通过发酵4-、5-、6-以及7-取代的吲哚和色氨酸类似物的微生 物生产（Microbial production of 4_，5_，6_and 7_substituted indole and tryptophan analogs via fermentation)，TO 1995/034657,公开于 1995 年 12 月 21 日 D
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[0147] 已经仅出于清晰理解的目的给出前述发明详述和实例。不应从中理解为不必要的 限制。本发明不局限于所显示和描述的这些精确细节，对于本领域普通技术人员而言，变体 将明显地包含在由权利要求所限定的本发明之内。
[0148] 除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所使用的表示组分的量、分子量等 等的所有数字应理解为在所有情况下均由术语"约"修饰。因此，除非另外指明是相反的， 在说明书以及权利要求书中所列举的这些数值参数是近似值，可以取决于寻求由本发明所 获得的所希望的特性而改变。最低限度并且不试图限制等效物原则应用到本权利要求书的 范围，每一个数值参数至少应该按照报告的有效数字的数量以及通过应用普通的舍入方法 来解释。
[0149] 虽然描述本发明的宽泛范围的数字范围和参数是近似值，但是在特定实例中列出 的数值被尽可能地精确地报道。然而，全部数值内在地含有因其相应的检验度量中存在的 标准偏差而必然产生的范围。
[0150] 在本申请的披露内容和通过引用方式结合在此的任何文献的披露内容之间存在 任何不一致性的情况下，本申请的披露内容应当占据主导。
[0151] 全部标题旨在方便读者并且不应当用来限制该标题后续文本的意思，除非如此说 明。
[0152] 在此引用的所有专利、专利申请（包括临时专利申请）、以及出版物（包括专利 出版物和非专利出版物）和电子可得材料（包括，例如，提交到例如，GenBank和RefSeq 中的核苷酸序列，以及提交到例如，SwissProt，PIR，PRF，PDB中的氨基酸序列，以及来自 GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译）的完整披露通过引用结合。
【主权项】
1. 一种用于生产5-羟色氨酸（5-HTP)的微生物系统，该系统包括多个基因工程化细 胞，这些细胞包括： 一种第一基因工程化细胞，包括（i)至少一种莽草酸途径酶，（ii)至少一种具有邻氨 基苯甲酸合酶活性的酶，以及（iii)至少一种具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶，该酶 进一步具有对非天然邻氨基苯甲酸（AA)底物的活性；以及 一种第二基因工程化细胞，包括至少一种具有色氨酸生物合成活性的酶，其中该酶 催化邻氨基苯甲酸（AA)转化为色氨酸并且进一步具有对非天然5-羟基邻氨基苯甲酸 (5-HAA)底物的活性。2. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶催化 AA的5-羟化以产生5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)。3. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有色氨酸生物合成活性的酶催化5-HAA 转化为5-HTP。4. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种莽草酸途径包含莽草酸激酶、磷 酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及3-脱氧-D-阿糖庚酮醛酸7-磷酸（DAHP)合酶。5. 如权利要求4所述的微生物系统，其中该第一细胞包括多种大肠杆菌莽草酸途径 酶。6. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括大肠 杆菌TrpEG。7. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括由存 在于低拷贝数质粒中的trpEftoG编码的反馈抑制突变体酶。8. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶包括 富养罗尔斯通氏菌H16水杨酸5-羟化酶。9. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括至少一种载体， 该至少一种载体可操作地编码莽草酸途酶、具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶、以及具有水 杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶中的至少一种。10. 如权利要求9所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括多种载体，其中 该多种载体各自可操作地编码莽草酸途酶、具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶、以及具有水 杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶中的至少一种。11. 如权利要求10所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码 至少一种莽草酸途酶的第一载体，可操作地编码具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的第二载 体，以及可操作地编码具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶的第三载体。12. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码 具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶的高拷贝数质粒。13. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码 具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的低拷贝数质粒。14. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一基因工程化细胞包括可操作地编码 莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及DAHP合酶的质粒。15. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该具有色氨酸生物合成活性的酶包括大肠 杆菌TrpDCBA。16. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一和第二细胞是细菌细胞。17. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一和第二细胞是大肠杆菌细胞。18. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种酶对于该第一或第二细胞是异 源性的。19. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该至少一种酶天然存在于该第一或第二细 胞中。20. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一细胞被基因工程化以减少或消除分 支酸生物合成、邻氨基苯甲酸生物合成或者两者的反馈抑制。21. 如权利要求1所述的微生物系统，其中该第一细胞被基因工程化以将碳流重新引 向分支酸生物合成、邻氨基苯甲酸生物合成或者两者。22. -种基因工程化细胞，包括 至少一种莽草酸途径酶； 可操作地编码至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶的载体；以及 可操作地编码至少一种具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶的载体，该酶进一步具有 对非天然邻氨基苯甲酸（AA)底物的活性。23. -种用于制造5-羟色氨酸（5-HTP)的方法，该方法包括： 在一定的条件下培养一种第一基因工程化细胞并持续足以生产5-HAA的时间，该第一 基因工程化细胞包括（i)至少一种莽草酸途径，（ii)至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性 的酶，以及（iii)至少一种具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶，该酶进一步具有对非天 然邻氨基苯甲酸（AA)底物的活性；并且 在5-HAA存在下在一定的条件下培养一种第二基因工程化细胞并持续足以生产5-HTP的时间，该第二基因工程化细胞包括至少一种具有色氨酸生物合成活性的酶，其中该酶 催化邻氨基苯甲酸（AA)转化为色氨酸并且进一步具有对非天然5-羟基邻氨基苯甲酸 (5-HAA)底物的活性。24. 如权利要求23所述的方法，进一步包括在用该5-HAA培养该第二细胞之前，将该第 一细胞与该5-HAA分开。25. 如权利要求23所述的方法，其中培养该第一细胞生产包含该5-HAA的上清液。26. 如权利要求23所述的方法，其中该第一和第二细胞以共培养方式同时培养。27. 如权利要求23所述的方法，其中该第一细胞是在葡萄糖的存在下培养的。28. 如权利要求23所述的方法，进一步包括分离该5-HTP。
【专利摘要】本发明提供了有用于在微生物细胞中生产5-羟色氨酸(5-HTP)的化合物、组合物、非天然存在的生物、以及方法。一种包含至少一种微生物细胞的微生物系统被基因工程化以表达非天然存在的生物合成途径的全部或一部份，该至少一种微生物细胞是例如细菌细胞或者酵母细胞，该生物合成途径催化简单碳源例如葡萄糖转化为5-HTP。本发明可导致5-HTP的效价改善并且允许低成本、大规模生产。制造和使用这些基因工程化细胞的方法也被包含在本发明中。
【IPC分类】C12R1/19, C12P13/04, C12N1/21
【公开号】CN105385646
【申请号】CN201510549142
【发明人】闫亚军, 孙新晓
【申请人】乔治亚大学研究基金公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年8月31日
【公告号】US20160060638