用含有1％CHAPS的PBS溶解RPE膜，通过在+4℃下末端-对着-末端旋转使之与偶联于Bio-Rad poly prep柱(Bio-Rad)中的被CNBr-激活的Sepharose 4B珠(Pharmacia)上的mAbA52 Ig一起保温。保温2小时之后，使珠稳定下来，用5倍柱体积的含有1％CHAPS的PBS快速洗涤柱。然后用含有1％CHAPS的50mM的三乙醇胺缓冲液(pH11.2)洗脱结合的蛋白质。通过加入含有1％CHAPS的1M Tris-HCl缓冲液将洗脱液的pH快速地调节至8.0。使经洗脱的级分经受SDS-PAGE，然后通过考马斯蓝染色可观察到被分开的蛋白质，发现了对应于p32(SDS-PAGE,32KDa)的带。
为了测定p32的一级结构，首先切下对应于大约2-5μg 32 KDa蛋白质的前述考马斯蓝染色带部分，然后冻干凝胶碎片以干燥，对分离的蛋白质进行部分氨基酸序列的分析。在含有经修饰的胰蛋白酶的缓冲液中使凝胶重新水合并保温以产生多种肽供提取和分析。优选的方法列于下文实施例4中。实施例4切下得自实施例2的含有p32蛋白的经考马斯蓝染色的带，并根据稍加改动的Rosenfeld等人，Anal.Biochem,15:173-179(1992)的方法处理此带。在30℃下，用100μl含有50％乙腈的0.2M的碳酸氢铵缓冲液将凝胶碎片洗涤两次，达30分钟，然后在氮气气流下完全干燥。用5μl含有0.02％吐温20和0.5μg经修饰的胰蛋白酶的0.2M的碳酸氢铵缓冲液使凝胶碎片重新水合。加入的胰蛋白酶得自在1mMHCl中制备的储存液。每次加入5μl 0.2M的碳酸氢铵缓冲液以继续水合直至凝胶碎片水合至它们原来的大小。然后在30℃下将经水合的凝胶碎片保温过夜，通过加入三氟醋酸(TFA)至终浓度为1％来抑制蛋白酶的活性，回收上清液，并与用150μl 0.1％的TFA制备的两份提取液混合于60％的乙腈中。分解有机相，使用在SMART系统中操作的反相mRPC C2/C18 SC 2.1/10柱对消化物进行HPLC。用0.065％TFA中的乙腈梯度洗脱样品，使用自动的峰分级选择收集含有不连续肽的级分。选择5个经鉴定的肽，使用装配有120A型PTH分析仪的ABI 470A测序仪(applied Biosystems Inc.Foster City,CA)对它们进行氨基酸序列分析，结果列于下表1。表1分离自经胰蛋白酶消化的p32的5个肽的氨基酸序列测定p321 L-V-E-A-V-L-A-E-V-L-P-K-P-A-Q-T-V-A(SEQ ID NO:1)(D)a (W)(Y)p322 Y-S-P-G-W-D-A-K(SEQ ID NO:2)p323 T-P-V-T-N-L-E-T-L-E-D-T-L-Q-A(SEQ ID NO:3)p324 D-V-A-P-F-G-V(SEQ ID NO:4)p325 L-H-T-T-L-L-D-V-T-D-P-Q-S-I(SEQ ID NO:5)a括号中给出的氨基酸残基是由相同位置处的cDNA序列推导出的残基。
蛋白质SEQ ID NO:1-5可以单独使用或者通过熟知的方法与半抗原连接。
接着，为了测定p32完整的一级结构，可根据表1中已测定序列的p321和p323肽的氨基酸序列合成下表2中列出的四个简并性的寡核苷酸混合物OM1-OM4，方法见实施例5。实施例5使用熟知的技术合成衍生自肽p321和p323的四个简并的寡核苷酸混合物。两个有义的混合物(OM1和OM3)衍生自p321的N-末端氨基酸1-5和p323的2-6。反义混合物(OM2和OM4)衍生自p321的氨基酸12-17和p323的10-15。合成出的所有核苷酸混合物都具有4bp的5突出端和一个EcoRⅠ位点用以随后克隆PCR产物。寡核苷酸混合物的序列列于下表2，下划线的是EcoRⅠ位点，含有所有四个碱基的位置用N表示。表2OM1: ACGTGAATTCTNGTNGA(A,G)GCNGT(SEQIDNO:6)OM2: ACGTGAATTCACNGT(T,C)TGNGCNGG(T,C)TT(SEQIDNO:7)OM3: ACGTGAATTCCCNGTNACNAA(T,C)(C,T)T(SEQIDNO:8)OM4: ACGTGAATTCGC(T,C)TGNA(A,G)NGT(A,G)TC(T,C)TC(SEQIDNO:9)在使用标准方法的聚合酶链反应(PCR)中使用逆转录自RPEmRNA的单链“互补”cDNA和上述简并的核苷酸混合物的四种联合。扩增程序之后，通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物的等分试样，所用方法见下文实施例6。实施例6为了进行PCR扩增，通过使用禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶的标准方法合成cDNA的第一条链，使用20μg得自分离的RPE-细胞的总RNA，用寡(dT)15引发反应。在随后的每次PCR反应中使用相当于2μg总RNA的等分试样。在100μl反应液中使用终浓度为0.5μM的寡核苷酸混合物进行PCR反应，使用了Taq聚合酶，30轮循环(95℃2分钟，55℃1分钟和72℃2分钟)之后，在含有5μg/ml溴化乙锭的4％GTG琼脂糖凝胶电泳上分析反应液的等分试样。
如图2A所示，使用都衍生自肽p321的寡核苷酸混合物OM1和OM2的扩增导致经扩增的61bp片段。使用混合物OM3-OM4和OM1-OM4的扩增不能产生任何产物。最终如图2B所示，使用OM3-OM2的扩增导致了经扩增的330bp片段。
随后对61bp和330bp片段进行的序列分析进一步证实了已被扩增的cDNA序列与以前氨基酸序列分析中产生的肽序列是相对应的。从经扩增的PCR片段推导出的氨基酸序列与肽p321产生的氨基酸序列之间的差异显示出适于分离编码p32的全长cDNA克隆的特异性探针的产生。
为了分离全长的cDNA克隆，用330bp片段作为探针筛选RPE-特异性的λZAP-Ⅱ cDNA文库。从大约200,000个克隆中分离出5个独立的λ克隆，并通过体内切割亚克隆之。cDNA克隆pλ321含有最长的插入片段(大约1.1kb)，被选择用于进一步的研究。
完整地测定pλ321两条链的序列，使用排除接头在外长度为1104bp的插入物制备cDNA文库，所用方法列于下文实施例7中。实施例7用EcoRⅠ消化使用OM1-OM2(61bp)和OM3-OM2(330bp)得到的扩增产物，凝胶纯化并克隆到经EcoRⅠ切割的载体pBS中，按列入本文参考文献的Bavik等人，生物化学杂志，267:20540-20546(1993)先前的描述，使用32p-标记的330bp片段筛选RPE-特异性的λZAP Ⅱ cDNA文库。分离出5个阳性的λ克隆，通过遵照厂商的说明进行体内切割将插入物亚克隆至pBluescript中。克隆pλ321含有1.1kb的插入物，使用T3,T7或M13通用引物或内部引物，用Sequenase完整地测定两条链的序列。
pλ321的核苷酸序列和推测的p32氨基酸序列示于图3(SEQ IDNO:10)。核苷酸数码在左边，氨基酸残基的数码在右边，氨基酸1是起始的甲硫氨酸(“Met”)。
