专利名称：：一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。
背景技术：
：多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是浆细胞的恶性肿瘤，其特征为骨髓中异常浆细胞恶性增殖，血清或尿中出现过量单克隆免疫球蛋白(IgG，IgA，IgD或IgE)或BenceJones本周蛋白质(游离的单克隆性k或Y轻链)，常伴有多发性溶骨性损害，高钙血症，贫血，肾脏损害，易引起肺部、泌尿系感染。在我国多发性骨髓瘤的发病率占血液系统肿瘤的第二位，中位生存期为35年。目前，多发性骨髓瘤的治疗主要包括常规化疗、干细胞移植以及新型药物治疗，如免疫调节药物、蛋白酶体抑制剂等的应用，虽然可以使病情得到有效控制，但很少有患者能够取得完全缓解甚至治愈。越来越多的证据表明多发性骨髓瘤细胞的基因异质性很大程度上决定了不同的临床后果。现在多发性骨髓瘤的诊断已经从单纯细胞形态学诊断演变为细胞生物学和临床医学结合的综合诊断模式。常规诊断技术有各种电泳、免疫组化、流式细胞术、PCR检测免疫球蛋白重链或轻链基因的克隆性重排等，但一直以来，缺乏多发性骨髓瘤特异的诊断、预后分子标记和治疗监测的分子靶标，使对治疗多发性骨髓瘤的疗效难以作出更科学的评估。癌睾丸抗原(Cancertestisantigen,CT抗原)是一种免疫原性蛋白质，在过去15年间已鉴定了40多个家族，基于其在肿瘤患者中的特异性表达和免疫原性，CT抗原已被认为是有应用前景的人类恶性肿瘤免疫治疗的靶标，并有可能成为重要的诊断和预后标志。新近的研究发现匪患者中高频率表达CT抗原，且可诱导抗体介导和T细胞介导的免疫反应。异基因干细胞移植的治疗效果一部分是由供者来源的T细胞显示的免疫效应的结果，针对CT抗原的免疫反应，提示CT抗原可能是供者来源同种异体免疫甚至是自发抗骨髓瘤免疫应答的天然靶标。骨髓残留恶性浆细胞的匪患者明显持续表达CT抗原，所以CT抗原是针对微小残留病的有潜力的标志，还可以用于靶向治疗后残存于患者骨髓中的骨髓瘤细胞。通过检测骨髓浆细胞的数量和外周血异常蛋白水平，已发现CT抗原表达水平和骨髓瘤患者的临床病程间有强相关性，CT抗原可能不仅是独立的肿瘤标志，而且是早期复发和生存率显著下降的重要指标。MAGECl/CT7(黑色素瘤抗原-Cl/癌睾丸抗原7)是匪中最常见的一种CT抗原表达，检测阳性率可达65%82%，在肿瘤细胞中高表达，在正常细胞中不表达，MAGEC1/CT7的肿瘤特异性的高频率且持续的表达，使其最有可能成为有效的匪诊断、预后、疗效监测指标及免疫治疗靶标。目前，国际上已报道的用于检测MAGEC1/CT7表达的方法主要为定性PCR和免疫组织化学方法，这些方法普遍存在灵敏度低、特异性不高、费时费力等缺点，使应用受到一定限制。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。本发明提供的辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述试剂盒还可包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重组质粒。所述阳性质粒可为含有序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段的重组质粒。所述阳性质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段连接得到的重组质粒。所述试剂盒可还包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。所述特异性引物对乙具体可为序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列具体可如序列表的序列6所示。所述试剂盒还可包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。所述内参质粒可为含有序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。所述内参质粒具体可为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。本发明还保护针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列l和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。在多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因表达，而在正常人的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因不表达。且处于不同ISS期的多发性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，MAGEC1/CT7基因的表达水平具有差异性。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤，还可以通过内参基因，测定患者MAGEC1/CT7基因的表达水平。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。图1为实施例3中阳性对照质粒灵敏度检测的RQ-PCR荧光曲线。图2为实施例5中阳性对照质粒RQ-PCR扩增的标准曲线；显示Ct值和阳性对照质粒不同稀释度的样本间呈线性相关(相关系数>0.99)。图3为实施例5中内参对照质粒的RQ-PCR扩增的标准曲线；显示Ct值和内参对照质粒不同稀释度的样本间呈线性相关(相关系数>0.99)。