于300g离心lOmin后，上层的血浆单独取出用于制备低血小板血浆(用于制备后续的免疫细胞培养液)；
[0060]离心之后的下层含血细胞的沉淀物，用注射用生理盐水重悬至每管30ml悬浊混合液；
[0061]S13，再取4支含15ml淋巴细胞分离液的50ml离心管，缓慢的将步骤S12的悬浊混合液用移液器转移到淋巴细胞分离液的上层；400g离心20分钟后将中间白膜层吸入到新的50ml离心管中，所得的白膜层即为单个核细胞；
[0062]同时，重复3?4次用注射用生理盐水补液到45ml后，300g离心5分钟，对单个核细胞进行清洗，清洗完之后离心搜集单个核细胞的细胞体；
[0063]S14，将步骤S13获得的单个核细胞用20ml基础培养液重悬，并将悬液加至含30个胶原支架的T75培养瓶中培养2?3h，之后将不贴壁细胞倒入另外一个T175培养瓶中，并用基础培养液补足T175培养瓶的培养液到50ml，并加入0.5ml PPP和50ul IFN- γ (终浓度为1000IU/ml)培养；这里需要说明的是T175培养瓶中进行选择性培养之后得到从不贴壁的单个核细胞中的CIK ;
[0064]S15，将不贴壁细胞去除后，向T75培养瓶中加入20ml免疫细胞培养液A进行选择培养，即可获得贴壁的单个核细胞中的DC ;
[0065]其中，免疫细胞培养液A:含1 % PPP、终浓度为50ng/ml的GM-CSF、终浓度为500IU/ml的IL-4的基础培养液。
[0066](3)分别培养DC和CIK
[0067]S21，将步骤S14中培养CIK的T175培养瓶培养2d，向T175培养瓶中加入20mL免疫细胞培养液B ;其中，免疫细胞培养液B:含终浓度为100IU/ml的IL-1 α、终浓度为50ng/ml的抗⑶3单抗、终浓度为300IU/ml的IL-2的基础培养液。
[0068]S22，将步骤S15中培养DC的T75培养瓶培养时间至4d，用免疫细胞培养液A进行半量换液；
[0069]在同时在T175培养瓶的CIK培养至4d时，向T175培养瓶中补加扩增培养液B到100ml ；
[0070]S31，制备诱导活化剂:将 lmL 的 50ug/mL EGFR(美国 Life Technologies 公司)和lmL的招盐佐剂(终浓度为0.125%，为质量体积比，丹麦Brenntag B1sector公司)混合，于4°C进行预吸附；
[0071]S32，诱导:当T75培养瓶的DC培养至第6d时，向T75培养瓶中加入预先进行吸附的DC诱导活化剂，进行诱导；
[0072]同时，将T175培养瓶中的CIK转入培养袋中培养，补加扩增培养液到300ml ;此步骤中采用的扩增培养液为含1% PPP、终浓度为300IU/ml的IL-2的基础培养液；
[0073]S40，在步骤S32进行约诱导Id之后，向T75培养瓶中，加入20ul TNF_a(肿瘤坏死因子，终浓度为20ng/ml)，最终促进DC成熟和稳定。
[0074](4) DC-CIK 共培养:
[0075]S50，在步骤S40加入TNF_ α —天以后，用细胞刮刀刮下T75培养瓶中的DC，加入到CIK培养中进行共培养，并补加扩增培养液到600ml ;再过2d之后搜集细胞。
[0076](4)为了验证本发明方法的进步性，需要对其所获得的细胞的能效进行鉴定，已验证类型是否准确真实，以及能效是否确实有提升，而由于DC细胞的培养方法的有益效果是DC吞噬提呈抗原的能力增强，该效果没有直接的检测指标，只能间接通过共培养后CIK的增殖能力和表型分析的结果来反映该效果，具体:
[0077]1、用台盼蓝染色法计数CIK，计算其增殖倍数。
[0078]2、取诱导14天的CIK细胞，经PBS洗涤2遍后，各取1Χ 106/100 μ1置于falcon管中，分别加入20 μ 1鼠抗人荧光素标记的⑶3、⑶16、⑶56、⑶3/⑶56及同型对照IgGl/IgGl，4°C避光孵育30min，PBS洗涤2遍后流式细胞仪上机分析。
[0079]其中，上述每项的检测重复3个对照，最终取结果平均值；CIK增殖倍数的平均结果为4?5x10s，相比通常的CIK的2?3xl07的增殖能力有显著的提升，且表型检测的最终确定类型确实为CIK。