如图3所示，1.1kbp的插入物含有一个编码318个氨基酸残基的长的开放阅读框，所述氨基酸残基经计算的质量是35,041D。根据转录起始的Kozak规则来看，第一个甲硫氨酸残基位于良好的前后序列中，它可能是起始密码子，见Kozak，细胞，44:283-292(1986)。此推论得到下列事实的支持，即如下文所述，转录自pλ321的合成的mRNA的体外翻译产生了Mτ32,000蛋白质(SDS-PAGE分析)，但在cDNA 5′非翻译区上游35bp的读框中不存在终止密码子。图3还显示出100bp的3′非翻译区以推断的polyA-段终止，在上游序列中鉴定出polyA-信号(bp1104-1110)。
在可用于比较的62个残基中，推断出的pλ321氨基酸和5个经胰蛋白酶处理产生的肽的氨基酸序列(表1)只有3个位置有所不同，所有这3个不同之处都发现于肽p321中，但第二个cDNA克隆(pλ324)的此区域中的核苷酸序列与pλ321的相同。这表示尽管不能排除差异是由p32不同的等位基因的存在引起的，但肽p321氨基酸序列的测定可能不正确。这些资料阐明了pλ321含有p32完整的编码区。
再参照图3，在推导出的氨基酸序列的第160-162位可发现N-联糖基化的共有位点(氨基酸残基N-I-T)。
另外，已发现p32显示出与短链醇脱氢酶的序列相似性，参照图4，遍及Swissprot蛋白质数据库的研究揭示出p32与几种以前已测序的蛋白质结构相关，与之最密切相关的是线粒体基质脱氢酶，D-β-羟基丁酸脱氢酶(BDH)，Churchill等人，生物化学，31:3793-3799(1992)，p32与其它两种蛋白质显示出较少但重要的相似性，所述蛋白质是得自大肠杆菌的3-oxoacy[酰基载体蛋白]还原酶(Rawlings等人，生物化学杂志，267-5751-5754(1992))和人雌二醇17β-脱氢酶(Peltoketo等人，FEBS Lett,239:73-77(1988)和Leu等人，Mol.Endocrinol,3:1301-1309(1989))。所有的相关蛋白质都属于短链醇脱氢酶蛋白质特大家族中的成员。此蛋白质特大家族包括大约50个不同的蛋白质(Persson等人，欧洲生物化学杂志，200:537-593(1991))。p32和BDH之间的整个序列同源性大约是39％，对大肠杆菌还原酶和雌二醇17β-脱氢酶的同源性水平较低(分别为31％和33％)。
最适的重复多次的序列排列鉴定出由p32和最密切相关的蛋白质共享的几个保守区域(图4中被圈的区域)。据信包括残基63-69(使用图4中的计数方式)，并显示出保守的基元G-X-X-X-G-X-G的第一个区域是辅因子NAD,NADP或其还原形式的结合位点。在残基148-153之间发现了另一个保守的区域(共有序列L-V-N-N-A-G)，但仍未发现此序列基元具有任何功能性特征。在短链醇脱氢酶中，被认为是活性位点的序列基元Y-X-X-X-K是最高度保守的基元，并存在于p32残基175-179中，见Persson等人，欧洲生物化学杂志，200:537-593(1991)。这些类似性阐明p32显示出短链醇脱氢酶的几个功能性特征。
如图5所示，对p32氨基酸序列的亲水性分析显示出几段疏水性的序列，这表明p32是膜相关蛋白。开始的18个氨基酸是疏水性的，此区域具有典型的信号序列的特征，然而，不能鉴定出信号肽酶裂解的共有位点，见Von Heijne，核酸研究，14:4683-4690(1986)。残基130-150之间的氨基酸是疏水性的，在蛋白质的C-末端附近存在相对长的疏水性序列，因此，p32显示出几个疏水性区域，该区域是潜在的膜跨越区段。根据上文所述的与短链醇脱氢酶家族成员的同源性，p32中央的疏水区(残基130-150)可能不被用作膜锚。实际上N-末端和C-末端区域都是潜在的膜锚着域。
为了测定p32与膜相互作用的模式，通过体外翻译以合成p32，所述翻译使用具有由线性化的pλ321转录的mRNA的网织红细胞裂解物系统进行，所用方法见下文实施例8实施例8通过体外翻译表达p32使用T7 RNA聚合酶由线性化的pλ321合成编码p32的体外转录的mRNA，遵照厂商的说明使用经核酶处理的兔网织红细胞裂解物进行体外翻译反应，每次反应中包括加或不加狗胰微粒体的50ng的mRNA。为了分离插入膜中的p32，在4℃下，以12,000×g的转速离心10分钟以收集微粒体。将微粒体小心地重悬浮于PBS中，并再次离心。
如图6所示，在狗胰微粒体存在下进行的翻译表明p32几乎定量地成为膜相关的蛋白质，并在SDS-PAGE中作为Mτ为32,000的蛋白质类迁移。类似地，缺乏受体膜时进行的翻译产生了Mτ32,000蛋白质。这些资料表明N-末端疏水性序列作为信号序列起作用，但信号肽酶不能将之除去，此现象支持以前的观察结果，即在推导的一级序列中无法鉴定出信号肽酶裂解的共有位点。
通过Northern印迹分析p32的组织表达，所述Northern印迹分析使用了分离自牛RPE，肝脏，肾脏，肾上腺，肺，睾丸，脑和肌肉的总RNA，所用方法见下文实施例9。实施例9Northern印迹分析在处于变性条件下的1％琼脂糖中电泳分离自多种组织的20μg总RNA，并转移到Hybond-N尼龙滤膜上，在严格条件下使滤膜与经32P-标记的编码p32的全长cDNA杂交。总RNA的分离，杂交条件和洗涤方法的细节见于Bavik等人，生物化学杂志，267:20540-20546(1993)先前的描述。
在高严格度下，用pλ321的1.1kb插入物作为探针进行的杂交揭示出对应于p32的转录本仅在RPE中有充足的表达，而在几种其它的组织中却达不到可检测的水平。主要的转录本的大小为1.4kb，但在RPE以及其它组织中，延长滤膜的暴露时间之后可以观察到其它较不丰富的转录本。实施例10p32在COS-细胞中的表达和重组p32特性的酶解分析按下述，使用真核表达载体首先在COS-细胞中表达p32，然后对得自经转染细胞的微粒体组分和对照细胞进行免疫印迹分析以进一步地证实p32在所需水平上的表达具体地说，将pλ321的EcoRⅠ-插入物克隆进经EcoRⅠ消化的真核表达载体pSG5中，见Green等人，核酸研究，16:39(1988)。在添加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺和抗生素的Dulbecco极限必需培养基中培养COS-细胞。将细胞接种于60mm培养皿(4×105个细胞/皿)中，使用DEAE葡聚糖每皿用5μg质粒转染细胞，仅用等量亲代载体转染对照细胞，用10％DMSO处理2分钟后，将细胞温育72-96小时，通过用橡皮淀帚刮擦平皿收获细胞，然后通过低速离心收集细胞，将收集到的细胞沉淀物重新悬浮于低渗缓冲液(含有1mM苯甲基磺酰氟的10mM Tris-HCl,pH7.5)中，在冰上放置20分钟，然后使用Dounce匀浆器匀浆细胞。离心(3000×g)15分钟以除去未破碎的细胞和碎片，随后通过在100,000×g下超速离心1小时以收集微粒体；将膜沉淀物储存于-80℃中直至进一步地分析。
