专利名称：转抗虫基因的三系杂交棉分子育种的方法
技术领域：
本发明涉及转基因农作物分子育种，尤其涉及一种转抗虫基因三系杂交棉育种的方法。
背景技术：
杂种优势是生物界普遍存在的现象，它可以表现在各种经济性状、生长发育、生理生化、细胞，以至于分子水平等各个层次上。利用杂种优势是现代农业提高农作物产量、品质和抗逆性的有效途径。如玉米、水稻、油菜等农作物杂种优势带来的高产和优质对世界食物安全已作出了巨大贡献。
三系，即雄性不育系、保持系和恢复系，是利用植物细胞质雄性不育进行杂种种子生产(制种)的体系。美国是最早开展三系杂交研究的国家，培育出具有哈克尼西棉细胞质的不育系Des-HAms16和Des-HAms277，并通过把哈克尼西棉的细胞核基因转移到陆地棉染色体组中去的方法育成两个恢复系Des-HAF16和Des-HAF277，但由于野生棉细胞质对杂种后代的负效应，以及恢复系育性恢复不完全、波动大，在同一年份里有的恢复好，有的恢复不好(不育)，因此未在生产上应用。1980年我国从美国引进哈克尼西棉细胞质不育三系，并相继育成一批有一定育种价值的材料，且完成了海陆三系和陆海三系配套组合，但因为制种产量低和高优势组合缺乏，仅在新疆有小面积种植，未实现大面积产业化。近年来，浙江大学用转基因技术将谷胱甘肽-转移酶基因(GTS)导入哈克尼西棉细胞质恢复系DES-HAF277中，筛选到一个对雄性不育系具有恢复力的恢复系“浙大强恢”，与受体恢复系相比，其对不育系的恢复力提高25.8％，F1不孕籽率降低10.1％，证明了GTS对棉花花粉育性有明显的促进作用，但也未达到完全恢复以及见在生产上应用的报道。目前，国际和国内棉花杂交种子主要通过“人工去雄授粉法”获得，但它费工、费时且成本高，大面积应用受到限制。
同时，利用生物技术手段可以获得对特定害虫有杀虫作用的转基因植物，例如目前已经在世界上大面积推广应用的转Bt基因抗虫棉、抗虫玉米等，即是将异源抗虫基因转化棉花和玉米，筛选获得的转基因植株并进一步进行品种选育，最终培育出可大面积应用的转基因棉花和玉米品种。并且，为获得特定害虫难以产生抗性的转基因植物，可以采用同时转化两种或两种以上不同杀虫基因的方式。
发明内容
本发明提供了一种将Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci抗虫基因转化棉花保持系和恢复系，育成转基因抗虫保持系、不育系和恢复系，其中转基因抗虫不育系和恢复系选配可获得强优势组合的转抗虫基因的三系杂交棉分子育种的方法。
为了达到上述目的，本发明采取下列措施。
1)采用转基因方法，将异源抗虫基因(Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci)导入陆地棉品种(系)中，育成转抗虫基因的保持系；2)采用回交转育的方法，以转抗虫基因的保持系为轮回亲本，育成转抗虫基因的不育系及其衍生系，其不育率和不育度均为100％；
3)采用杂交的方法，将0-613-2R中的恢复基因与我国常规陆地棉中的恢复加强基因聚合在一起，使获得的新型陆地棉恢复系对步骤2获得的不育系具有完全恢复能力；4)采用转基因方法，将异源抗虫基因(Bt GFM cry1A、Bt GFM cry1A+cpti以及cryci)导入新型陆地棉恢复系中，育成转抗虫基因的恢复系及其衍生系，其恢复率和恢复度均为100％；5)以转抗虫基因的不育系为母本，以恢复系或转抗虫基因恢复系为父本，测交并筛选出在产量、品质和抗性上具有强优势的杂种F1组合。
本发明所提供的陆地棉恢复系及转基因抗虫恢复系，聚合了恢复系0-613-2中的恢复基因和我国陆地棉中的恢复加强基因，使杂种F1的可育株率和可育度均达到了100％，从而有效地克服了国内外现有三系杂交棉，尤其是陆陆三系杂交棉杂种F1可育度低的缺陷。同时，本发明所提供的转抗虫基因的保持系、不育系和恢复系，其转化的抗虫基因包括Bt GFM cry1A单价抗虫基因、Bt GFM cry1A+cpti双价抗虫基因以及cryci融合抗虫基因三类不同的抗虫基因，其中Bt GFM cry1A+cpti双价抗虫基因以及cryci融合抗虫基因的表达产物均包含两类杀虫机理不同、杀虫谱互补且具有协同增效作用的两种抗虫活性蛋白质，即Bt毒蛋白和豇豆胰蛋白酶抑制剂，选育获得的转双价抗虫基因和转融合抗虫基因的棉花不仅抗虫效率达90％以上，而且在生长发育的中后期，抗虫效率明显高于转单价抗虫基因的棉花。另外，实验室汰选结果表明，转双价抗虫基因的棉花可有效延缓棉铃虫产生抗性的进程。2003-2004年，抗虫三系杂交棉银棉2号在全国棉花区试黄河流域春棉组中，籽棉、皮棉、霜前皮棉两年平均分别比对照中棉所41增产21.1％、26.4％和29.1％，均居两年参试品种第一位。