[0080]3、在上述共培养获得的CIK体外性能测试之后，进一步进行最终的肿瘤杀伤能力测验:
[0081]将本发明的细胞作为实验组、与靶细胞组和效应细胞组共同组成三个对照组，取96孔培养板，每孔内实验组加入效应细胞(CIK)和靶细胞(K562细胞)各100 μ L，效靶比为25:1，效应细胞为1.25Χ 105个，靶细胞为5000个；靶细胞组加入靶细胞和培养液各100 μ L ;效应细胞组加入效应细胞和培养液各100 μ L，各组设置3个平行复孔。置37°C培养箱孵育4h，加入MTT 20 μ L，再孵育4h，离心后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMS0) 150 μ L，充分溶解后于酶联免疫检测仪(波长为570nm)检测每孔吸光度值A，用以下公式计算杀伤率=[1-(A实验孔-A效应孔)/A靶细胞孔]X 100% ;
[0082]本发明实验组最终计算后的杀伤率为78.6% (重复3次的平均数)，相比通常DC-CIK细胞诱导培养3周后，按照效靶比为15:1?20:1时检测的杀伤率55?65%提升了 10%多，因此可以说明本发明制备的DC和CIK更好的细胞活性和肿瘤杀伤效力。
[0083]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种DC诱导活化剂，其特征在于，包括小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂。2.如权利要求1所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂的质量比为2:1?8:1。3.如权利要求1或2所述的DC诱导活化剂，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝、氢氧化铝凝胶、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾中的至少一种。4.一种DC体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 获取DC，对所述DC进行体外培养； 在所述体外培养的过程中，用DC诱导活化剂对所述DC进行诱导处理；其中，所述DC诱导活化剂为权利要求1?3任一项所述的DC诱导活化剂。5.如权利要求4所述的DC体外培养方法，其特征在于，对所述DC进行诱导处理之后还包括，用TNF- α对所述DC进行刺激处理。6.如权利要求4或5所述的DC体外培养方法，其特征在于，对所述DC进行体外培养的过程中，采用的培养液为含有60?100IU/ml硫酸庆大霉素、0.5?1.5% PPP、40?60ng/ml 的 GM-CSF、450 ?550IU/ml 的 IL-4 的 DMEM。7.—种根据权利要求4?6任一项所述的DC体外培养方法制备的DC。8.—种CIK，其特征在于，该CIK为采用权利要求7所述的DC进行DC-CIK共培养制备获得。
【专利摘要】本发明提供了一种DC诱导活化剂，包括小细胞肺癌特异性EGFR和铝佐剂。本发明的上述DC诱导剂利用EGFR本身具有很多肿瘤细胞表面结构簇，在DC进行培养的过程中作为模拟抗原对DC进行刺激和诱导，使其细胞活性能维持在较高的状态；同时搭配铝佐剂形成EGFR缓释，以及保护EGFR降解、衰减，还与DC质膜相互作用，最终能强化DC对抗原的处理和提呈能力。本发明还提出采用上述DC诱导活化剂进行DC体外培养的方法、由该方法获得的DC，以及将该DC应用于DC-CIK联合免疫，进行DC-CIK共培养制备的CIK。相比现有的通常培养的方式制备的DC和CIK，DC活性和增值能力高，DC经过EGFR的诱导，能提呈更多的抗原信息，使得最终制备得到的CIK具有更高的活性和肿瘤特异性杀伤能力。
【IPC分类】C12N5/0784, C12N5/0783
【公开号】CN105385658
【申请号】CN201510894798
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月8日