专利名称：长春花毛状根再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种长春花毛状根再生植株的方法。
背景技术：
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，目前人们从长春花全草中分离了100多种萜类吲哚生物碱，如长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、阿吗碱(Ajmalicine)、蛇根碱(Serpentine)、文多灵碱(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)等。大多数萜类吲哚生物碱由于具有生物学活性而被广泛应用于现代医药中，如著名的抗肿瘤药物长春碱和长春新碱是目前应用最广的天然植物抗肿瘤药物，其硫酸盐已广泛应用于临床。长春碱和长春新碱是目前长春花中药用价值最大、应用最广泛的抗癌萜类吲哚生物碱。它们主要从天然长春花植株中提取，但天然植物体内含量极其微少，使得长春花材料来源困难，仅从天然植物中提取萜类吲哚生物碱远远不能满足市场需求。长春碱和长春新碱由于化学结构复杂，化学合成和半合成成本太高，也不具有商业前景。利用基因工程技术获得萜类吲哚生物碱高产的长春花新品种是一种有效方法，但直接通过根癌农杆菌转化获得转基因长春花植株目前还未见报道。通过发根农杆菌转化很容易获得萜类吲哚生物碱高产的长春花转基因毛状根，由于转化毛状根起源于一个单细胞，由毛状根再生的植株是纯合体，解决了Ti质粒转化形成嵌合体问题。Ri质粒的T-DNA可按照孟德尔方式稳定遗传，再生的转化植株经数代分化繁殖其克隆的性质不变，大多数转化植株均表现出特异的可遗传表型。
经检索发现，现有文献中目前已有100多种植物通过发根农杆菌感染获得毛状根并再生出完整的再生植株。由转基因长春花毛状根再生出完整植株，通过筛选鉴定具有高含量萜类吲哚生物碱的转化长春花植株可为理论研究和生产实践带来巨大的动力和效益，将为最终解决抗肿瘤萜类吲哚生物碱药物稀缺提供长春花优质新品种，但尚未发现与本发明主题所提及的长春花毛状根再生植株的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种长春花毛状根再生植株的方法。本发明中涉及的长春花毛状根不定芽诱导培养基、不定芽生根培养基、再生植株快速繁殖培养基和移栽基质用于本发明组织培养的方法，建立了长春花毛状根再生植株的方法，为长春花品种改良和生物技术育种奠定坚实的基础，促进了我国长春花药物技术领域的发展。
本发明是通过以下技术方案实现的本发明将长春花毛状根外植体切段，置于愈伤组织诱导培养基上，经光照培养，形成愈伤组织；通过接种到不定芽诱导培养基上培养，形成芽点；挑选芽点的愈伤组织继续培养，经光照培养，形成不定芽。切取不定芽转移到生根培养基上，产生出不定根，将再生出的完整植株转移到快速繁殖培养基上继续培养，选取株系，移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化可获得生长正常的长春花植株。
本发明包括如下步骤(1)长春花毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化将长春花毛状根切成2-3cm长的节段，置于愈伤组织诱导培养基上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过10-20天的光照培养，可在外植体周围形成愈伤组织；将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上培养1-2代，每代20-25天，所述的不定芽诱导培养基为MS培养基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L 6-苄基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。在愈伤组织上形成大量绿色芽点；挑选含绿色芽点的愈伤组织继续继代培养，经过20天的培养，绿色芽点生长并分化形成不定芽。
(2)长春花不定芽的生根切取从长春花毛状根分化的不定芽，置入生根培养基中，所述的生根培养基为1/2MS培养基+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。培养温度为25+1℃，每天光照16小时，经过20天的光照培养，可从不定芽基部分化出不定根，从而形成再生的完整植株。
(3)长春花再生植株的快速繁殖选取生长健壮的长春花再生植株，通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进行培养，形成长春花再生植株株系。所述的快速繁殖培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。
(4)长春花再生植株的移栽选取生长健壮、繁殖系数高的株系，移栽到装有移栽基质的花盆中，所述的移栽基质成分为蛭石∶珍珠岩∶泥炭土(2∶1∶6)。通过驯化可获得生长正常的长春花植株。
本发明采用组织培养的方法，筛选出适合长春花毛状根不定芽分化和生根的培养基，长春花毛状根的不定芽分化率达80％，不定芽生根率为100％，再生植株的移栽成活率为100％，长春花毛状根再生技术的建立，为长春花品种改良和生物技术育种奠定了坚实的基础。从各种转基因长春花毛状根再生出完整植株，能够获得萜类吲哚生物碱高产的转基因长春花新品系，为解决萜类吲哚生物碱药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。
具体实施例方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1长春花毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化将长春花毛状根外植体切成2-3cm长的节段，置于愈伤组织诱导培养基上培养，愈伤组织诱导培养基为MS(Murashige and Skoog，1962)+萘乙酸(NAA)0.3mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。经过10-20天的光照培养，可在毛状根上长满瘤状的愈伤组织，愈伤组织的诱导率达100％；将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上继代培养1-2代，每代20-25天，在愈伤组织表面产生大量浅绿色芽点，不定芽诱导培养基为MS+萘乙酸(NAA)0.3mg/L+6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0mg/L+3％蔗糖+0.26％植物凝胶；挑选含绿色芽点的愈伤组织继续在上述培养基上继代培养，经过20天左右的培养，绿色芽点逐渐生长分化形成不定芽，不定芽的分化率达80％以上，再经过20天左右的培养不定芽可长高至2cm。