通过给兔注射表达成与GST的融合蛋白形式的p32(氨基酸残基19-318)以产生针对p32的抗血清。按厂商(Pharmacia)的推荐，使用细菌表达载体pGEX 2T，诱导和纯化诱导和GST-融合蛋白。给每只兔皮下注射75μg乳化于弗氏完全佐剂中的融合蛋白，每隔2周，用50μg乳化于弗氏不完全佐剂中的融合蛋白加强免疫兔，每隔2周收集一次血，使免疫兔血清穿过柱，该柱含有固定于经CNBr激活的Sepharose珠上的GST融合蛋白。用含有0.5M NaCl的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.0)洗脱被结合的Ig。为了除去融合蛋白GST部分上的Ig，类似地，将经洗脱的Ig与GST-偶联的Sepharose珠一起保温，使用未结合的Ig组分。为了进行过度表达的蛋白质的免疫印迹分析，Ig的使用浓度为1μg/ml。免疫印迹方法的细节详细描述于Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992)，该文被列入本文参考文献。
如图8A所示，上述方法导致p32在被重组表达载体转染的细胞中表达，但不在被模拟转染的对照细胞中表达。
接着，以类似于在RPE细胞的微粒体组分中研究11-顺式视黄醇脱氢酶活性的方式测定表达于COS-细胞中的p32的酶解特性，见Saari等人，Anal.Biochem,213:28-13226(1993)。
具体地说，通过在辅因子NAD+或NADP的存在下，将得自前述经转染细胞和缺乏p32的对照细胞的微粒体组分与不同立体异构的底物，即11-顺式视黄醇或全-反式视黄醇的变换的组合一起保温即可证实p32的酶解活性。
为了制备底物，如Heller等人，生物化学杂志，248:6308-6316(1973)所述使用硼氢化钠由11-顺式视黄醛合成11-顺式视黄醇，并在80℃下置氩气中保存。HPLC分析证实11-顺式视黄醛定量地还原成11-顺式视黄醇，在柔和的光照条件下进行使用retinoid的所有操作。
为了检测经转染细胞中p32的活性，保温时11-顺式视黄醇和全-反式视黄醇(得自Sigma Chemical Co.)的终浓度降低至100μM。每次保温时使用20μg得自表达p32的COS-细胞或对照细胞的总膜蛋白，随后在NAD+或NADP存在或缺乏的条件下，在37℃下保温30分钟。用n-己烷提取反应混合物，取出有机相，在氩气中干燥，然后将干燥的有机相单独溶解于乙醇中，在普通相硅胶HPLC柱上分析等分试样，该柱用含有4％二戊烷的n-己烷以1ml/分钟的速度展开，见saari等人，生物化学杂志，257:13329-13333(1982)。在330nm下监测流出液，在这些条件下，11-顺式视黄醛和11-顺式视黄醇分别在第7分钟和第22.5分钟时被洗脱出来，全-反式视黄醛和全-反式视黄醇分别在第8分钟和第23分钟时被洗脱出来。
如图8B所示，前述的HPLC分析表明得自经转染细胞的级分含有p32表达的11-顺式视黄醇脱氢酶蛋白，11-顺式视黄醛的形成表示在NAD+存在时该蛋白具有活性。层析谱中的第二个峰是全-反式视黄醛；然而，具有11-顺式视黄醛的对照保温在缺乏细胞膜时表现出在所用的试验方法中，大量的11-顺式视黄醛异构成全-反式视黄醛。这表明全-反式视黄醛的出现是由于在所用的保温过程中和提取程序中产生了全-反式视黄醛，而不是酶解反应产物。另外，全-反式视黄醇与含有p32的细胞一起保温证实了酶的立体特异性，因为没有检测到全-反式视黄醛的显著形成。
如图8C所示，在辅因子NADP存在下，p32不具有酶解活性。
在图8D中，对不表达p32的对照细胞的检测表明这些细胞不能将11-顺式视黄醇氧化成11-顺式视黄醛。
因此，由上文所述可得出结论p32是立体特异性的11-顺式视黄醇脱氢酶，它依赖NAD+作为它的辅因子。实施例11根据上述的工作，使用牛的材料，进行另外的实验以分离和克隆人序列。
得自人眼，位于λgt11中的cDNA文库购自厂商(即Clontech)，将上述文献中所述的牛cDNA，即SEQ ID NO:10用作探针，通过随机引发至高比活(约109cpm/μg DNA)用32[P]dCTP标记cDNA。
然后使用经标记的牛cDNA探测人cDNA文库，条件如下在68℃下，6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s溶液，25％甲酰胺中与100μg/ml的鲑精DNA杂交，接着在65℃下，用2×SSC，0.5％SDS洗涤四次，每次30分钟，最后在42℃下，用2×SSC洗涤30分钟。
当发现阳性cDNA时，根据厂商的说明切下插入物(即cDNA)，然后亚克隆至可商购的载体pBluescript中，使用熟知的方法测定插入物的序列，1128个核苷酸的序列列于SEQ ID NO:14中，相应的318个残基的氨基酸序列列于SEQ ID NO:15中。实施例12在进一步的实验中，使用上述实施例11中的资料研究和分析牛神经视网膜和鼠10天的胚胎，使用鼠胚胎是因为除了该系统用于研究发育生物学的一般性用途之外，在发育中视黄醇脱氢酶也十分活跃。此模型可外推至人的发育。
使用熟知的技术，从牛的神经视网膜或鼠的10天胚胎中分离RNA(5-10μg)，在4μl 5×AMVRT缓冲液中，将RNA与4μl得自5mM储存液的dNTP，2μl的寡dT(18聚体，终浓度为10μM)，以及0.5μl RNAse抑制剂，2μl禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(10U)相混合，终体积为20μl。在42℃下保温所得的混合物30分钟，然后置于冰上直至使用。
然后进行PCR，在PCR中，使用了2μl cDNA，根据上文列出的牛eDNA的推导的氨基酸序列设计引物，下文注明的是保守的氨基酸序列A)Cys Asp Ser Gly Phe GlyB)Pro Gly Trp Asp AlaC)Glu Ala Phe Ser AspD)His Pro Arg Thr“A”对应于SEQ ID NO:12的氨基酸36-41,“B”见于此序列的氨基酸283-287,“C”见于第183-187位，“D”位于第276-279位。本文所用的“保守的”是指推导出的序列和肝脏RDH序列之间的保守性，后一序列见于Chai等人，生物化学杂志，270:3900-3904(1995)(全文列入本文参考文献)和Simon等人，生物化学杂志，270:1107-1112(1995)(也被列入本文参考文献)。
制备简并的寡聚体，在第一套PCR实验中，以A和B为基础的简并寡聚体被用作引物，即5′-ACGTGAATTCTGYGAYTCNGGNWTYGG-3′(SEQ ID NO:16)5′-ACGTGAATTCTTNGCRTCCCCANCC-3′(SEQ ID NO:17)分别被用作正向和反向引物。将引物与2μl上文讨论的cDNA混合，条件是94℃下变性1分钟，50℃下退火1分钟，72℃下延伸2分钟，这些构成1轮循环，进行25轮循环。
第一套PCR之后，将5μl PCR产物的样品与以“C”和“D”为基础的引物混合，即5′-ACGTGAATTCGARGCNTTYTCNGA-3′(SEQ ID NO:18)5′-ACGTGAATTCCGNGTNCKNGGRTG-3′(SEQ ID NO:19)分别被用作正向和反向引物。除了退火温度为55℃外，所用条件与第一套实验中完全相同。