图4为实施例6中，25位患者的骨髓中浆细胞数占骨髓有核细胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表达水平的关系。图5为实施例6中，31位患者的骨髓中0038+/00138+细胞占骨髓有核细胞的百分比和MAGEC1/CT7基因表达水平的关系。图6为实施例6中，将31位患者的骨髓中CD38+/CD138+细胞占骨髓有核细胞的百分比按<1%(1组，n=9)、1%-10%(2组，n=14)、>10%(3组，n=8)分为三组时，各组MAGEC1/CT7基因表达水平。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、特异性引物对和探针的设计针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲(扩增产物为79bp)和探针甲上游引物MAG-FP:5'-TTGTCTTCTGGGAACCTTGACTC-3';下游引物MAG-RP:5'-TGAGGGACACATACATCCTAAAAGC-3';探针MAG-T-probe:FAM-ACTGCCTGGGCCTCCTCTGCTGT-BHQ(5'-3，)。针对ABL基因(内参基因)的特异性引物对乙和探针乙上游引物ENF1003:5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3';下游引物ENR1063:5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探针ENPrl043:FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(5，-3，)。针对ABL基因的特异性引物对乙和探针乙按参考文献合成(GabertJ，BeillardE，vanderVeldenVH，etal.Standardizationandqualitycontrolstudiesof'real-time'quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionoffusiongenetranscriptsforresidualdiseasedetectioninleukemia—aEuropeAgainstCancerprogram.Leukemia.2003，17:2318-57.)实施例2、相关质粒的制备—、阳性对照质粒(含有MAGEC1/CT7基因片段的质粒)的制备以MAGEC1/CT7基因表达阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列7(632bp)所示，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒(pMD18-T载体系统，上海皓嘉公司，产品目录号D101A)，将重组质粒转化大肠杆菌DH5a(天根生化公司，产品目录号CD101-02)感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了阳性对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在EC0RV位点插入序列7所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下CT7FP:5'-ACATCCTCACCCTCAGGAGGG-3';CT7RP:5'-GACGAGGATCGTCTCAGGTCAGC-3，。二、内参对照质粒(含有ABL基因片段的质粒)的制备以K562细胞系(上海坤肯生物化工有限公司；中国细胞库典藏细胞中心细胞目录QK10269)的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列8所示，扩增产物经纯化后，克隆入pMD18-T质粒，将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态，筛选阳性克隆提取质粒并纯化后进行测序，结果表明得到了内参对照质粒(骨架质粒为pMD18-T质粒，在EC0RV位点插入序列8所示cDNA)。PCR扩增所用的引物对如下ABL-FP:5'-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3';ABL-RP:5'-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，。三、阴性对照质粒pMD18-T质粒。—、试剂盒的组装试剂盒由如下组件组成实施例1制备的针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；实施例2制备的阳性对照质粒。二、试剂盒的灵敏度检测对6位MAGEC1/CT7阳性的多发性骨髓瘤患者(志愿者)cDNA标本及阳性对照质粒进行MAGECl/CT7基因的检测，患者cDNA标本分别进行IO倍梯度稀释至10—5，阳性对照质粒10倍梯度稀释为分别含有105、104、103、102、101、10°个拷贝的MAGEC1/CT7基因片段(通过测定吸光度值计算阳性对照质粒中MAGEC1/CT7基因片段的拷贝数)。方法如下1、RNA提取用TRIzol试剂盒(购自美国Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各个患者的骨髓标本(北京大学人民医院)的RNA(或外周血标本的RNA也可)，方法为用EDTA抗凝，用淋巴细胞分层液(相对密度1.077g/L，上海华精高科技有限公司)分离出单个核细胞，将分离出的单个核细胞用生理盐水洗涤2次后，加入1000illTRIzol试剂，用加样枪反复吹打，使细胞破碎，按照TRIzol试剂盒说明进行RNA提取。