5-羟色氨酸的前体定向生物合成的制作方法
【专利说明】5-羟色氨酸的前体定向生物合成
[0001] 本申请要求2014年9月2日提交的美国临时申请序列号62/044,667的权益，该 申请通过引用以其全文结合在此。
【背景技术】
[0002] 5-羟色氨酸（5-HTP)是一种天然的非蛋白原氨基酸，其充当神经递质血清素的直 接生物合成前体。中枢神经系统（CNS)中血清素不足被认为是抑郁症的一个重要的生理因 素。5-HTP已被证明对于治疗各种病况是有效的，包括抑郁症、失眠症、慢性头痛以及与肥胖 症有关的暴食。同时，它的副作用相对较少。5-HTP的治疗效果应归于其提高血清素在大 脑中合成的能力。5-HTP通过口服剂量很好地被吸收并且可以很容易地穿越血脑屏障（索 尔，1998,《替代医学评论》，3, 271-280)。在大部分欧洲国家，5-HTP是一种用于多种治疗目 的的常用处方药，而在北美市场，它被作为一种"非处方"膳食补充剂出售。
[0003] 目前，5-HTP通过从加纳籽中提取而获得，其是一种生长在非洲的木本的攀缘灌 木。该原材料的供应依赖于季节和地区，一直很大地限制其有成本效益的生产和广泛的临 床应用。此外，来自加纳籽的5-HTP被一种称为顶峰X的化合物污染，导致美国农业部暂时 地令该补充剂在美国下架。目前，5-HTP的大宗批发价格在400到1000美元/kg之间变动。 然而，尽管当前的生产成本高而且供应有限，5-HTP的全球市场仍然约50, OOOkg (整批价值 2-5千万美元）。
[0004] 发明概述
[0005] 本发明提供了新型的代谢改造微生物细胞，以及使用所述细胞用于从简单碳源 (例如，葡萄糖）进行微生物生产5-羟色氨酸（5-HTP)的方法。更特别地，本发明提供了新 型的微生物系统，其包括一种或多种基因工程化以表达全部或一部份用于5-HTP生产的新 型代谢途径的微生物细胞。该新型代谢途径使用一种或多种具有宽松底物选择性的酶，其 被有利地利用于该新型代谢途径中以催化涉及一种或多种非天然底物的反应。整个生物合 成途径可以被整合到单个微生物细胞；然而，已经发现当使用两种微生物细胞时5-HTP的 生产提高了，其中第一细胞整合该途径的上游部份，生产5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)中 间体，而第二细胞整合该途径的下游部份，生产5-HTP终产物。制造和使用该基因工程化细 胞的方法也被包含在本发明中，包括但并不仅限于制造5-HTP或其任一前体（例如，5-HAA) 的方法。这类方法可以包含在一定的条件下培养一种或多种在此描述的基因工程化细胞并 持续足以生产5-HTP或其任一前体的时间，并且可任选地分离产物。
[0006] 该方法可以进一步包含将5-HTP纳入一种食物产品中。该食物产品可以适合人类 食用和/或可以是动物饲料或饮料。该方法可以包含包装5-HTP或供出售的食物产品并 且可任选地向作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品的5-HTP或食物产品提供使用说明 书。在一个实施例中，该食品添加剂、食品补充剂或营养食品被包装作为动物饲料或饮料使 用。
[0007] 词语"优选的"和"优选地"指可以在某些环境下提供某些益处的本发明实施例。 然而，在相同或其他环境下，其他实施例也可以是优选的。另外，对一个或多个优选实施例 的描述不暗示其他实施例是无用的，并且不意图从本发明的范围中排除其他实施例。
[0008] 术语"包含"及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求书中出现的情况下，不 具有限制性含义。
[0009] 除非另外说明，"一个（a) "、"一种（an)"、"该（the)"、和"至少一个（at least one) "可互换地使用并且意指一个或多于一个。
[0010]另外在本文中，借助端点对数值范围进行的描述包括隶属该范围的全部数字（例 如，1 至 5 包括 1、1· 5、2、2· 75、3、3· 80、4、5 等）。
[0011] 对于本文中披露的、包括分离步骤的任何方法，这些步骤可以按任何可行顺序实 施。并且，如果适宜，两个或更多个步骤的任何组合可以同时实施。
[0012] 本发明的以上概述不意在描述本发明的每个所披露的实施例或每一个实施方式。 以下本说明书更加具体地示例了示意性实施例。贯穿本申请，在几个地方中，通过一系列实 例提供指导，这些实例能以多种组合形式使用。在每种情况下，所述系列仅作为代表性群组 发挥作用并且不应当解释为排他性系列。
[0013] 缩略语：