具体实施例方式
给出以下实施例的目的是举例详细描述本发明，而不构成对本发明待批权利范围的限制。在本发明技术特征和待批权利要求范围内，本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
实施例一转抗虫基因陆地棉保持系选育利用农杆菌介导的叶盘法和花粉管通道法，将Bt GFM cry1A单价抗虫基因(ZL 95 1 19563.8)、BtGFM cry1A+cpti双价抗虫基因(ZL 98 1 02885.3)以及cryci融合抗虫基因(200510076823.3)三类不同的抗虫基因分别导入晋棉7号、中棉所12、中棉所19、中植372、泗棉3号、苏棉8号、苏棉12号、泗阳167、泗阳168、石远321、新陆早4号、新陆早7号、新陆早8号、辽棉15，以及3517、541、916、C6524、Q0101、苏引A、苏引B、苏引C以及低酚棉W8等优良陆地棉品种(系)中，经过分子检测和抗虫性鉴定，获得近600份抗虫性超过90％的转抗虫基因棉花种质资源材料，并在此基础上，通过系选，获得70多个高产、优质、抗病虫的品系，选育出通过省级和国家级审定的晋棉26号、国抗12号、国抗1号、国抗22号、鲁棉研16、晋棉31、鄂抗虫棉1号、晋棉34、鲁棉研18号、鲁棉研21号、鲁棉研22号、鲁棉研19号、邯郸109等共13个单价抗虫常规棉品种，和sGK321、新研96-48、中棉所41、中棉所45、中棉所51(棕色)、SGK3、中棉所50等共7个双价抗虫常规棉品种。所获得的这些抗虫常规陆地棉品种(系)均可作为转抗虫基因陆地棉保持系。
实施例二转抗虫基因陆地棉不育系获得以具有陆地棉胞质的雄性不育系104-7A为起始不育系，以生产上广泛种植，具有独立自主知识产权的优良抗虫品种或品系为保持系，经过连续多代回交转育，育成具有陆地棉细胞质的棉花雄性不育系40多个，其中稳定的单价抗虫高代不育系包括国抗12A，鲁棉研21A、鲁棉研22A、鲁棉研19A、国抗19A、K9A、C21A等7个，稳定的双价抗虫高代不育系包括中棉所41A，sGK321A，新研96-48A，中棉所45A，P03A，P05A、17-79A，P80A、5-2A，I-4A，2921A，C035A、HDA，NDA，43A、652A，653A，S-25A，S-56A，L14-343A等20个。在这些不育系中，国抗12A、鲁棉研21A、中棉所41A、sGK321A、新研96-48A、17-79A、P03A、P05A具有高配合力，与恢复系选配出的优良组合一般比抗虫常规陆地棉品种增产15％以上。
实施例三陆地棉恢复系及转抗虫基因恢复系选育以0-613-2R为起始恢复系，与生产上广泛种植的常规陆地棉杂交后并与不育系测配，筛选获得聚合了0-613-2R中的恢复基因以及常规陆地棉中的恢复加强基因的恢复系，并自交纯合，育成新型恢复系18R、19R和20R。新型恢复系与104-7A来源的不育系杂交，其F1的恢复株率和恢复度均达到了100％，而且可育性稳定。在此基础上，利用花粉管通道法分期、分批进行Bt GFM cry1A单价抗虫基因(ZL 95 119563.8)、Bt GFM cry1A+cpti双价抗虫基因(ZL 98 1 02885.3)以及cryci融合抗虫基因(200510076823.3)三类不同的抗虫基因导入，经过卡那霉素初筛、PCR分子鉴定，目前已获得转单价抗虫基因的T0代恢复系32株；转双价抗虫基因的T0代恢复系26株，转融合抗虫基因的T0代恢复系8株。
将T0代转基因植株种成株行，观察转基因植株的农艺性状、抗虫基因的遗传稳定性以及抗虫基因的表达特性，同时与不育系杂交判断其育性恢复能力。经过筛选，将农艺性状表现优良、抗虫基因遗传稳定且抗虫性好、育性恢复完全的株行保留下来继续进行系选和配合力测定，目前已获得配合力好、恢复性状稳定的抗虫恢复系AsR(单价)、BsR(单价)、CsR(单价)、R1F-8(双价)、14R(双价)、30R(双价)、FK18R(融合)等7个。
