专利名称：一种用于植物耐旱的新的dna标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于植物耐旱的新DNA标记。
背景技术：
在植物中通常是采用纯系作图群体来获得DNA标记。这在生殖阶段周期很长时是不实用的。在纯系繁殖群体中已经进行了性状相关的DNA标记开发(纯等基因系-RIL/近似等基因系-NIL)，其集中在性状相关的生理参数。这是费时的过程，花费了许多年以获得RIL和NIL。进一步与任何一个表型的参数的相关，通常不能提供直接与数量性状相关的DNA标记。
到现在为止大多数已知耐旱标记显示出与一个或另一个与性状有关的生理学参数相关。关注的不同表型通常是生态系统特异性的，因此在植物实验室中不能用于快速和精确鉴定/筛选种质。
发明目的本发明的目的是建立一种用于植物耐旱的新DNA标记。
本发明进一步的目的是提供一种用于植物实验室中生态环境特异性栽培的精确选择DNA标记。
本发明更进一步的目的是提供一种通过植物耐旱性育种以获得改良品种的DNA标记。
本发明的另一个目的是提供一种用于植物中耐旱性的快速诊断的DNA标记。
本发明的另一个目的是提供一种用于开发改良品种中植物转化基因鉴定的DNA标记。
发明简述依照本发明，提供了一种用于植物耐旱的新DNA标记，该DNA标记包含一段扩增的1400bp片段。
根据本发明，提供了一种开发耐旱DNA标记的方法，包括从冷冻嫩叶提取基因组DNA，使这样获得的DNA经历标定步骤，对经过标定的DNA进行分析步骤。无性系分析的DNA片段，对DNA片段进行测序以获得DNA标记。
发明详述用于建立该DNA标记的方法是新的，因为其是通过与特定性状的精确相关获得，并能快速评价生化标记。使用这个新颖的，非显而易见的，具有创造性的方法，已经确定了耐旱DNA标记。
提取基因组DNA将200mg冷冻嫩叶用于DNA分离。使用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)法提取DNA，获得平均20μg的DNA。琼脂糖凝胶电泳后，使用定量的DNA作为标准，根据溴乙啶荧光标定DNA。
RAPD研究在含有25μm dNTPs，40ng引物和0.3μl Taq DNA聚合酶的总体积为25ul的PCR反应混合物中，使用来自各无性系的嫩叶DNA作为模板，进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析。45个循环，退火温度为36℃进行反应。使用11个随机的十聚体引物如OPAB06、OPAB18、OPAH18、OPAH02、OPAB17、OPAC19、OPAH12、OPAL04、OPAA02、OPAG13和OPAL08获得的PCR产物，用1.2％琼脂糖凝胶分离，然后在存在溴乙啶的情况下用UV光显影。在各无性繁殖内随机选择的植物的RAPD分析证实了在各无性繁殖系区域内植物的遗传均一性(数据未呈现)。为了用于本研究，采用了比较分析获得的短的列出的(以耐旱性/敏感性为基础)无性系。为了用于本研究，对10个短的列出的(以耐旱性/敏感性为基础)无性系进行了比较分析。用收集的各无性系区域中随机选择之植物的叶，重复此RAPD研究(每组10个无性系)。在
图1a中显示了RAPD模式图的典型凝胶影像。图1b显示相同引物在4个在田间显示耐旱的无性系的基因组上的RAPD模式图(那也存在于图1a中)(图1b未用于给RAPD条带打分)。
在RAPD研究中使用的引物，在全部10个无性系均观察到RAPD条带的总数，存在单态/多态性条带的总数，获得的多态性条带的百分数在表1中给出。
与逆境相关的同功酶活性在提取缓冲液中提取离脱的(水胁迫)，茶嫩叶，然后提取物在非变性凝胶上跑胶。通过把凝胶浸入适当的反应混合液中，使同功酶在凝胶中反应，来研究酶的活性，接着把凝胶浸入合适的染色液来终止酶活性。
SOD和APX活性
在用于SOD(EC 1.15.1.1)的50mM磷酸钾(pH-7.8)缓冲液，与用于APX(EC 1.11.1.11)100mM磷酸钠(pH-7.8)缓冲液中对分离的叶匀浆。电泳分离之后，接着把凝胶浸入到合适的染色液中，在非变性活性凝胶(12％聚丙烯酰胺)上观察提取物中的酶活性。
通过在N，N，N1，N1-四甲基乙二胺(TEMED)和核黄素之间的反应中产生的O2-来还原硝基四氮唑蓝(NBT)，显示电泳分离的SOD同功酶。由于缺乏被同功酶活性除去的O2-，代表同功酶的条带保持无色；由于还原的NBT，剩余的凝胶被染为蓝色。光密度扫描(在632.8nm)负染色的同功酶活性条带在图2a中显示。
APX活性凝胶染色相似，除了不用核黄素而采用H2O2和抗坏血酸产生O2-。在凝胶成像装置(Image Master VDS，Pharmacia Biotech)中记录同功酶条带的负染色。负染色的同功酶活性条带在632.8nm扫描；光密度扫描的代表图像在图2b中显示。
使用回归分析，通过同功酶活性和DNA指纹之间的相关分析以得到特异性的耐旱DNA标记使用同功酶分析(SOD和APX)的数据和RAPD条带进行回归分析。使用多重回归分析方法，分析SOD活性和APX活性与RAPD标记之间的相关性。酶活性也就是视为从属变量的适当的超氧化物歧化酶(SOD)和APX同功酶(峰区)和视为独立变量的不同RAPD谱带(标记1作为存在谱带和0作为缺失谱带)。回归分析以如下模型为基础Y＝a+b1m1+b2m2+-----bjmj+------bnmn+d其中Y是酶的特征，m是RAPD标记，b是偏回归系数，d是回归后留下的增加的残差。RAPD条带与铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)(条带II)活性之间的相关程度在表2中显示。