在含有溴化乙锭的1.5％琼脂糖凝胶中分析反应产物，假定扩增产物的长度应为约300个碱基对，因此，能观察到的任何300个碱基对的带可证实PCR方案产生了适当大小的产物。使用1％的低融点琼脂糖凝胶重复实验，从中洗脱出PCR产物，使用相同的方案重新扩增分离的产物，并将该产物克隆到质粒中(TA克隆试剂盒，Invitrogen)，使用标准的方法从转化子中制备质粒DNA，然后通过使用EcoRⅠ进行限制性消化分析所述DNA，使用载体特异性的引物进一步地分析约为300个碱基对的任何插入物。PCR产物示于SEQ IDNO:20-23中，从中推导出的氨基酸序列示于SEQ ID NO:24-27中。SEQ ID NO:20和24对应于牛序列，而所有其它的序列为鼠序列。在这些核苷酸序列中，第一个碱基(“C”)是实验的人为假象，是由限制性核酸内切酶裂解造成的。因此，测定推导的氨基酸序列时，序列从第二个核苷酸碱基开始。另外，应注意未包括正常情况下应被包括在5′和3′末端的对应于简并寡聚体的序列。实施例13在进一步的探测实验中，使用SEQ ID NO:19列出的PCR产物。
使用随机标记的SEQ ID NO:22筛选鼠8.5天的cDNA文库(于λgt10中)，其中在42℃下，6×SSC,0.5％SDS,5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺中与100μg/ml的鲑精DNA发生杂交，接着在50℃下，用2×SSC,0.5％SDS洗涤1次，时间为30分钟。鉴定阳性的cDNA克隆，亚克隆至pBluescript中并测定其序列。核苷酸序列和推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO:28和29。实施例14根据上述的工作，使用人cDNA探测人基因组文库，通过PCR制备探针，并如上文所述随机标记探针。
PCR中所用的引物衍生自SEQ ID NO:11的cDNA序列，引物如下正向引物5′-GCTTCGGGCGCTGTAGTA-3′(SEQ ID NO:30)和反向引物5′-AAAACAATCTCTTGCTGGAA-3′(SEQ ID NO:31)。
通过在95℃下变性，55℃下退火，72℃下延伸进行PCR，使用2-5U的Taq聚合酶和0.2μM的各种引物，进行30轮循环。
琼脂糖凝胶电泳分析之后，分离1056bp的扩增片段并将它克隆到载体PCR(可购自Invitrogen)中。使用此探针筛选得自Stratagene的λFⅫ载体中的人基因组文库。按照厂商的说明筛选大约1×106个噬斑形成单位，使用106cpm/ml杂交溶液，在42C下，6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt′s溶液，50％甲酰胺中与100μg/ml的鲑精DNA杂交过夜，接着在50℃下，用1×SSC,0.1％SDS洗涤1次，最后在65℃下，用0.5×SSC,0.1％SDS洗涤，每次洗涤30分钟。分离并重新筛选几个阳性噬斑，使用Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(第二版，1989)(列入本文参考文献)中描述的甘油分级梯度法制备λDNA。
通过每次反应使用100mg基因组λ克隆作为模板，分析PCR反应之后得到的片段来测定分离的基因组克隆的序列。为了进行PCR，在计数为‘1’和‘2’的两套PCR反应中使用不同的引物，所述引物衍生自SEQ ID NO:11的cDNA序列。
具体地说，PCR反应1中所用的引物是SEQ ID NO:30，见上文(正向引物)和5′-CTCAGGCTGTCAGAGAAGGCCT-3′(SEQ ID NO:32)(反向引物)PCR反应2中所用的引物是5′GACGATTTCCAGCGGGTGC-3′(SEQ ID NO:33)(正向引物)和SEQ ID NO:31，见上文通过在95℃下变性，55℃下退火，72℃下延伸进行PCR，使用2-5U的Taq聚合酶和0.2μM的各种引物，进行30轮循环。得自反应1和2的扩增片段分别为2.2kb和2.5kb，将每个片段克隆到可购自Invitrogen的载体PCR中。
使用载体特异性的引物或内部引物对克隆片段进行的序列分析可鉴定出外显子一内含子边界。
基因的结构示于图9。实施例15进行研究以鉴定基因在染色体上的位置。
为此，从人白细胞，中国仓鼠细胞，鼠肝脏细胞和仓鼠/人，小鼠/人体细胞杂合细胞系中分离高分子量的DNA，这些杂合细胞系各保留了一个人染色体以及啮齿动物基因组。
用HindⅢ消化分离的DNA，通过电泳在琼脂糖凝胶上分级分离所述DNA，然后转移到尼龙滤膜上，使用按上述方法标记的上述人cDNA探测这些DNA。
使用本技术领域公知的技术，从淋巴细胞培养物中制备染色体的玻片，混合得自3个基因组克隆的λDNA，并通过切口平移用生物素化的16-dUTP标记上述λDNA，按照厂商的说明，用荧光红-dUTP标记人染色体12着丝粒(得自ATCC，保藏号为D12Z1)的着丝粒特异性探针。探针的预退火，玻片的预处理，杂交条件，信号扩增和检测遵照众所周知的技术。用4,6二氨基-2-苯基-吲哚(DAPI)复染染色体，使用荧光显微镜观察信号。
对所有这些资料的分析表明人11-顺式RDH的基因跨越了4千个碱基以上，该基因被分成4个编码外显子，长度范围是165-342个碱基对。另外，在5′非翻译区也发现了一个外显子，最后一个编码外显子的长度仍未确定。内含子的长度范围为250个碱基对-1.9千个碱基，图9显示了此图解说明。
对外显子/内含子边界的研究表明所有的剪接供体和受体位点都遵照众所周知的规范的GT/AG规则。起始密码子和保守的辅因子结合位点由外显子2编码，而具有不变的酪氨酸残基的活性位点由外显子3编码，人11-顺式RDH的基因被定位于染色体12q13-14。实施例16使用SEQ ID NO:21和22中列出的核酸分子延续实施例12中所做的工作。
使用可商购的鼠源，多组织Northern印迹。具体地说，使用标准的方法学，用32p标记SEQ ID NO:21和22中列出的核酸分子。然后使用标准的Northern印迹方法，用这些经标记的探针来测定鼠组织样品中转录本的相对表达水平。在42℃下，使用50％甲酰胺，6×SSPE缓冲液，0.5％SDS,2×Denhardt′s溶液，100μg/ml的鲑精DNA和1×106cpm/ml的经标记的探针杂交印迹过夜。在室温下用2×SSC,0.1％SDS洗涤印迹两次，每次洗涤30分钟，接着在50℃下，用含有0.1％SDS的0.1×SSC再洗涤两次。使用增感屏和柯达胶卷将印迹暴露于-70℃下过夜，肉眼观察到的相对表达水平如下所示探针组织SEO ID NO:21SEO ID NO:22心脏 - -脑 - ++脾脏 - -肺 - -肝脏 +++++ +++++骨骼肌 - -肾脏 +++ +++睾丸- -实施例17考虑到实施例16的结果，在本实施例描述的实验中使用鼠肝脏，使用标准方法，在λZAP中制备鼠肝脏cDNA文库。使用上文实施例16中描述的探针筛选文库，具体地说，按照厂商的说明将文库铺平板并制备滤膜。在42℃下，50％甲酰胺，6×SSPE缓冲液，2×Denhardt′s溶液，100μg/ml的鲑精DNA中进行预杂交，然后使用1×106cpm/ml的杂交溶液杂交滤膜，过夜杂交之后，用含有0.1％SDS的2×SSC洗涤滤膜两次(52℃，每次洗涤30分钟)，接着在52℃下，用含有0.1％SDS的0.1×SSC再洗涤两次，每次洗涤20分钟。然后按上文所述暴露滤膜，重新筛选任何阳性的克隆两次直至平板上所有的噬斑皆为阳性。使用标准方法，通过体内切割将得自几个阳性克隆的插入物亚克隆至质粒pBluescript SK(+)，测定所得的几个克隆的序列。
