诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程领域，尤其是涉及一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝 细胞的方法及肝细胞。
【背景技术】
[0002] 异体肝脏移植被认为是目前治疗终末期肝病的最有效手段，移植后长期生存率可 达70 % -85 %。然而有限的肝脏供体远远不能满足临床需求，据报道，等待肝移植的患者在 等待期病死亡率达15%。目前针对肝功能衰竭的其他治疗方法包括通过膜滤或树脂交换作 用的体外人工肝、体外应用同种或异种肝细胞的生物人工肝以及体内肝细胞移植等。
[0003] 上世纪70年代以细胞为基础治疗引起广泛关注，人胎肝治疗有着很好的临床的 效果。向德栋等选取了 40例慢性重型乙型肝炎患者，均有不同程度的乏力、纳差、腹胀等 消化道症状，在20例患者中采用非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗重型肝炎，有8例患 者病情自然恢复，4例患者成功过度行肝移植治疗，好转存活率达60 %，采用单纯非生物人 工肝支持治疗好转存活率仅为45%，其疗效不如非生物人工肝联合肝胎细胞悬液治疗。郑 宣鹤等采用血浆置换联合胎肝细胞悬液治疗138例患者，临床好转存活99例，有效提高了 重型肝炎患者的好转治愈率，疗效优于单用胎肝细胞悬液或血浆置换组，而单用血浆置换 组与单用肝胎细胞悬液组差异无显著性，该结果与大岛宣雄等单用血浆置换治疗117例患 者，存活率仅24%等报道结果相符。但是因胎肝来源等存在伦理问题，人胎肝治疗已被禁 止。有研究表明通过对慢性肝衰竭患者进行MSC(Mesenchymal Stem Cell，间充质干细胞） 移植，可以改善肝功能和临床症状，且未出现严重不良反应。并且MSC不表达MHC- II类分 子，低表达甚至不表达MHC- I类分子，几乎不存在免疫排斥问题。但是自体骨髓MSC也具有 一定的局限性：如患者凝血功能差影响骨髓采集、患者自体细胞数量不足及增殖活性低下， 因而限制了临床应用。
[0004] 随着2007年11月，美国和日本的两个研究小组几乎同时宣布成功将人体皮肤细 胞改造成几乎可以和胚胎干细胞相媲美的诱导性多能干细胞一"iPS细胞"，回避了历来 已久的伦理争议，解决了干细胞移植免疫排斥问题，在生命科学基础研究和医学领域的优 势已日趋明显。
【发明内容】
[0005] 基于此，有必要提供一种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法及肝细 胞。
[0006] -种诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：
[0007] 步骤Sl，提供或制备诱导性多能干细胞；
[0008] 步骤S2,将所述诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素 A和Wnt3a的 RPTM-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素 A及胎牛血清的RPTM-1640培养 基，使所述诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化；
[0009] 步骤S3,将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎牛 血清的K0/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨 基酸、β -巯基乙醇及二甲基亚砜的K0/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分 化；
[0010] 步骤S4,将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑 瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。
[0011] 在其中一个实施例中，在所述步骤Sl中，采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、 miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，诱导所述人类细胞分化为诱 导性多能干细胞；所述诱导因子包括0CT4、S0X2、NANOG及Lin28。
[0012] 在其中一个实施例中，在所述步骤S2中，使用所述添加有人活化素 A和Wnt3a 的RPTM-1640培养基培养22-50小时后，更换使用所述添加有人活化素 A及胎牛血清的 RPTM-1640培养基培养46-98小时，并且在后续培养过程中每22-26小时更换一次培养基。
[0013] 在其中一个实施例中，所述添加有人活化素 A和Wnt3a的RPTM-1640培养基中所 述人活化素 A的浓度为5-300ng/ml，所述Wnt3a的浓度为20-100ng/ml。
[0014] 在其中一个实施例中，所述添加有人活化素 A及胎牛血清的RPTM-1640培养基中 所述人活化素 A的浓度为10-200ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为0. 2-2%。