提取的RNA晾干后，加入适量DEPC处理的去离子水溶解RNA，在DNA/RNA紫外分光光度计上测RNA浓度及纯度，结果A260/A280>1.8，表明所提取的RNA纯度较高。2、cDNA合成逆转录(RT)公共体系(20iiL):5XRT缓冲液4iiL0.1MDTT2iiLd證s(10mM，Promega公司)1iiL随机六聚体引物(0.1iig/iil，Invitrogen公司)1iiL匪LV逆转录酶(200U/iiL，Invitrogen公司)1iiLRNaseOUTRNase抑制剂(40U/iiL，Invitrogen公司)1iiL每19iiLRT公共体系分装1管，每管加入RNA1yg(RNA首先65°C5min，冰浴5min)。37t:反应65min，95t:5min灭活逆转录酶，4"C保存备用。3、对6位MAGEC1/CT7阳性的多发性骨髓瘤患者cDNA标本及阳性对照质粒进行灵敏度检测步骤2得到的每个样本进行10倍梯度稀释，在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。PCR反应体系(lOiU):序列1所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4iiM，序列3所示的TaqMan探针0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共体系5ii1(ABI公司，美国)，cDNA(或质粒)liil;其余为去离子水。PCR反应条件50。C2min，1个循环；95°C10min，1个循环；95。C15s，60。Clmin，40个循环。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为0.2。阳性对照质粒1()S、l(^、l(f、l(f、l(^、l(^个拷贝的RQ-PCR荧光曲线见图l，检测MAGEC1/CT7基因片段的灵敏度可达10°个拷贝(即1个拷贝)。6位MAGEC1/CT7阳性的多发性骨髓瘤患者cDNA标本10倍系列稀释的扩增曲线特征见表1。表1多发性骨髓瘤患者cDNA标本10倍系列稀释的扩增曲线特征<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果表明，应用本发明提供的针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲通过RQ-PCR检测6例MAGEC1/CT7基因阳性的多发性骨髓瘤患者，灵敏度可达10—4或10—5稀释度。实施例4、试剂盒的应用—、试剂盒的组装试剂盒由如下组件组成实施例1制备的针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；实施例2制备的阳性对照质粒和阴性对照质粒。二、试剂盒的应用检测125位多发性骨髓瘤患者(其中51位为未治或复发的多发性骨髓瘤患者)、22例正常供者(志愿者)的骨髓中MAGEC1/CT7基因的表达情况，方法如下1、RNA提取同实施例3的步骤二的1。2、cDNA合成同实施例3的步骤二的2。3、待测样本的检测步骤2得到的每个样本在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。每批RQ-PCR实验均设置阳性对照(用等体积的10倍梯度稀释的阳性对照质粒代替样本)、阴性对照(用等体积的阴性对照质粒代替样本)和无模板空白对照(用等体积的&0代替样本)。PCR反应体系(lOiU):序列l所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4线序歹lj3所示的TaqMan探针0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共体系5ii1(ABI公司，美国)，cDNA(或质粒)1ill;其余为去离子水。PCR反应条件5(TC2min，1个循环；95°C10min，l个循环；95。C15s，60。Clmin，40个循环。分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为0.2。定性检测的结果见表2。表2实时定量聚合酶链反应检测匪患者中MAGEC1/CT7基因表达阳性率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结果表明，本发明的试剂盒可以用于多发性骨髓瘤的检测。对于多发性骨髓瘤患者中检测结果为阴性的样本，可能是由于该患者的骨髓中存在其它相关基因的表达，而不存在MAGEC1/CT7基因的表达。实施例5、MAGEC1/CT7的表达量与多发性骨髓瘤ISS分期的相关性—、试剂盒的组装试剂盒由如下组件组成实施例1制备的针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；实施例1制备的针对ABL基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质粒、阴性对照质粒和内参对照质粒。二、试剂盒的应用检测处于不同ISS分期的多发性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表达量，方法如下1、RNA提取同实施例3的步骤二的1。2、cDNA合成同实施例3的步骤二的2。3、待测样本的检测步骤2得到的每个样本在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司7500-FAST型)上进行RQ-PCR。阳性对照、阴性对照和空白对照的设置阳性对照(用等体积的IO倍梯度稀释的阳性对照质粒代替样本；分别含有1()S、10^1(f、l(f、l(^、l(^个拷贝的MAGECl/CT7基因片段)、阴性对照(用等体积的阴性对照质粒代替样本)和无模板空白对照(用等体积的叫代替样本)。