当SEQ ID NO:21被用作探针时，鉴定了3个不同的cDNA，在本文中它们被表示为SEQ ID NO:32,33和34。当SEQ ID NO:22被用作探针时，发现了SEQ ID NO:35。由此推导的氨基酸序列分别被表示为SEQ ID NO:36-39。
因此，如上所述，本发明提供了分离和鉴定新的蛋白质，即p32的方法，该蛋白质与RPE的p63相关。p32的一级结构阐明它具有功能性的短链醇脱氢酶的所有关键性的特性，包括推定的辅因子结合位点和催化机制所涉及的必需的残基，即几乎不变的含有序列基元Y-X-X-X-K的酪氨酸(Persson等人，欧洲生物化学杂志，200:537-543(1991))。受限的组织表达和RPE中p32的丰度表明此蛋白质行使的功能对RPE而言是独一无二的。这种可能性和下列事实表明p32的底物是retinoid，所述事实是p32与p63形成复合物，而该复合物以前已显示出是RPE-细胞中retinoid摄取机的组分(Bavik等人，生物化学杂志，267:23035-23042(1992))。
RPE-细胞中retinoid代谢的主要代谢步骤是11-顺式视黄醇转变成11-顺式视黄醛。根据上文得到的显示出p32在RPE中受限的表达的结果，以及此蛋白质的特殊生化特性，进一步的研究证实了p32实际上是催化此反应的11-顺式视黄醇脱氢酶。
因此，本发明的一个方面是产生重组的11-顺式视黄醇脱氢酶的能力，与使用标准生化方法学得到的产品相比，此重组酶可被用于生产较高水平，较纯形式的11-顺式视黄醛。因此，在此上下文中，可使用本发明的包括SEQ ID NO:10的分离的核酸分子，以及在严格条件下可与SEQ ID NO:10杂交的那些核酸分子。术语“严格条件”指的是在68℃下，6×SSC,0.5％SDS,5×Denhardt′s溶液中与100μg/ml的鲑精DNA杂交，最后在50℃下，用0.5-1.0×SSC洗涤。本文中使用的此术语也指至少与上文中所述条件同样严格的任何套参数。众所周知，通过改变一个参数使之较不严格，同时改变另一个参数以增加其严格度可产生同样的严格条件。因此，预期满足本文所列的杂交标准的任何核酸分子编码p32或p32同系物。可在如上所述的体外系统中生产酶，或通过用本发明的核酸分子转染或转化真核或原核细胞系，如CHO和COS细胞或如大肠杆菌的细菌菌株或酵母菌株啤酒糖酵母(S.cervisiae)来生产酶。在特别优选的实施方案中，核酸分子被包含在与启动子有效连接的表达载体内。优选互补的DNA，或“cDNA”，但也使用基因组DNA和mRNA。
考虑到非眼组织中发生的retinoid代谢，重要的是鉴定作为短链醇脱氢酶特大家族中的成员的p32，即11-顺式视黄醇脱氢酶。研究表明由全-反式视黄醇产生全-反式视黄酸以两步法进行(Posch等人，生物化学，30:6224-6230(1991))，第一步，通过膜结合的视黄醇脱氢酶将视黄醇氧化为视黄醛，第二步，视黄醛被氧化成视黄酸。因此，发生于非眼组织中的视黄醇氧化为视黄醛的过程类似于视循环中由11-顺式视黄醇合成11-顺式视黄醛的过程中进行的反应。根据这些相似性，可建议使用结构类似于本发明分离的p32 11-顺式视黄醇脱氢酶的酶由全-反式视黄醇形成全-反式视黄醛。与目前持有的观点相比，这些发现是令人惊奇的，因为一般认为此代谢步骤是由中等链长的醇脱氢酶成员进行的，见Duester,Alcohol Clin.Exp.Res,15:568-572(1991)；Yang等人，Alcohol Clin.Exp.Res,17:496(1993)和Zgombic-Knight等人，生物化学杂志，269:6790-6795(1994)。因此，由本发明提供的p32 11-顺式视黄醇脱氢酶的鉴定和结构特征描述也提供了以前无法预期的途径，该途径可用于分离和鉴定类似的涉及非眼组织中视黄醇代谢的脱氢酶。
p32蛋白和编码它的核酸以及本发明的其它方面还有很多其它重要的用途，例如，正如上文所述，p32是寡聚体蛋白质复合物的一部分，该复合物在RPE-细胞中作为RBP的膜受体起作用，在表型/基因型诊断分析中可使用编码p32的核酸序列以测定可导致色素性视网膜炎的retinoid积累。
另外，如上所述，p32具有11-顺式视黄醇脱氢酶的活性，该酶可催化11-顺式视黄醇转变成11-顺式视黄醛，在RPE-细胞的retinoid代谢中，这是由膜结合的脱氢酶进行的主要代谢步骤。因此，retinoid的积累直接或间接地依赖p32的存在和/或其激活或抑制，例如，它与RBP受体p63的复合物的形成。
在其它应用中，可检测治疗与p32 11-顺式视黄醇脱氢酶活性有关的多种疾病的潜在的retinoid药物的效果，因为这种药物对酶有不利的作用，因此可测定出不同药物中的哪一种对酶活性的不利作用受到限制或哪一种没有不利的作用。
这种疾病的例子包括眼睛和皮肤的那些障碍，如牛皮癣和痤疮。通过retinoid药物也可检测如T-细胞白血病的某些癌症，因此这些药物是检测p32活性的候选药物。
retinoid多种已知的功能也暗示通过检测与特殊的视黄醇结合蛋白有关的p63/p32受体复合物的水平可诊断出多种其它的与retinoid有关的病理学状态。可使用本技术领域熟知的技术，如免疫测定法等等来测定p63/p32受体复合物的水平是否太低或太高，即是否在正常水平上不符。
另外，由于p32与RPE细胞中retinoid摄取机制的p63组分复合，它也可以用于治疗，因为众所周知可溶性的受体可被用于预防蛋白质与其膜-联受体结合。因此，通过施用可溶性受体复合物或抗体即可治疗因视黄醇结合蛋白的产生水平增高而鉴定出的受试者，所施用的量应足以抑制视黄醇结合蛋白或其它相关分子与其靶，即p32视黄醇脱氢酶活性的抑制剂的结合。本发明的其它方面对于本领域熟练的技术人员而言是显而易见的，本文无需重复。
在另一个应用中，通过抗体与体液或组织样品的结合分析可产生针对p32的单克隆和多克隆抗体，所述抗体对于监测因视黄醇结合蛋白受体水平异常而鉴定出的病理学状态的病例特别有用。通过例如使用Bavik等人，生物化学杂志，268:20540-20546(1993)所述的产生包括mAb A52的针对p63的抗体的方法可产生针对p32的抗体。
所使用的术语和表达仅用于描述而不是为了限制本发明，在使用这些术语和表达时不想排除所示和所述特征的任何等价物或其部分，我们认为多种修饰可以包括在本发明的范围之内。
