专利名称：：筛查检测线粒体dna片段缺失的序列、试剂盒及筛查检测方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
。具体地说，涉及线粒体DNA片段缺失筛查检测的核苷酸序列、试剂盒和筛查检测方法，以及它们的应用。
背景技术：
：线粒体是哺乳动物(包括人类)细胞内最重要的细胞器之一，它的功能是参与细胞内糖类、脂类、蛋白质等物质的代谢，为细胞提供能量来源。同时，线粒体还参与血红蛋白合成、尿素代谢、氧自由基等重要物质的代谢活动。除此之外，线粒体还是细胞凋亡的信号枢纽，决定每个细胞的生存与死亡。因此线粒体的功能异常与生长、发育、衰老、肿瘤、免疫等重要的生理和病理状态有关。每个线粒体都有很多线粒体DNA分子，这些DNA分子是真核细胞除细胞核以外唯一存在的DNA分子，它们编码37个与线粒体功能密切相关的重要基因。线粒体DNA分子的重要特征之一在于没有内含子，因此每个编码基因之间相互连接甚至有部分重叠。在这种状态下，每个线粒体DNA片段的缺失都会造成线粒体DNA编码基因的不完整，从而出现其编码蛋白质的功能缺陷。如果人体内的每个细胞内的线粒体蛋白都有一定的缺陷，那么将给健康带来灾难性的后果，这就是为何由线粒体DNA片段缺失造成的疾病都很严重而且影响多个器官的重要原因。患有此种疾病的患者的健康状态很差，寿命较短，更甚之，这类疾病有些可以遗传，有些是获得性的，因此对于此类疾病的筛查与诊断具有极其重要的临床意义。线粒体DNA(mtDNA)本身是一个环形的双链DNA分子，正常人的线粒体DNA的长度是固定的，如果发生了线粒体DNA片段缺失，一个正常的线粒体DNA分子的环将缩小，所缩短的长度即所缺失的长度。到目前为止，在全世界范围内发现的导致人类疾病的各种线粒体DNA缺失有107种，其中有85%的缺失范围在轻链序列第5098至第15913位碱基之间。然而目前这些已经发现的线粒体DNA缺失都是通过各种不同的方法发现的，尚未有一种简单、通用的方法能够快速做出检测。在罹患与线粒体相关的疾病的患者或具有罹患该疾病风险的携带者的每个肌肉细胞或血液的有核细胞内，通常携带有正常的线粒体DNA和发生了片段缺失的线粒体DNA，通过PCR扩增这两类DNA分子，并且利用琼脂糖凝胶电泳可将两类扩增片段分开。因此只要在扩增及电泳后，在同一电泳道内存在两条或两条以上条带的，即为线粒体DNA片段缺失的携带者，或者患者。这种检测可以满足临床或实验室做出分子诊断的需求，医生可以根据需要选择其他的诊断方法进行相互验证。
发明内容为了解决现有技术中的问题，本发明的一个目的在于提供一组检测线粒体DNA片段缺失的核苷酸序列，用于线粒体DNA片段缺失的快速、准确检测。本发明的另一个目的在于提供一种用于临床和实验室筛查检测线粒体DNA片段缺失的试剂盒，实现了线粒体DNA片段缺失的简单、准确、快速地检测。本发明的另一个目的在于提供一种用于临床和实验室筛查检测线粒体DNA片段缺失的方法，实现了线粒体DNA片段缺失的简单、准确、快速地检测。根据本发明的一个方面，该检测线粒体DNA片段缺失的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.2所示的序列组成，用作扩增引物。根据本发明的一个方面，该试剂盒包括引物A、引物B、公共液C，引物A的核苷酸序列为5'TCCTAACTACTACCGCATTCCTACTAC3'(SEQIDNO.1)，引物B的核苷酸序列为5'TTTCATCTCCGGTTTACAAGACTG3'(SEQIDNO.2)，两种引物分别对应于人类线粒体DNA轻链序列的第5098-5124位碱基和第15913-15936位碱基，公共液C为等量混合的dATP、dTTP、dCTP、dDTP核苷的无菌双蒸去离子水溶液。根据本发明的一个方面，利用本试剂盒扩增正常人线粒体DNA分子可得到10815bp片段，而可以检测到的线粒体DNA缺失片段长度在IOObp10.8kb之间，且缺失片段位于人类线粒体DNA轻链序列的nt5098-ntl5936之间。根据本发明的一个方面，本发明试剂盒可为50次反应容量(按照每次ΙΟΟμ1总反应体系计算)，具体地包括引物A和引物B粉末各IOnmol，每种引物单独封装于1.5mlEppendorf管内，反应公共液C4.5ml，于白色塑料瓶内封装很显然，本领域已知或未来常规使用的其它贮藏容器也可用于本发明。根据本发明的一个方面，本发明的试剂盒可保存在4°C或更低的温度条件下，例如-20°C或更低，有效期可达半年。本发明试剂盒可进一步包括说明书。本发明的试剂盒可以弥补现有技术的不足，实现一步法简单、快速地对人类线粒体DNA的片段缺失进行筛查，并且可以对导致人类疾病的85%的线粒体DNA片段缺失进行准确筛查检测。