或制备诱导性多能干细胞。
[0037] 在本实施方式中，诱导性多能干细胞优选采用病毒感染、质粒转染、mRNA导入、 miRNA导入或化学分子添加方式将诱导因子导入人类细胞中，如导入至成纤维细胞等，诱导 人类细胞分化为诱导性多能干细胞。其中，诱导因子包括0CT4、S0X2、NAN0G及Lin28。成纤 维细胞可以为离体的成人、婴儿或胎儿的皮肤成纤维细胞等。可理解，在其他实施方式中， 诱导性多能干细胞不限于由人类皮肤成纤维细胞分化得到，也可以采用其他的人类细胞构 建得到。
[0038] 步骤S120，将诱导性多能干细胞初始培养在添加有人活化素 A和Wnt3a的 RPTM-1640培养基中，并在培养过程中更换添加有人活化素 A及胎牛血清的RPTM-1640培养 基，使诱导性多能干细胞向限定性内胚层诱导分化。
[0039] 在步骤S120中，使用添加有人活化素 A和Wnt3a的RPTM-1640培养基（即在 RPTM-1640基础培养基的基础上添加人活化素 A和Wnt3a，以下同理）培养22-50小时后， 更换使用添加有人活化素 A及胎牛血清的RPTM-1640培养基培养22-50小时，并且在后续 培养过程中每22-50小时更换一次培养基。在本实施方式中，添加有人活化素 A和Wnt3a 的RPTM-1640培养基中人活化素 A的浓度为5-300ng/ml，优选100ng/ml，Wnt3a的浓度为 20-100ng/ml，优选25ng/ml。添加有人活化素 A及胎牛血清的RPTM-1640培养基中人活化 素 A的浓度为10-200ng/ml，胎牛血清的体积浓度为0. 2-2%。
[0040] 进一步，在本实施方式中，在诱导性多能干细胞培养之前还包括对诱导性多能干 细胞进行复苏和增殖扩大培养的步骤。其中，复苏的步骤包括：将诱导性多能干细胞从液 氮罐中取出，立即于37°C恒温水浴箱中恒温解冻，离心弃上清取出二甲基亚砜，加入ES培 养基重悬细胞沉淀，将其种植到准备好的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上，每天换液一次，每 周传代一次。增殖扩大培养的步骤包括：在检测确定无支原体、细菌污染后，选取长势良 好的诱导性多能干细胞克隆，手工切割传代至预先包被好Matrigel胶的培养皿中培养，在 mTESR培养体系中培养细胞约2-4天后，换用鼠成纤维细胞条件培养基培养一天后更换诱 导培养基（即添加有人活化素 A和Wnt3a的RPTM-1640培养基）。
[0041] 步骤S130,将步骤S2培养得到的细胞初始培养在添加有角质细胞生长因子和胎 牛血清的K0/DMEM培养基中，并在培养过程更换添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨 基酸、β -巯基乙醇及二甲基亚砜的K0/DMEM培养基，使培养的细胞向肝系细胞定向诱导分 化；
[0042] 在步骤S130中，使用添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的K0/DMEM培养基培养 22-98小时后，再使用添加有血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇及二甲 基亚砜的K0/DMEM培养基培养118-170小时，并且在培养过程中，每隔22-26小时更换一次 相应的培养基。进一步，在本实施方式中，添加有角质细胞生长因子和胎牛血清的K0/DMEM 培养基中角质细胞生长因子的浓度为15-100ng/ml，胎牛血清的体积浓度为2-3%。添加有 血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β -巯基乙醇及二甲基亚砜的K0/DMEM培养基中 血清替代物的体积浓度为20 %，L-谷氨酰胺的浓度为1-3禮，非必需氨基酸的质量浓度为 0. 1-15%，β -巯基乙醇的浓度为0. 1-0. 12mM，二甲基亚砜的体积浓度为0. 2-2%。
[0043] 步骤S140,将步骤S3培养得到的细胞培养在添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、 抑瘤素、地塞米松及L-谷氨酰胺的L-15培养基中，促进肝细胞成熟。
[0044] 在步骤S140中，培养周期为142-242小时，且每个22-26小时更换一次培养基。 进一步，在本实施方式中，添加有胎牛血清、肝细胞生长因子、抑瘤素、地塞米松及L-谷氨 酰胺的L-15培养基中胎牛血清的体积浓度为10%，肝细胞生长因子的浓度为10-300ng/ ml，抑瘤素的浓度为l_150ng/ml，地塞米松的浓度为0. 05-1. 2 μ M，L-谷氨酰胺的浓度为 2_3mM〇