PCR反应体系(lOiU):序列l所示的上游引物0.4iiM，序列2所示的下游引物0.4iiM，序列3所示的TaqMan探针0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共体系5ii1(ABI公司，美国)，cDNA(或质粒)1iil;其余为去离子水。PCR反应条件5(TC2min，1个循环；95°ClOmin，l个循环；95。C15s，60。Clmin，40个循环。内参对照的设置用等体积的10倍梯度稀释的内参对照质粒代替样本；分别含有106、105、1()4、103、102、1(^个拷贝的ABL基因片段；PCR反应体系(lOiU):序列4所示的上游引物O.3iiM，序列5所示的下游引物0.3iiM，序列6所示的TaqMan探针0.2iiM，2XTaqMan通用PCR公共体系5ii1(ABI公司，美国)，cDNA(或质粒)1;其余为去离子水。PCR反应条件50。C2min，1个循环；95。C10min，1个循环；95。C15s，60。Clmin，40个循环。分析每批RQ-PCR结果时，MAGEC1/CT7阈值均固定为0.2，ABL阈值均固定为0.08。阳性对照质粒RQ-PCR扩增的标准曲线见图2，标准曲线方程为1ogMAGECl/CT7=(Ct-31.232)/-3.281(r=0.995)。内参对照质粒RQ-PCR扩增的标准曲线见图3，标准曲线方程为logABL=(Ct-38.465)/-3.221(r=0.998)。SDS软件利用标本的CT值，根据标准曲线分别计算出各份标本ABL及目的基因MAGEC1/CT7的拷贝数。MAGEC1/CT7基因mRNA水平(％)=MAGEC1/CT7基因拷贝数X100%ABL基因拷贝数结果表明，MAGEC1/CT7表达量与ISS分期相关，MAGEC1/CT7表达量随ISS分期而增加，见表3。表3ISS分期和MAGEC1/CT7基因表达水平间的关系iss分期样本数均数±标准差1277±95213677±1484392327±2329实施例6、MAGEC1/CT7的表达量与骨髓浆细胞、CD38+/CD138+细胞数的相关性—、试剂盒的组装试剂盒由如下组件组成实施例1制备的针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；实施例1制备的针对ABL基因的特异性引物对乙和探针乙；实施例2制备的阳性对照质粒、阴性对照质粒和内参对照质粒。二、MAGEC1/CT7基因表达量和骨髓桨细胞数的相关性检测25位多发性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表达量，方法如下1、RNA提取同实施例3的步骤二的1。2、cDNA合成同实施例3的步骤二的2。3、待测样本的检测同实施例5的步骤二的3。同时，通过显微镜对骨髓样本涂片进行形态学检查，检测该25位患者的骨髓中桨细胞的数量。25位患者的骨髓中浆细胞占骨髓有核细胞的数量百分比和MAGEC1/CT7基因mRNA水平，见图4。由图4可见，MAGEC1/CT7表达量与浆细胞数正相关(r=0.435，P<0.05)。9三、MAGEC1/CT7基因表达量和CD38+/CD138+细胞数的相关性检测31位多发性骨髓瘤患者(志愿者)中MAGEC1/CT7的表达量，方法如下1、RNA提取同实施例3的步骤二的1。2、cDNA合成同实施例3的步骤二的2。3、待测样本的检测同实施例5的步骤二的3。同时，应用流式细胞仪，检测该31位患者的骨髓中0038+/00138+细胞的数量。31位患者的骨髓中0038+/00138+细胞占骨髓有核细胞的数量百分比和區6￡(:1/07基因111尺脆水平，见图5。由图5可见，MAGEC1/CT7表达水平和CD38+/CD138+阳性细胞百分比呈正相关(r=0.41，P<0.05)。根据以上检测结果，将31位患者的骨髓中0038+/00138+细胞占骨髓有核细胞的百分比按<1%(1组，n=9)、1%-10%(2组，n二14)、>10%(3组，n=8)分为三组，各组區6￡(:1/07基因表达水平见图6，随着序列表0127]〈110〉北京大学人民医院0128]〈120〉一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒0129]〈130〉CGGNARY926360130]〈160>80131]〈210>10132]〈211>230133]〈212>DNA0134]〈213〉人工序列0135]〈220〉0136]〈223〉0137]〈400>10138]ttgtcttctgggaaccttgaetc0139]〈210>20140]〈211>250141]〈212>DNA0142]〈213〉人工序列0143]〈220〉0144]〈223〉0145]〈400>20146]tg3gggacac3tecatccte3朋gc0147]〈210>310〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>3actgcctgggcctcctctgctgt23〈210>4<211>31〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400>4tggagateac3ctct朋gc3teacte朋ggt31〈210>5〈211>21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>5gatgtegttgcttgggaccca21〈210>6〈211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>6ccatttttggtttgggcttcacaccatt28〈210>7〈211>632〈212>DNA〈213〉人属人(Homosapiens)〈400>7gacgaggatcgtctcaggtcagcggagggaggagacttatagacctatccagtcttcaag60gtgctccagaaagcaggagttgaagacctgggtgtgagggacacatacat120ccacagcagaggaggcccaggcagtgccaggagtcaaggttcccagaagaC333CCCCCt1803gg朋g3C3ggcgacctgtgaggccctegagC3CC3CCtt朋g3g朋g朋g3gCtgt朋g240ccggcctttgtcagagccatratgggggacaaggatatgcctactgctgggatgccgagt300cttctccagagttcctctgagagtcctcagagttgtcctgagggggaggactcccagtct360cctctccagattccccagagttctcctgagagcgacgacaccctgtatcctctccagagt420cctcagagtcgttctgagggggaggactcctcggatcctctccagagacctcctgagggg■aaggactcccagtctcctctccagattccccagagttctcctgagggcgacgacacccag540tctcctctccagaattctcagagttctcctgaggggaaggactccctgtctcctctagag600atttctcagagccctcctgagggtg郷atgt632〈210>8〈211>124〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400>8tggagateacactctaagcatgaaaagctccgggtcttaggctataatca60c朋tgggg朋tggtgtgaagaaatggccaaggctgggtccc朋gc朋cte120catc权利要求一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。2.如权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阳性质粒；所述阳性质粒为含有MAGEC1/CT7基因或其片段的重组质粒。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为含有序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段的重组质粒。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述阳性质粒为将pMD18-T载体与序列表的序列7所示的MAGEC1/CT7基因片段连接得到的重组质粒。5.如权利要求1至4中任一所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括针对内参基因的特异性引物对乙和探针乙；所述内参基因为ABL基因。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述特异性引物对乙为序列表的序列4和序列表的序列5所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。7.如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括内参质粒；所述内参质粒为含有ABL基因或其片段的重组质粒。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述内参质粒为含有序列8所示的ABL基因片段的重组质粒。9.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述内参质粒为将pMD18-T载体与序列表的序列8所示的ABL基因片段连接得到的重组质粒。10.针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲在制备辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒中的应用；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。全文摘要本发明公开了一种辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒。本发明提供的辅助诊断多发性骨髓瘤的试剂盒，包括针对MAGEC1/CT7基因的特异性引物对甲和探针甲；所述特异性引物对甲为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；所述探针甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本发明的试剂盒，不仅可以应用于定性诊断多发性骨髓瘤MAGEC1/CT7基因的表达，还可以通过内参基因，诊断多发性骨髓瘤MAGEC1/CT7基因的表达水平。本发明为多发性骨髓瘤的诊断提供了一条快速、可靠、准确的新途径，为疗效观察、微小残留病的动态观察提供依据。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。文档编号C12Q1/68GK101705302SQ200910237229公开日2010年5月12日申请日期2009年11月5日优先权日2009年11月5日发明者刘开彦,刘艳荣,史惠琳,张瑶,李玲娣,李金兰,江滨,牛继红,秦亚溱,阮国瑞,陈欢,陈珊珊,鲍立,黄晓军申请人:北京大学人民医院