(1)一般信息(ⅰ)申请人ERIKSSON等人(ⅱ)发明名称编码具有11-顺式视黄醇脱氢酶活性的32 KDa蛋白质的分离的核酸分子，所述蛋白质与作为视黄醇结合蛋白受体的一部分的p63相关(ⅲ)序列数目39(ⅳ)联系地址(A)联系人Felfe&Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约(D)州纽约(F)邮编10022(ⅴ)计算机的可读形式(A)介质类型软盘，3.5英寸，144kb内存(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅶ)在先申请资料(A)申请号08/562,114(B)申请日1995年11月22日(ⅶ)在先申请资料(A)申请号08/375,962(B)申请日1995年1月20日(ⅶ)在先申请资料(A)申请号08/258,418(B)申请日1994年6月10日(ⅷ)代理/代理人资料(A)姓名Hanson,NormanD(B)登记号30,946(C)参考文献/文档号LUD 5372.3-PCT(ⅸ)电信资料(A)电话(212)688-9200(B)电传(212)838-3884SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Leu Val Glu Ala Val Leu Ala Glu Val Leu Pro Lys Pro Ala Gln Thr5 10 15Val AlaSEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Tyr Ser Pro Gly Trp Asp Ala Lys5SEQ ID NO:3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度15个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu Asp Thr Leu Gln Ala5 10 15SEQ ID NO:4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Asp Val Ala Pro Phe Gly Val5SEQ ID NO:5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度14个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Leu His Thr Thr Leu Leu Asp Val Thr Asp Pro Gln Ser Ile5 10SEQ ID NO:6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6ACGTGAATTC TNGTNGARGC NGT 23SEQ ID NO:7的资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7ACGTGAATTC ACNGTYTGNG CNGGYTT 27SEQ ID NO:8的资料
(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8ACGTGAATTC CCNGTNACNA AYYT 24SEQ ID NO:9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9ACGTGAATTC GCYTGNARNG TRTCYTC27SEQ ID NO:10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1122个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词p32；11-顺式视黄醇脱氢酶(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10AGCTTTCCCC TGAGGAGGTC ACCTGGGCTC CAGCC ATG TGG CTG CCT CTG CAG 53Met Trp Leu Pro Leu Leu5TGC CTG CTG CTG GGT GTC TTG CTC TGG GCA GCA CTG TGG TTG CTC AGG 101Leu Gly Val Leu Leu Trp Ala Ala Leu Trp Leu Leu Arg Asp Arg Gln10 15 20GAC CGG CCA GCC AGC GAT GCC TTT ATC TTC ATC ACC GGC TGT GAC TCG149Cys Leu Pro Ala Ser Asp Ala Phe Ile Phe Ile Thr Gly Cys Asp Ser25 30 35GGC TTT GGG CGG CTC CTT GCT CTG AGG CTG GAC CAG AGA GGC TTC CGA197Gly Phe Gly Arg Leu Leu Ala Leu Arg Leu Asp Gln Arg Gly Phe Arg40 45 50GTA CTG GCC AGC TGC CTG ACA CCC TCG GGG GCG GAG GAC CTC CAG CGG245Val Leu Ala Ser Cys Leu Thr Pro Ser Gly Ala Glu Asp Leu Gln Arg55 60 65 70GTC GCC TCC TCC CGC CTC CAC ACC ACC CTG CTG GAT 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(A)名称/关键词PCR克隆200(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26Ser Leu Arg Arg Asp Met Ala Pro Phe Gly Val Gln Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Ser Leu Glu20 25 30Ser Thr Leu Lys Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Ile Gln Ala35 40 45His Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Asp Thr His Leu Arg Val Gln Arg Arg50 55 60Ile Met Asn Leu Ile Cys Asp Pro Glu Leu Thr Lys Val Thr Ser Cys6570 75 80Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85SEQ ID