[0045] 本实施方式通过合理的使用细胞生长因子提供一种优化的诱导性多能干细胞在 体外条件下定向诱导分化为肝脏前体细胞的方法，该方法在操作过程中可以随时观察细 胞形态的变化，确保诱导的正常进行，可以随时剔除异常克隆，从而可以较为快捷且高效地 诱导出所需的肝脏前体细胞。该诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法采用无 feeder (饲养层细胞）的培养体系，仅通过加入相应阶段的诱导培养基就能获得肝细胞，且 经过检测，纯度较高。通过使用上述诱导性多能干细胞定向诱导分化为肝细胞的方法，诱导 周期较短、效率高，且得到的肝细胞性能稳定，不存在基质细胞污染的问题。
[0046] 以下为具体实施例部分：
[0047] -、所用到的试剂及其设备
[0048] I. iPSC(诱导性多能干细胞）：选择人类干细胞国家工程研究中心建系的2系人类 诱导多能干细胞。
[0049] 2.细胞培养试剂：
[0050] 人活化素 A(R&D，338-AC-050,即 R&DSystems 公司，货号 338-AC-050,以下同理）， Wnt3a(R&D，1324-WN-010)，胎牛血清（Life，10099141)，角质细胞生长因子（KGF) (R&D， 251-KG-050)，血清替代物（Life，N10828-028)，L-谷氨酰胺（Gibco, 25030-081)，非必需 氨基酸（Gibco, 1140-050)，β-巯基乙醇（Gibco,21985023)，二甲基亚砜（DMSO) (Sigma， D2650)，肝细胞生长因子（HGF) (R&D，294-HG-025)，抑瘤素（OSM) (R&D，295-0M-050)，地塞 米松（Calbiochem，265005)，mTESR(Stem cell，05850)，RPTM-1640 (Life，11875-085)，KO/ DMEM(Life，10829-018)，L-15(Life，21083-027)，Matrigel 胶（BD，354234)。
[0051] 二、具体的诱导及其鉴定过程
[0052] ( -）人iPSC细胞系的建系
[0053] 实验对象：分离得到的8-10周流产胎儿的皮肤成纤维细胞，该实验样品来自于湘 雅医院，本实施例的研究通过了中信湘雅生殖与遗传专科医院伦理委员会的讨论通过，并 且取得了流产胎儿亲人的同意。可理解，在其他实施例中，该皮肤成纤维细胞或者其他人类 细胞样本也可以取自一些样本冻存库或者治疗机构等。
[0054] 采用慢病毒感染的方法将0CT4、S0X2、NAN0G及Lin28四种诱导因子导入成纤维细 胞获得诱导性多能性细胞（iPSCs)。具体过程如下：
[0055] 将pOCT4、pS0X2、pNANOG、pLin28四个慢病毒质粒（质粒由湖南光诱高新生命科 技有限公司克隆制备）分别与慢病毒包装质粒PCMV8. 91、pCMV-VSVG混合，加入培养中的 293T细胞中，48小时后收取细胞上清，上清中即含有可用于感染的慢病毒颗粒。
[0056] 如图1所示，将上述4种慢病毒颗粒按照1 :1 :1 :1比例混合后加入培养中的皮肤 成纤维细胞中（图1A)，大约两周后有小克隆出现，部分克隆形态与hES克隆不同（图1C)， 部分克隆呈现典型的hES样，传代扩增可维持hES克隆样的形态（图1D-F)。从I X IO5的 hEF中大约有大于30个典型hES样克隆生长。经重复实验检测iPS的形成效率约为10 5 4。 在人feeder上培养的hES样的克隆，细胞紧密，核质比大，与hES相似（图1D-F)。培养过 程中同时可观察到iPS克隆周边出现自发分化（图1F)。这些克隆与hES相似，即为hiPS。 从本株成纤维细胞共分离了 16个iPS克隆，对其中hiPS-#2及hiPS-#5进行了细致的检测。 检测到与人类胚胎干细胞特性相同的克隆即为hiPSC，可用于下一步实验。具体检测如下：
[0057] I. 1多能性相关基因以及拟胚体（EB)分化基因的检测
[0058] 收集未分化hESCs、iPSCs和EB分化不同时间点的细胞，抽提RNA进行全能性相关 基因或分化基因的检测。方法如下：
[0059] I) RNA 抽提：
[0060] 收集相应的细胞，加 Iml的TRIZ0L，裂解细胞。每1ml TRIZOL加0. 2ml氯仿，在室 温下孵育2-3分钟。在4°C下12,000 Xg的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分 成三层，RNA存在于水样层当中。将水样层转移到一干净的试管中。加入0.5ml异丙醇充 分混合。将混合的样品在室温下孵育10分钟并在4°C下以不超过12, OOOg的离心力高速冷 冻离心10分钟。移去上层悬液。用75v/v% (即乙醇的体积分数为75%，以下同理）的乙 醇洗涤RNA沉淀一次，在2-8°C下以不超过7, 500g的离心力高速冷冻离心5分钟。简