这个标记的序列正在申请专利。可以利用这个标记选择适当的基因型(a)用于生态系统特殊栽培(b)用于通过植物育种/植物转化努力开发改良品种。
实施例茶树无性系，报道认为耐旱/对干旱敏感(根据田间表现)，选择用于该研究●在建立(通过田间研究信息相关的RAPD和同功酶分析)本研究中使用的精确DNA标记中使用了Darjeeling的茶树无性系
RR17/144，T246，CPI，TV26，TV 25，B777，AV2，K1/1，B688，T78(全部Darjeeling茶树无性系)。
●用于确认(通过与田间研究相关的RAPD研究)在其他的茶树无性系中也就是Assam茶树无性系TV1，TV2，TV14，TV17，TV20，TV30(全部Assam茶树无性系)建立的DNA标记与耐旱相关的茶树无性系。
收集来自Ging Tea Estate，Darjeeling，和Tea Research Association(TRA)，Assam的上列各无性系植物的叶。
为了进行酶研究，在24小时内使用新离脱的叶(来自Darjeeling无性系)进行提取。
茶树是多年生并且具有长的生殖周期。因此对于均一原料(即新鲜的茶树叶)的快速可得性，生长繁殖的茶树无性系细成在茶工业中使用的植物种群。在这样的种群中，通过子代的连锁研究是费时的。在这种情况下，开发DNA标记可提供一种替代方法，其是通过在DNA指纹分析图像和属于窄基因库的植物中想要得到的表型特性的精确生物化学参数之间的回归分析支持的相关研究。
细胞保护酶，特别是Cu-Zn细胞溶质超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)，已被报道与植物的耐旱相关。在本研究中，通过使用包括RAPD模式和干旱特异的同功酶活性的回归分析，尝试在茶树中建立与耐旱相关的DNA标记。
图1a和图1b显示在建立DNA标记中使用的茶树无性系的RAPD模式。在3个重复实验中观察到相同的指纹模式后，证实了数据的重复性。早些时候也报道过证明RAPD研究重复性的类似方法。
在RAPD研究中对10个无性系使用11个引物得到180条PCR条带；其中的131个条带(即总数180个扩增片段的69.87％)是多态性的(表1)。这显示了在茶树种质中RAPD方法能观察到可观测水平的多态性。
需要注意的是从属于窄基因库的植物中的指纹模式产生的多态性标记代表对特定性状的独立特征，曾尝试使用在RAPD(基因组)分析和干旱特异同功酶的活性之间的相关研究开发耐旱相关的分子(DNA)标记。为了这个目的，在容易评分的RAPD(显性性状)标记和用于植物耐旱的生物化学参数(也就是SOD和APX活性)之间进行研究。
终于观察到逆境相关的细胞保护酶的活性。
已知细胞溶质Cu-Zn SOD和APX与植物中干旱逆境相关。通过评价SOD和APX同功酶活性，进行了所研究的无性系基于同功酶标记的耐旱性鉴定。
SOD活性凝胶的光密度扫描(图2a)显示4个主要峰值；大约29kD(条带IV)的峰值代表Cu-Zn SOD。与T246，TV25，B777，K1/1，B688，T78中的峰值IV下面积(峰面积小于70mm2)比较，在无性系RR17/144，CP1，TV26和AV2中发现这个峰值显现较高活性(峰面积超过100mm2)。这显示无性系RR17/144，CP1，TV26和AV2具有耐旱的特征。
具有高度耐旱的烟草品种显现出最高的抗坏血酸过氧化物酶活性。来自NBT染色2条同功酶条带的非变性剂聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，我的干旱逆境的叶(茶)中的APX活性的数据(图(2b))，其中一条称作APX II，被发现是一个分子量约29kD的单体，另一条约40kD(APX谱带1)。在活性凝胶的光密度扫描(图2b)中，2个条带被表现为2个峰值在约40kD(APX谱带1)和在约29kD(APX谱带II)上。大约29kD(APX II)的同功酶峰值在无性系RR17/144，CP1，TV26，AV2(峰面积超过90mm2)中显示非常高的活性；T246，TV25，B777，K1/1，B688，T78显示较低活性(峰面积小于50mm2)。需要注意的是显示高APXII活性(图2b)的无性系也显示高Cu-Zn SOD活性(图2a)。
这些无性系由田间行为数据也显现耐旱性。
在RAPD条带和目标特性之间的相关性研究已被报道。为精确建立性状相关的DNA标记，已在多重回归分析中采用稻的高差异性数据RAPD分析，以确定DNA标记与数量性状之间的相关。在本研究中，进行了代表的回归分析(表2)，以确定作为从属变量的特定同功酶活性峰面积与作为独立变量的RAPD条带(s)(图1a)标记的关联。逐步回归显示使用OPAH02引物获得的RAPD条带(在1400bp)具有非常显著的回归系数，对于Cu/Zn SOD活性(b＝0.970)，对于APXII活性(b＝0.968)。使用Fisher的准确试验(F-test)，发现Cu/Zn SOD和APXII与1400bp的RAPD条带之间的相关性以99.9％的置信度是显著的。由于与显示高度耐旱特异性同功酶活性的无性系相关，这个DNA条带(标记)可以在茶树的耐旱性种质筛选中使用。这个1400bp的条带在图1和1b中用箭头标记。