[0014] AA 邻氨基苯甲酸
[0015] 5-HAA 5-羟基邻氨基苯甲酸
[0016] 5-HI 5-羟基吲哚
[0017] TP或Trp色氨酸
[0018] 5-HTP 5-轻色氨酸
[0019] SA 水杨酸
[0020] GA 龙胆酸
[0021] 附图简述
[0022] 图IA示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的实例。TrpEftoG :邻氨基苯甲酸合 酶（抗反馈突变体）；SalABCD :水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和TrpB :大肠杆菌原生色氨酸生 物合成酶。虚线示出了经由色氨酸生物合成酶的作用朝向色氨酸可能的碳分流。大肠杆菌 BWl是整合完整生物合成途径的示例性菌株。
[0023] 图IB示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另一实例，其分为上游和下游部 份。TrpE ftoG :邻氨基苯甲酸合酶（抗反馈突变体）；SalABCD :水杨酸5-羟化酶；TrpDCA和 TrpB :大肠杆菌原生色氨酸生物合成酶。在一个双细胞系统中，大肠杆菌BW3是整合生物合 成途径上游部份的示例性菌株，其出产5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA);大肠杆菌BW2是整 合生物合成途径下游部份的示例性菌株。
[0024] 图IA和IB中所示的步骤1，2和3代表用于如实例1所描述的逆向工程化5-HTP 的微生物合成的步骤，其中步骤1代表最下游的步骤而步骤3代表最上游的步骤。
[0025] 图IC示出了一种新型的5-HTP生物合成途径的另外的实例，其分为上游和下游部 份，其中该途径使用显示宽松底物选择性的水杨酸5-羟化酶和色氨酸生物合成活性。
[0026] 图2A示出了在TrpDCBA (上图）催化下邻氨基苯甲酸（AA)转化为色氨酸（TP)以 及同样在TrpDCBA(下图）催化下类似的5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)转化为5-羟色氨 酸（5-HTP)。
[0027] 图2B示出了 TrpDCBA对于天然底物AA (黑色）以及非天然底物5-HAA (灰色）的 体内测定。含有质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2被用于体内测定。每一反应的产物显示在各 柱状图的顶部。Trp:色氨酸。
[0028] 图3A示出了使用含有低拷贝数质粒pSA-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化 为5-HTP。在Oh和IOh将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进 行分析。
[0029] 图3B示出了使用含有中拷贝数质粒pCS-trpDCBA的菌株BW2将5-HAA生物转化 为5-HTP。在Oh和IOh将5-HAA(600mg/L)加入培养物。每四小时提取样本并通过HPLC进 行分析。
[0030] 图4A示出了在SalAB⑶（上图）催化下水杨酸向龙胆酸（GA)的原生细菌转化；在 SalAB⑶催化下AA转化为5-HAA，因为水杨酸（2-羟基苯甲酸）和AA(2-氨基苯甲酸）具 有相似的分子结构（中图）；以及在邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶（PqsA)和水杨酰-辅酶 A 5-羟化酶（SdgC)连续作用（下图）催化下AA转化为5-HAA。
[0031] 图4B示出了邻氨基苯甲酸5-羟化酶的体内测定。菌株BW3被用作宿主。所使用 的质粒显示在各柱状图的下面。每一反应的产物显示在各柱状图的顶部。
[0032] 图5示出了 AA生物转化为5-HAA。含有质粒pZE-salAB⑶的菌株BW3被用于生物 转化。在Oh和5h将5-HAA(300mg/L)加入培养物。每三小时提取样本并通过HPLC进行分 析。
[0033] 图6示出了来自葡萄糖的5-HAA生产的模块优化。菌株BW3被用作宿主。所使用 的质粒显示在各柱状图的下面。
[0034] 图7A示出了使用含有质粒pZE-salABCD以及PSAlrpEftoG的菌株BW3从葡萄糖 生产5-HAA，用于5-HTP生产的两步法的第一部分（上游部份）。
[0035] 图7B示出了使用含有质粒pCA-trpDCBA以及pSA-trpDCBA的菌株BW2从5-HAA 生产5-HTP，用于5-HTP生产的两步法的第二部分（下游部份）。