以上各类培养的培养温度均为25±1℃，每天光照16小时。
实施例2长春花不定芽的生根切取实施例1中分化的不定芽，置入生根培养基中进行培养，生根培养基为1/2MS+3％蔗糖+0.26％植物凝胶，培养温度均为25±1℃，每天光照16小时。经过8-10天的培养，在不定芽基部出现肉眼可见的白色根突，经过20天的光照培养，可分化出5-10条不定根，不定根的分化率为100％，30天后可长成5-6cm高、具有3-5对叶片的试管苗。
实施例3长春花再生植株的快速繁殖选取实施例2中生长健壮的长春花再生植株，通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进行培养，可形成长春花再生植株株系。快速繁殖培养基为不添加任何植物生长调节物质的MS培养基+3％蔗糖+0.26％植物凝胶，培养温度均为25±1℃，每天光照16小时。
实施例4长春花再生植株的移栽选取生长健壮、繁殖系数高的再生株系，用镊子小心取出无菌试管苗，洗去根部培养基，移栽到盛有基质的花盆中，基质中的成分为蛭石、珍珠岩和泥炭土，其配方比例为2∶1∶6。通过驯化2周后可移栽到大田中，可获得生长正常的长春花植株，移栽成活率达100％。
通过研究，在本发明中提供了一种从长春花毛状根再生植株的方法。应用本发明的方法，可以从各种转基因长春花毛状根再生出完整植株，从而获得萜类吲哚生物碱高产的转基因长春花新品系，为解决萜类吲哚生物碱药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。
权利要求
1.一种长春花毛状根再生植株的方法，其特征在于，将长春花毛状根外植体切段，置于愈伤组织诱导培养基上，经光照培养，形成愈伤组织，通过接种到不定芽诱导培养基上培养，形成芽点，挑选芽点的愈伤组织继续培养，经光照培养，形成不定芽，切取不定芽转移到生根培养基上，产生出不定根，将再生出的完整植株转移到快速繁殖培养基上继续培养，选取株系，移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化可获得生长正常的长春花植株。
2.根据权利要求1所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，包括如下具体步骤(1)长春花毛状根愈伤组织的诱导和不定芽的分化，将长春花毛状根切成2-3cm长的节段，置于愈伤组织诱导培养基上，培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过10-20天的光照培养，可在外植体周围形成愈伤组织，将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上培养1-2代，每代20-25天，在愈伤组织上形成大量绿色芽点；挑选含绿色芽点的愈伤组织继续继代培养，经过20天的培养，绿色芽点生长并分化形成不定芽；(2)长春花不定芽的生根，切取从长春花毛状根分化的不定芽，置入生根培养基中，培养温度为25±1℃，每天光照16小时，经过20天的光照培养，从不定芽基部分化出不定根，从而形成再生的完整植株；(3)长春花再生植株的快速繁殖，选取生长健壮的长春花再生植株，通过切割增殖手段在快速繁殖培养基中进行培养，形成长春花再生植株株系；(4)长春花再生植株的移栽，选取生长健壮、繁殖系数高的株系，移栽到装有移栽基质的花盆中，通过驯化可获得生长正常的长春花植株。
3.根据权利要求1或者2所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，所述的愈伤组织诱导培养基为MS培养基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。
4.根据权利要求1所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，所述的不定芽诱导培养基为MS培养基+0.3mg/L萘乙酸(NAA)+2.0mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。
5.根据权利要求1所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，所述的生根培养基为1/2MS培养基+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。
6.根据权利要求1所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，所述的快速繁殖培养基为MS培养基+3％蔗糖+0.26％植物凝胶。
7.根据权利要求1所述的长春花毛状根再生植株的方法，其特征是，所述的移栽基质成分为蛭石∶珍珠岩∶泥炭土为2∶1∶6。
全文摘要
本发明是一种生物技术领域的长春花毛状根再生植株的方法。本发明将长春花毛状根外植体切段，置于愈伤组织诱导培养基上，经光照培养，形成愈伤组织，通过接种到不定芽诱导培养基上培养，形成芽点，挑选芽点的愈伤组织继续培养，经光照培养，形成不定芽，切取不定芽转移到生根培养基上，产生出不定根，将再生出的完整植株转移到快速繁殖培养基上继续培养，选取株系，移栽到盛有移栽基质的花盆中，通过驯化可获得生长正常的长春花植株。本发明筛选出适合长春花毛状根不定芽分化和生根的培养基，长春花毛状根的不定芽分化率达80％，不定芽生根率为100％，再生植株的移栽成活率为100％。
文档编号A01H4/00GK1788551SQ20051011122
公开日2006年6月21日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者唐克轩, 龚一富, 苗志奇, 孙小芬 申请人:上海交通大学