直到在RAPD模式中所示时间的验证研究显示，相同引物，也就是APOH02，在一些Asssm茶树中也扩增到了1400bp的DNA片段(图3a和3b用箭头标记)。
这条1400bp的条带现在被更进一步表征。
已在其他随机选择的茶树(包括一些Assam茶树无性系)中进一步检验这个DNA片段的有效性。
直到在RAPD模式中所示时间的验证研究显示，相同引物，也就是APOH02，在一些Assam茶树中也扩增到了1400bp的DNA片段(图3a和3b用箭头标记)。
表1具有可评分的扩增和多态性条带数的11个随机引物的序列
表2Cu-Zn SOD，APX II与1400bp的RAPD条带之间的相关
权利要求
1.一种用于植物耐旱的新DNA标记，所述DNA标记包含一段使用引物APOHO2产生的1400bp的扩增片段。
2.如权利要求1所要求保护的DNA标记，其中所述扩增的片段存在于无性系RR17/144、CP1、TV26和AV2中。
3.如权利要求1中要求保护的DNA标记具有如下所示的序列Tea序列gagnntntnc tatagggcga attgggcccg acacgtcgcatg ctcccggccg ccatggcggccgcgggaatt cgattcactt ccgctagggc aaattcgtga accagctggg gcatggccgactcataaata tattcggctc tagtgccaca gccgcttcat gaatcgactc atcaatattgcgtggttcgg tgtttaatgt tcatgaatca gctggggca agggtagattc atcaatctattcggctctaa tgccgtagcc gcttcatgaa ttgactcatc aatattgtgt ggttcggtgtttaatgttcat gaaccagct ggggcaaagg cagatttatc aatctattcg gctctaatgccgcagccact tcatgaattg actcatcaat attgtgtggt ttggccgttt aatattcatgaaccagctga ggcaagggca gattcatcaa tctattcggc tctaatgccc cagccgtttcatgaaccgac tcagnagnna tgaggctatc aatattgtgt ggttcggcgt ttaatgttcatgcaccagct gnggcaaggg cagattcatc aatctattcg gctnnaatgc cacagccgcttcatgaatcg actnantant nntntgnggn nccnngagta nngttnatga ncnaantggngnnatggctg atatannagt ctatantnct ctgatgncnn ancncttgtn tgaangnacaacaggcncta atcatnttat ccaaagtagc ggaagngaat cactagtgaa ttcgcggacgctgcaggtan accatatgggg agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattctatggtgtcacc taaatagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgttatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggtgcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgccccg tttccagtcgggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggnttgcgtattggcg ctcttccgct tcttcgctca ctgactcgtg cgctcggtcg gtcggctgcggngagcggna tcacttactc aaangcggna atccggtatt cacagaatna ggntacnccggaaagaaatt ggancaaagg ccncanaagg cc
4.一种开发耐旱DNA标记的方法，包括从冷冻的嫩叶提取基因组DNA，将这样获得的DNA进行标定步骤，将标定的DNA进行分析步骤，无性系干旱特异的(通过回归分析鉴定参见权利要求6)DNA片段以获得标记条带的DNA序列。
5.如权利要求4要求保护的方法，其中所述鉴定标记的步骤包括使用引物，例如OPAB06、OPAB18、OPAH18、OPAH02、OPAB17、OPAC19、OPAH12、OPAL04、OPAA02、OPAG13和OPAL08。
6.如权利要求4要求保护的方法，其中分析的步骤是通过回归分析方法完成的，方法是利用干旱逆境离脱的叶中超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的干旱特异同功酶活性的相关(RAPD研究)。
7.如权利要求4要求保护的方法，其中分析的步骤是基于作为独立变量的RAPD条带(作为基因型)与作为独立变量的植物中耐旱生物化学参数之间的相关研究。
全文摘要
一种用于植物耐旱的新DNA标记，所述DNA标记包含一段使用引物AP OHO2产生的1400bp的扩增片段。
文档编号C12Q1/68GK1997753SQ200580005821
公开日2007年7月11日 申请日期2005年2月28日 优先权日2004年2月27日
发明者S·S·曼迪 申请人:博斯学院, 生物技术部