NO:27的资料(ⅰ)序列特征(A)长度88个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅸ)特征(A)名称/关键词PCR克隆215(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27Ser Leu Arg Arg Asp Val Ala Pro Phe Gly Val Arg Val Ser Ile Val5 10 15Glu Pro Gly Phe Phe Arg Thr Pro Val Thr Asn Leu Glu Thr Leu Glu20 25 30Gly Thr Leu Gln Ala Cys Trp Ala Arg Leu Pro Pro Ala Thr Gln Ala35 40 45Leu Tyr Gly Glu Ala Phe Leu Thr Lys Tyr Leu Arg Val Gln Gln Arg50 55 60Ile Met Asn Met Ile Cys Asp Pro Asp Leu Ala Lys Val Ser Arg Cys65 70 7580Leu Glu His Ala Leu Thr Ala Arg85SEQ ID 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Cys Ser Asn Thr Gln Met Leu Trp Asp Gln Thr Ser3540 45Ser Glu Ile Arg Glu Ile Tyr Gly Glu Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu5055 60Lys Arg Leu Asn Glu Leu Asp Lys Arg Cys Asn Lys Asp Leu Ser Leu6570 75 80Val Thr Asp Cys Met Glu His Ala Leu Thr Ala Cys His Pro Arg Thr85 90 95Arg Tyr Ser Ala Gly Trp Asp Ala Lys Leu Phe Tyr Leu Pro Leu Ser100105 110Tyr Leu Pro Thr Phe Leu Val Asp Ala Leu Leu Tyr Trp Thr Ser Leu115 120 125Lys Pro Glu Lys Ala Leu130SEQ ID NO:30的资料(ⅰ)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词正向引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30GCTTCGGGCG CTGTAGTA18SEQ ID NO:31的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅸ)特征(A)名称/关键词反向引物(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31AAAACAATCT CTTGCTGGAA20SEQ ID NO:32的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1613个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32CATCCATACT GGTCAGAGGA ACATGATAGA AACCTGACATTCTCAGTGCC TATACCTTCT TGTGTAACCA GCGGCCAGCCTCATTTTGAC ACAGAATATC TCTCTCTGCT TGACTTCCACAAACCATGTG GCTCTACCTG GTTGCACTGG TGGGCCTGTGGACGCTCCTG CGCTTCTTCA GGGAGAGGCA GGTAGTGAGCCATCTCCAAG ACAAGTATGT CTTCATCACG GGCTGTGACTCTGGCTTTGG GAATCTTCTG GCCAGAGAAC TGGACAGGAGAGGCATGAGG GTGCTAGCTG CATGTCTGAC GGAGAAGGGAGCTGAGCAGC TGAGGAACAA GACATCTGAC AGGCTGGAGACAGTGATCCT GGATGTCACC AAGACAGAGA GTATTGTGGCAGCCACTCAG TGGGTGAAGG AGCGTGTTGG GAACAGAGGACTCTGGGGCC TGGTCAACAA TGCTGGCATC TGTGTCTTTGCTATCAATGA GTGGCTGAAA AAAGAGGACT TTGCAAATATACTGGATGTG AACCTGTTGG GCATGATCGA GGTGACTCTGAGCATGCTGC CCTTAGTGAG GAAGGGGAGG GGCCGTGTGTTCAACATCTC CACCTCCATG GGTCGAGTGT CTTTGTGTGGTGGTGGTTAC TGCATCTCCA AGTATGGTGT AGAGGCCTTCTCAGACTCCC TCAGGAGGGA GATCTCCTAT TTTGGGGTGAAGGTGGCTAT CATAGATCCT GGCGGGTTCA GGACTAATGTCTCCAACTAC GATAGGCTAT CACACAGCAT AGAGAAGCTGTGGGACCAGA CATCCTCGGA GGTCAAGGAG GTCTATGACAAGAATTTTCT GGACTCCTAT ATCAAAGCAA TACAGTCATTGACATACACA TGCTCAGATG ACCTGTCTGT GGTAACTGACTGCATGGAGC ACGCTCTGAC TGCCTGTCAC CCTCGCACAAGATACTCAGC TGGCTGGGAT GCCAATCTCT TCTACCTACCCTTGAGCTAC ATGCCCACCT TCCTGGTAGA TGCCATGTTGTACTGGAGCT CTGTAAAGCC TGCCCAAGCC CTGTGAATCTGCACGTGTGT GCATACTTGT GGCGGGTGGA GGGATATAATGGCATAGGGC ATGTGGTTCT TGAGACTCAT 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CACTCTCCTGTGGTCCTCCT CTGCAGGAAA TGTACATGCC CTGGCTAGTTTAAACCCCTA TGCAAGATGG AATTSEQ ID NO:34的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1240个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34CTTCTCTCTC TCTCTCTCTC TCTCTCCTCT TCTACAAACCATGTGGCTCT ACATGGTGGC GCTACTGGGC CTGTGGATGCTCCTGCGCTT TTTTAGAGAG AGGCAAGTGG