[0015] 在其中一个实施例中，在所述步骤S3中，使用所述添加有角质细胞生长因子和胎 牛血清的K0/DMEM培养基培养22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必 需氨基酸、β -巯基乙醇及二甲基亚砜的K0/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过 程中，每隔22-26小时更换一次相应的培养基。
[0016] 在其中一个实施例中，所述添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的K0/DMEM培养 基中所述角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，所述胎牛血清的体积浓度为2-3%。
[0017] 在其中一个实施例中，所述添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、 β -巯基乙醇及二甲基亚砜的K0/DMEM培养基中所述血清替代物的体积浓度为20%，所述 L-谷氨酰胺的浓度为1-3禮，所述非必需氨基酸的质量浓度为0. 1-15%，所述β-巯基乙醇 的浓度为〇. 1-0. 12mM，所述二甲基亚砜的体积浓度为0. 2-2%。
[0018] 在其中一个实施例中，在所述步骤S4中，培养周期为142-242小时，且每个22-26 小时更换一次培养基。
[0019] 在其中一个实施例中，所述添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米 松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中所述胎牛血清的体积浓度为10%，所述肝细胞生长 因子的浓度为10_300ng/ml，所述抑瘤素的浓度为l-150ng/ml，所述地塞米松的浓度为 0. 05-1. 2 μ M，所述L-谷氨酰胺的浓度为2-3mM。
[0020] 本发明还提供了一种采用上述任一实施例所述的诱导性多能干细胞定向诱导分 化为肝细胞的方法构建得到的肝细胞。
[0021] 本发明通过合理的使用细胞生长因子提供一种优化的诱导性多能干细胞在体外 条件下定向诱导分化为肝脏前体细胞的方法，该方法在操作过程中可以随时观察细胞形态 的变化，确保诱导的正常进行，可以较为快捷且高效地诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导 性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无 feeder (饲养层细胞）的培养体系，仅 通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且经过检测，纯度较高。通过使用上述诱 导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导周期较短、效率高，且得到的肝细胞性 能稳定，不存在基质细胞污染的问题。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明实施例中hiPS诱导形成过程中细胞形态变化示意图，其中，A :人胚 胎成纤维细胞，B :病毒感染后第四天细胞形态，C :感染2周左右形成的非ES样克隆，D-F : 人feeder上传代培养的典型的iPS克隆，F :iPSCs周边自发分化的克隆，A-D和F标尺为 200 μ m，E 标尺为 50 μ m ;
[0023] 图2为本发明实施例1hiPSCs中的全能型相关基因表达检测不意图；
[0024] 图3为本发明实施例hiPSCs与hESCs来源的EB不同分化时间点内、中、外三胚层 代表基因表达示意图，其中，S0X17 :内胚层，RUNXl :中胚层，PAX6 :外胚层；
[0025] 图4为本发明实施例hiPSCs中端粒酶水平检测示意图；
[0026] 图5为本发明实施例hiPSCs的免疫组化分析示意图，其中，A :AKP染色，B : SSEA-3, C :SSEA-4, D :TRA-1-60, E :TRA-1-81，F :0CT4, A 标尺为 200 μπι，B-F 标尺为 100 μ m ；
[0027] 图6为本发明实施例hiPSCs体外三胚层分化检测示意图，其中，A :B-tubulin/ DAPI，B :SMA/DAPI，C :AFP/DAPI，畸胎瘤组织切片显示三胚层来源的细胞D :软骨（中胚 层）；E :腺上皮细胞（内胚层）；F :色素细胞（外胚层）；
[0028] 图7为本发明实施例各阶段IPS细胞的形态变化情况；
[0029] 图8为本发明实施例AFP、ALB免疫荧光染色图；
[0030] 图9为本发明实施例RT-QPCR的检测结果
[0031] 图10为本发明实施例1CG胞吞与胞吐实验；
[0032] 图11为本发明实施例iPS来源的肝脏细胞具有合成糖原的能力；
[0033] 图12为本发明实施例iPS来源的肝脏前体细胞具有摄取低密度脂蛋白能力。
【具体实施方式】
[0034] 以下主要结合附图及具体实施例对本发明的诱导性多能干细胞定向诱导分化为 肝细胞的方法作进一步详细的说明。
[0035] -实施方式的诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，包括如下步骤：
[0036] 步骤Sl 10,提供