进一步地，本发明的试剂盒可用于对由于线粒体DNA片段缺失所造成的疾病进行分子病原学和分子遗传学检测、诊断和分析。根据本发明的一个方面，用于筛查检测线粒体DNA片段缺失的方法包括获得受试者线粒体DNA作为模板；用无菌双蒸去离子水溶解SEQIDN0.1所示序列的引物A和SEQIDN0.2所示序列的引物B；用无菌双蒸去离子水溶解等量混合的dATP、dTTP、dCTP、dDTP来配制PCR扩增反应公共液C，进行PCR反应，电泳检测。根据本发明的一个方面，从受试者的肌肉、血液或其他组织样品内提取线粒体DNA作为模板，使用时稀释成浓度为lOOng/μ1的浓度。根据本发明的一个方面，溶解引物包括在3000-6000转/分钟的转速下，对引物A和引物B室温离心5-40秒，然后分别加入室温100μ1无菌去离子水，室温静置5分钟，混悬约10-20秒，分装，置于_20°C保存备用。根据本发明的一个方面，配制PCR扩增反应公共液C包括等量混合200nmol/L的四种脱氧单三磷酸核苷溶液(包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，然后将其与灭菌双蒸去离子水按照1？乂的体积比例混合，使得在最终反应体系中的终浓度为^^^！！！^丨/!。根据本发明的一个方面，向PCR反应体系中按照反应体系缓冲液为101的体积比加入IOXlongPCR缓冲液；按照反应体系taqDNA聚合酶=1001的比例加入TaqDNA聚合酶(活性为5U/μ1)。根据本发明的一个方面，用于扩增线粒体DNA序列的PCR反应体系按体积(μ1)计为PCR缓冲液(10倍浓度)弓丨物A溶液(ΙΟμπιοΙ/弓丨物B溶液(10μmol/L)TaqDNA聚合酶溶液(活性为5υ/μ1)模板DNA溶液(浓度为lOOng/μ1)公共液C=10221184。根据本发明，PCR体系中各种成分的终浓度为①PCR缓冲液1倍浓度；②引物A溶液200nmOl/L；③引物B溶液200nmOl/L；④TaqDNA聚合酶0.05U/μ1；⑤模板DNA溶液=Ing/μ1；⑥公共液C10_30nmol/L。根据本发明的一个方面，用于扩增线粒体DNA序列的longPCR反应条件为①94°C预变性310分钟；②随后是2045个循环，具体如下9495°C1060秒，55-700C2060秒，60_75°C510分钟；③72°C515分钟；④4°C0分钟24小时。根据本发明的一个方面，将PCR反应产物在0.8%的琼脂糖凝胶上以低电压进行电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪观察电泳结果。利用本发明方法扩增受试者的线粒体DNA样品，可以快速地检测发生了片段缺失的线粒体DNA。进一步地，可以对由于线粒体DNA片段缺失所造成的疾病进行分子病原学和分子遗传学检测、诊断和分析。根据本发明的一个方面，用于筛查检测线粒体DNA片段缺失的方法进一步包括对PCR扩增检测结果进行判读，该判读的方法包括若只有一条长度约为10.Skb的扩增条带，则说明该DNA供者的该组织细胞不存在常见的线粒体DNA缺失；若除了长度为约10.Skb的扩增条带之外，还有另外一条或几条长度不同且均小于10.Skb的条带，则说明该DNA供者的该组织细胞存在线粒体DNA缺失，其缺失的长度约为10.8kb-(除去该约10.Skb条带以外的其它电泳条带所代表的PCR产物长度)；在此基础上，可进一步研究以确定该患者所缺失的mtDNA片段的确切起始和终止位点。本发明试剂盒和检测方法的有益效果是可以一次性检测多达49个基因组DNA样品中线粒体DNA的缺失片段，方法简单，可以实现批量操作；结果判定直观、准确、可靠，是线粒体病诊断方法的显著进步。利用本发明的试剂盒和检测方法可以早期发现携带线粒体DNA缺失但尚未出现临床症状的携带者，有利于医生作出早期诊断。本发明可应用于临床和实验室筛查、检测及诊断由于线粒体DNA片段缺失而导致的诸多常见的、严重疾病，这些疾病包括但不限于=Kearns-Sayre综合症(Kearns-SayreSyndrome)、个曼性进冲亍性目艮夕卜肌麻搏(Chronicprogressiveexternalophthalmoplegia,CPE0)、Pearson综合症(PearsonSyndrome)、婴儿肌病和乳酸中毒(致命和非致命性)(Infantilemyopathyandlacticacidosis(fatalandnon-fatalforms))>Leigh症(LeighSyndrome,LS)、神经源性肌无力合并共济失调和视网膜色素变性(Neurogenicweaknesswithataxiaandretinitispigmentosa,NARP)、线粒体脑肌病合并乳酸血禾口中M胃fN(Mitochondrialencephalomyopathywithlacticacidosisandstroke-like印isodes，MELAS)、肌阵挛性癫痫合并碎红纤维(Myoclonicepilepsywithragged-redfibers,MERRF)等。