实施例四抗虫三系杂交棉组合选配利用选育的恢复系或抗虫恢复系与抗虫不育系组配，目前已筛选出皮棉超过常规抗虫对照sGK321 15％的组合8个，而两个优质棉组合L14AF1、P80AF1也分别比对照增产12％和6％，抗虫三系杂交棉银棉2号在全国棉花区试黄河流域春棉组中，籽棉、皮棉、霜前皮棉两年平均分别比对照中棉所41增产21.1％、26.4％和29.1％，均居两年参试品种第一位。于2005年通过国家棉花专业委员会的审定，成为第一个通过国家审定的三系杂交棉。目前，尚有GKz11、GKz28、sGKz6、sGKz34等4个组合正在参加全国棉花区试。
权利要求
1.一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于它的步骤如下1)采用基因导入技术，将单价、双价、融合抗虫基因导入系统选育的棉花恢复系中，育成对细胞质雄性不育系的育性恢复率达100％的、抗虫性稳定的转抗虫基因恢复系及其衍生系；2)采用基因导入技术，将单价、双价、融合抗虫基因导入农艺性状优良的陆地棉品种中，育成对细胞质雄性不育系的保持率和保持度达100％的、抗虫性稳定的转抗虫基因保持系及其衍生系；3)采用不育系与保持系杂交转育的方法，将抗虫基因转育到细胞质不育系中，育成对棉铃虫和红铃虫等鳞翅目害虫具有抗虫性的转基因抗虫不育系及其衍生系；4)以抗虫不育系为母本，以抗虫恢复系为父本，测交和筛选出抗虫杂种F1组合；5)F1组合经过品种区域试验和生产试验，选育出品质优良、抗虫性强、一般可增产20～30％的能用于生产的F1组合。
2.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的抗虫基因是指GFMCry1A单价抗虫基因；GFMCry1A加cpti双价抗虫基因和GFMCry1A基因与cpti基因相融合的融合抗虫基因cryci，基因的表达产物对棉铃虫和红铃虫等鳞翅目害虫有毒杀作用。
3.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的转抗虫基因的三系是指陆地棉细胞质雄性不育系、保持系和恢复系，并且三系均具有稳定的抗虫性。
4.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的转抗虫基因是指用基因导入和转育方法，将抗虫基因转入三系中的过程。
5.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的衍生系，是指以转抗虫基因的保持系、不育系、恢复系为基础材料而育成的有血缘关系的抗虫保持系、抗冲不育系和抗虫恢复系。
6.根据权利要求1-(3)所述的细胞质雄性不育，其特征在于所说的细胞质雄性不育是指陆地棉细胞质与细胞核互作的质核互作不育遗传类型。
7.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的测交和筛选是指雄性不育系与其相应恢复系杂交所获杂种F1在产量、品质和抗虫性上的优势测定和选择。
8.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的分子育种是指从分子水平的层次上，用基因工程技术与常规转育方法相结合，培育三系杂交棉新种子的技术，及其应用是指培育的新种子应用于棉花生产中。
9.根据权利要求1所述的一种转抗虫基因的三系杂交棉的分子育种技术及其应用，其特征在于所说的F1组合是指经过三系杂交所培育的品质优、抗虫性强、产量高、并能应用于棉花生产的第一代棉花杂交新种子。
全文摘要
本发明提供了一种高产三系杂交棉的分子育种方法。育成抗虫性稳定、不育株率和不育度均为100％的转基因细胞质雄性不育系；育成抗虫性稳定、对细胞质雄性不育系恢复率和恢复度均达100％的转基因陆地棉恢复系；抗虫恢复系与不育系杂交，后代表现出高产、优质、抗虫等强的超亲杂种优势，一般可比常规对照增产皮棉20％～40％。
文档编号A01H1/06GK1771792SQ20051010911
公开日2006年5月17日 申请日期2005年10月18日 优先权日2005年10月18日
发明者郭三堆, 张锐, 王远 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 郭三堆