[0036] 展示性实施方式的详细说明
[0037] 本发明提供了新型的生物合成途径，使得从葡萄糖经由5-羟基邻氨基苯甲酸 (5-HAA)前体生产5-羟色氨酸（5-HTP)。直至现在，唯一报道的5-HTP生物合成途径是经 由色氨酸，并且该反应是被色氨酸5-羟化酶（T5H)所催化的。然而，当在微生物中表达并 且需要应该通过附加酶反应再生的特殊的辅助因子5, 6, 7, 8-四氢生物蝶呤（BH4)时，T5H 是不稳定的（哈马丹和里贝罗，1999,《生物与化学杂志》，274 :21746-21754 ;林等人，2014， ACS合成生物学，3(7) :497-505)。这些问题妨碍该途径向5-HTP的经济生产应用。为了避 免与5-HTP生产相关的问题，我们通过识别和使用挑选的显示底物耐受的途径酶逆向工程 化用于5-HTP生产的新型生物合成途径，由此实施前体定向生物合成的概念（图1)。通过 利用这些酶的宽松底物选择性，我们避免了对于不稳定的色氨酸5-羟化酶依赖的需要。
[0038] 逆向工程化该新型生物合成途径的第一步，对应于代谢途径的下游部分，是找到 5-HTP的一种简单前体。5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)被鉴定为一种合适的前体。在大肠 杆菌色氨酸生物合成途径中，经由酶促反应在TrpDCBA (图2A，上图）催化下前体邻氨基苯 甲酸（AA)转化为色氨酸（TP)。通过使用体内测定，我们惊奇地发现5-羟基邻氨基苯甲酸 (5-HAA)同样可以经由酶促反应在TrpDCBA(图2B，下图）催化下被转化为5-HTP。因此， 5-HAA被鉴定为一种简单的5-HTP前体。
[0039] 在该新型生物合成途径的上游部份，新型的水杨酸5-羟化酶（S5H)被用于将非天 然底物邻氨基苯甲酸（AA)转化为前体5-HAA。来自葡萄糖的5-HAA生产可任选进一步通过 使用参与上游中间体分支酸和邻氨基苯甲酸以及5-HAA(图1)生产的分子的模块优化而提 高，如下所详述。
[0040] 在该新型生物合成途径的下游部份，在大肠杆菌TrpDCBA的催化下5-HTP产生自 5_羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)前体。
[0041] 在本发明细胞中表达的酶类可以相对于该宿主细胞是异源的，或者它们可以是在 宿主细胞生物体中天然发现的。例如，当大肠杆菌是宿主生物时，该生物合成途径中所使用 的一种或多种酶可以是原生大肠杆菌酶，而表达的酶的一种或多种可以来自其它（非大肠 杆菌）生物体（例如，异源性的）。当一种对于宿主生物体是原生的酶从质粒或其它载体中 表达时，该酶相对于在没有质粒的宿主生物体中在该宿主生物体中过量表达。天然存在的 酶的过量表达，以及来自其它宿主的酶的表达，经由多种质粒或载体，允许组成基因工程化 的总生物合成途径的各种酶的优化和微调。
[0042] 尽管整个途径可以被整合到单个细胞中，本发明优选地使用两阶段法，在此也被 称作两步法，其中该生物合成途径的上游和下游部份被整合进两种不同的细胞，以最佳地 达到5-HTP的从头生产。更普遍的是，该创新的策略和概念是用于生物合成其它化学制剂 的适用设计和非天然途径的建立。
[0043] 因此，本发明包括基因工程化以生产5-HTP或在生物合成途径中在5-HTP之前的 中间体的微生物细胞，以及用于制造所述细胞的方法和从所述细胞或细胞培养物中生产和 分离5-HTP的方法。本发明涉及将微生物细胞基因工程化以表达全部或一部份用于从简单 碳源微生物生物合成5-HTP的新型生物合成途径。本发明提供了一种有成本效益的用于从 廉价碳源有效生产5-HTP的微生物方法。预期该技术可以促进生物催化平台的构建以将廉 价的原料转化为高纯度的产物5-HTP，这与常规的提取方法相比将显著降低其生产成本，极 大地改善其对于未经良好治疗病人的可用性，以及进一步扩大其市场。
[0044] 下面更详细地描述可以被工程化以表达该5-HTP生物合成途径的微生物细胞的 实例，以及用于制造所述细胞的方法和生产与分离5-HTP的方法。
[0045] 上游生物合成途径
[0046] 邻氨基苯甲酸（AA)的5-羟化以出产5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)。如上面指 出的，5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)被鉴定为用于5-HTP生物合成的目标前体。逆向工程