TGGACCATCTTCAAGACAAG TATGTCTTCA TCACAGGCTG TGGCTCTGGCTTTGGGAACT TGCTGGCCAG ACAGCTGGAC AGGAGAGGCATGAGAGTGTT GGCTGCATGT CGGAAGGAGG ATTGAGCCGAGGAGCTGAGG AGAAAGACAT CAGAAAGGCT GGAGACAGTGATCCTGGATG TCACCAAGAC AGAGAATATT GTGGCAGCCACTCAGTGGGT GAAGGAGCGT GTTGGGAACA GAGGACTCTGGGGCCTGGTC AACAACGCTG GCACCTCCGT CCCCTCGGGTCCCAACGAGT GGATGAAAAA ACAGGACTTT GCAAGTGTACTGGATGTGAA CCTGTTGGGC TTGATCGAGG TGACTCTGAGCATGCTGCCC TTAGTGAGGA AGGCGAGGGG CCGTGTGGTCAACGTCTCCA GCATCTTGGG CATATTGTCA CTTGGTGGTAGTGGTGGTTA CTGCATCTCC AATTATGGTA TAGAGGCCTTCTCAGACTCC CTTAGGAGGG ACGTCCGCTA CTTTGGGGTGAAGGTGGCTA TTATAGAGCC TGGCTTCTTC CTGACTGGTATGGCCATCAG TGCCAGATTA TGCTCAAACA TCCAGATGCTGTGGGACCAG ACCAGCTCAG AAATGCGGGA GATCTATGGAGAGAAATACC 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VAATCDWKIR VGNRELWGLV NNAGICVFAINDWLKKEDFA NILDVNLLGM IEVILSMIPL VRKARGRVFNISSSMGRVSL CGGGYCISKY GVEAFSDSLR REISYFGVKVAIDFPGCERC NVSNYERLSH SIEKINDQTS SEVKEVYDKNFLDSYIKAIQ SLTDTCSDDL SVVIDQMEKA LTRCKPRIKYSAGWDAKLFY LPLSYMPIFL VDRMLYNSSV KPACALSEQ ID NO:37的资料(ⅰ)序列特征(A)长度317个氨基酸(B)类型蛋白质(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37MALYLVALVG LWLLLRFFRV RQVVEHKCDK YVFITGCDSGFGTLLARCLD RRGMRVLAAC LTEKGAEELR NKTSDRLETVILDVTKTESI VIATQWVKEH VGNRGLWGLV NNASISTPSGPNEWMKKCDF AHVLDVNLLG MIEVTLSMLP LVRKARGRVVNVSSVMGRVS LFGGGYCISK YGVEAFSDSL RRFLRYFGVKVAIIFPGFFL TGVTSSARLC SNTCMLWCQT SSEIREIYGEKYLASYLKRL NKLDKKCNKD LSGVIDCMER ALTACFPRTRYSAGWDAKIF YLPLSYLPTF LVDALLYWTS LRPEKALSEQ ID NO:38的资料(ⅰ)序列特征(A)长度318个氨基酸(B)类型蛋白质(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38MLYMNVALLG LWMLLRFFRE RCVVDELCDK YVFITGDGSGFGNLLARQED RRGMRVLAAC RKEEGAFFLR RKTSERLETVILDVIKTENI VAATQWVKER VGNRGLWGLV NVAGISVPSGPNEWMKKCDF ASVLDVNLLG LIEVTLSMLP LVRKARGRVVNVSSILGRVS LGGSGGYCIS KYGIEAFSDS LRRDVRYFGVKVAIIEPGFF LTGRCSSARL CSNIGMLWDQ TSSDMREIYGELYLASYLKN 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权利要求
1．编码经SDS-PAGE测定分子量约为32千道尔顿的哺乳动物蛋白质的分离的核酸分子，其中所述蛋白质与经SDS-PAGE测定分子量约为63千道尔顿的视黄醇结合受体复合，其中所述分离的核酸分子的互补序列在严格条件下能与SEQ ID NO:10的核苷酸序列杂交。
2．权利要求1的分离的核酸分子，其中所述哺乳动物蛋白质是人蛋白质。
3．权利要求1的分离的核酸分子，其中所述哺乳动物蛋白质是鼠蛋白质。
4．权利要求1的分离的核酸分子，包括cDNA。
5．权利要求1的分离的核酸分子，包括基因组DNA。
6．权利要求2的分离的核酸分子，由SEQ ID NO:14组成。
7．权利要求2的分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
8．权利要求2的分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
9．权利要求3的分离的核酸分子，其编码SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
10．表达载体，含有与启动子有效连接的权利要求1的分离的核酸分子。
11．表达载体，含有与启动子有效连接的权利要求2的分离的核酸分子。
12．用权利要求10的表达载体转化或转染的细胞系或细菌菌株。
13．用权利要求11的表达载体转化或转染的细胞系或细菌菌株。
14．编码具有视黄醇脱氢酶活性之蛋白质的分离的核酸分子及其互补序列，所述核酸分子的互补序列在严格条件下能与至少一个选自由SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23组成之组的核酸分子杂交。
15．权利要求14的分离的核酸分子，选自由SEQ ID NO:20,22和23组成的组。
16．权利要求14的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子选自由SEQ ID NO:32,33,34和35组成的组。
全文摘要
根据本发明,发现了RPE细胞膜相关蛋白,经SDS－PAGE测定,该蛋白质的分子量约为32KDa,被称为“p32”的此蛋白质与以前已鉴定的RBP膜受体组分p63蛋白形成寡聚体蛋白质复合物。已分离出编码p32蛋白的核酸分子,序列分析表明p32蛋白属于短链醇脱氢酶家族,并表现出11－顺式视黄醇脱氢酶的活性,所述酶可催化11－顺式视黄醇转变成11－顺式视黄醛。
文档编号C12N15/12GK1207768SQ96199479
公开日1999年2月10日 申请日期1996年11月14日 优先权日1995年11月22日
发明者乌尔夫·埃里克松, 安备雷斯·西蒙, 安娜·罗默特 申请人:路德维格癌症研究所