图1是使用本发明试剂盒对Kearns-Sayre综合症患者及其亲属进行聚合酶链式反应(PCR)后的琼脂糖凝胶电泳检测的电泳图，其中第1泳道正常对照；第2泳道患者肌肉样品；第3泳道患者血样品；第4泳道患者亲属B的血样；第5泳道患者亲属A的血样；第6泳道患者亲属A的肌肉样本’第7泳道患者亲属C的血样；N道NTC；MlGeneRulerIKbMarker；M2λ-Ecot14DNAladder。图2示出进行本发明longPCR反应的条件。具体实施例方式下面结合一例Kearns-Sayre综合症的分子遗传学和分子病因学检测及诊断对本发明的实质性内容进行进一步说明，但本发明并不局限于此。除非特别指出，否则实例中的试剂药品材料均为市售可得，方法参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell，第三版)。实施例1、取1位Kearns-Sayre综合症患者及其任3位亲属。利用蛋白酶K和苯酚法提取该患者及其亲属A的肌肉和血液样品，其亲属B、亲属C的血液样品，以及另外提取正常人的血液样品作为对照。抽提所有样品的基因组DNA，通过紫外分光光度计测量DNA浓度后于4°C保存，取5μ1稀释到浓度为IOOng/μ1备用。实施例2、设计并合成IOnmol的引物A5'TCCTAACTACTACCGCATTCCTACTAC3'和IOnmol的引物B:5'TTTCATCTCCGGTTTACAAGACTG3'，在3000-6000转/分钟的转速下，室温离心分别装有两个引物的离心管5-40秒，然后各取室温100μ1无菌去离子水，分别加入两个引物管内配制10μmol/L的引物液，室温静置5分钟，混悬约10-20秒。实施例3、等量混合各200nmol/L的四种脱氧单三磷酸核苷(即dATP、dGTP、dCTP、dTTP)溶液，然后将其与灭菌双重蒸馏去离子水按照17.4的体积比例混合得到用于扩增线粒体DNA序列的公共液C。按照表1所示配制反应体系，将配好的反应体系分装到薄壁PCR管内，进行PCR扩增，反应条件如下所示，循环数为30。表1:longPCR的反应体系(100μ1总反应体系)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>longPCR反应条件如图2所示。实施例4、将PCR反应产物与6X上样缓冲液按照15的体积比混勻，用浓度为0.8%(g/100ml)的琼脂糖凝胶，在25V/cm的电压下进行恒压电泳，电泳结束后，置于凝胶成像系统扫描并观察电泳结果，具体如图1所示。由图1中的电泳结果可见，对于以正常人的mtDNA作模板(第1泳道)的PCR扩增，由于正常人只有一种野生型的mtDNA，所以longPCR只能扩增出一种长度大约为Ilkb的片段。对于以患者的mtDNA作模板(第2、3泳道)的PCR扩增，由于存在野生型的mtDNA和有片段缺失的mtDNA，所以longPCR扩增出来两种长度的产物，一条带的长度和正常对照者的产物长度相同，约为llkb，说明这是野生型mtDNA作模板扩增出来的产物；另外一条短的扩增产物的长度大约是1.5kb，这是由于患者的血样和肌肉样品内有异常的mtDNA，在同一体系中被同时扩增所致，其片段缺失的长度大约为10.8-1.5=9.3kb。此外，第2、3泳道各条带的亮度不同，这意味着野生型mtDNA与突变型的mtDNA在患者的血液和肌肉中的比例不同。第4、6泳道分别是对患者亲属B的血液、亲属A的肌肉样品中的mtDNA的扩增结果，可见除了一条与正常人相同的条带外，还各有一条非常弱的与有片段缺失的mtDNA扩增的产物相同的条带，亲属B的比亲属A的还强一些。第5、7泳道分别是以患者的亲属A和亲属C的血液中提取的mtDNA扩增的结果，可见只有一条和正常人相同的条带。这一结果提示，在患者的肌肉及血液中存在mtDNA片段缺失。此外，患者亲属B的血液样品和亲属A的肌肉样品中也存在同样的片段缺失，只是与野生型的mtDNA相比，比例都非常的低，而且在亲属A肌肉中mtDNA片段缺失的比例更低。在患者的亲属A和亲属C的血液mtDNA中没有检测到异常mtDNA。进一步地，可对亲属A和B进行进一步地或者其他研究，以确定他们是否出现临床症状，从而实现对疾病的早期诊断。BJ87-09P106943序列SEQUENCELISTING<110>解放军总医院<120>筛查检测线粒体DNA片段缺失的序列、试剂盒及筛查检测方法<160>2<170>PatentInversion3.4<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(27)<223><400>1TCCTAACTACTACCGCATTCCTACTAC27<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(24)<223><400>2TTTCATCTCCGGTTTACAAGACTG2权利要求一组检测线粒体DNA片段缺失的核苷酸序列，其特征在于，由SEQIDNO.1所示的序列和SEQIDNO.2所示的序列组成，用作扩增引物。2.一种检测线粒体DNA片段缺失的试剂盒，包括如SEQIDNO.1所示序列的引物A，如SEQIDNO.2所示序列的引物B,以及公共液C，为等体积混合的dATP、dTTP、dCTP、dDTP核苷的无菌双蒸去离子水溶液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为50次反应容量，包括分别单独封装的引物A和引物B粉末各lOnmol，以及单独封装的反应公共液C4.50ml。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测长度在IOObp至10.8kb之间的线粒体DNA片段缺失，并且缺失的片段位于线粒体DNA轻链序列的nt5098-ntl5936之间。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒保存于4°C或更低温度下。6.一种检测线粒体DNA片段缺失的方法，包括(a)获得受试者组织的线粒体DNA作为模板，(b)用无菌双蒸去离子水溶解如SEQIDNO.1所示序列的引物A和如SEQIDNO.2所示序列的引物B，(c)用无菌双蒸去离子水溶解等量混合的dATP、dTTP、dCTP、dDTP来配制PCR扩增反应公共液C，以及(d)进行PCR反应，电泳检测。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述PCR反应以下述条件进行各成分的终浓度为①PCR缓冲液1倍浓度；②引物A溶液200nmOl/L；③引物B溶液200nmol/L；④TaqDNA聚合酶0.05U/μ1；⑤模板DNA溶液lng/μ1；⑥公共液C:10-30nmol/L；PCR反应条件为①94°C预变性310分钟；②随后是2045个循环，具体如下9495°C1060秒，55_70°C2060秒，60-75°C510分钟；③72°C515分钟；④4°C0分钟24小时。8.根据权利要求6或7所述的方法，进一步包括(e)对PCR扩增检测结果进行判读，其中若只有一条长度约为10.Skb的扩增条带，则说明该DNA供者的该组织不存在常见的线粒体DNA缺失；若除了约10.Skb的扩增条带之外，存在一条或多条长度不同且均小于10.Skb的条带，则说明该DNA供者的该组织存在线粒体DNA缺失。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述缺失的长度约等于(10.8kb-同一泳道中所述一条或多条长度不同且均小于10.Skb的条带所代表的PCR产物长度的和)。10.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，自肌肉、血液或其他组织样品获得受试者组织的线粒体DNA。全文摘要本发明公开了一组筛查检测人类线粒体DNA片段缺失的序列、一种筛查检测人类线粒体DNA片段缺失的试剂盒及其使用方法和结果的判读方法。该序列具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸。通过使用该试剂盒对受试者的基因组DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，可快速地筛查临床常见的绝大多数线粒体DNA片段缺失，为临床常见的由线粒体DNA片段缺失而造成的严重疾病提供分子检测及诊断依据，这些疾病包括Kearns-Sayre综合症、慢性进行性眼外肌麻痹、Pearson综合症、婴儿肌病和乳酸中毒、Leigh综合症、神经源性肌无力合并共济失调和视网膜色素变性、线粒体脑肌病合并乳酸血症和中风样发作、肌阵挛性癫痫合并碎红纤维等。文档编号C12Q1/68GK101818193SQ20091023730公开日2010年9月1日申请日期2009年11月13日优先权日2009年11月13日发明者戴朴,杨仕明,杨伟炎,翟所强,赵立东,韩东一申请人:中国人民解放军总医院