化该新型生物合成途径的下一步（第一步的上游）是找到从初级代谢产物合成5-HAA的途 径。邻氨基苯甲酸（AA)被鉴定为是一种初级代谢产物。AA是5-HAA的一种潜在前体，因为 AA的5-羟化将引起5-HAA的形成。然而，还没有AA 5-羟化酶被报道。
[0047] 令人惊讶地，已发现水杨酸5-羟化酶（S5H)，其原生地催化水杨酸（SA)的羟化 以出产龙胆酸（GA)，显示出宽松底物选择性并且也能够催化非天然底物AA的羟化以出产 5-HAA。术语"宽松底物选择性"意指该酶可以催化非原生底物的反应，在这种情况下是 5_羟化。据我们所知，这是对于能够使用AA作为底物的水杨酸5-羟化酶（S5H)的第一次 报告。一种新型的具有宽松底物选择性和将AA转化为5-HAA能力的S5H的发现是有意义 的，因为该S5H可以在本发明的代谢改造微生物中表达以提高5-HAA合成。
[0048] 用于本发明的该新型生物合成途径的一种优选的S5H是来自富养罗尔斯通氏菌 H16的S5H，其表示为SalAB⑶；然而，本发明不限于特定的S5H。在一些实施例中，该S5H包 括SalA，SalB，SalC以及SalD中的至少一个。优选地，该S5H包括SalA，SalB，SalC以及 SalD。在富养罗尔斯通氏菌H16中，SalA，SalB，SalC以及SalD分别由salA，salB，salC以 及salD编码，其存在于基因簇中。因此，在该S5H包括SalA，SalB，SalC以及SalD的实施 例中，它们可以通过单一的基因 （salAB⑶）或多个基因 （salAB以及sal⑶）表达，并且可以 被称为SalABCD。
[0049] -种具有S5H活性的酶可以从任何适当的生物体中获得。适当的S5H酶的其他实 例包括来自罗尔斯通菌属菌株U2和铜绿假单胞菌菌株JB2的S5H (周等人，2002,《细菌学 杂志》，184 :1547-1555 ;希基等人，2001，《应用环境微生物学》，67 :4603-4609)。优选地，该 S5H酶是富养罗尔斯通氏菌H16S5H酶。优选地，该富养罗尔斯通氏菌H16S5H酶由salAB⑶ 编码，并且存在于高拷贝数质粒中。
[0050] 在一些实施例中，S5H活性可以包括两种或更多种酶组合使用。例如，邻氨基苯甲 酰-辅酶A合成酶（由pqsA编码）以及水杨酰-辅酶A 5_轻化酶（由sdgC编码）可以 在相继的催化中使用以将AA转化为5-HAA。当该S5H活性包括邻氨基苯甲酰-辅酶A合成 酶以及水杨酰-辅酶A 5-羟化酶的序列反应时，该pqsA可以是铜绿假单胞菌的基因并且 该SdgC可以是链霉菌属的基因。
[0051] 因此，本发明的该新型生物合成途径包括一种或多种具有宽松水杨酸5-羟化酶 活性（S5H)的酶，其能够催化AA的5-羟化。术语"水杨酸5-羟化酶"意指任何具有S5H活 性的单个分子或多个分子；即，其能够催化SA转化为GA ;并且适当的S5H是具有宽松选择 性的从而其也能够5-羟化AA以出产5-HAA。术语S5H包括任何天然存在的S5H以及其任 何片段或修饰，包括由天然存在的S5H的插入、缺失或突变编码的酶，只要S5H活性被保留。 该S5H可以对该细胞是内源或对该细胞是异源性的。编码该S5H的基因可以基因水平上整 合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质粒。
[0052] 邻氨基苯甲酸（AA)的酶催化合成。用于5-HAA生产的上游途径也包括参与多步 转化葡萄糖为分支酸的酶，例如一种或多种莽草酸途径中的酶，以及一种或多种催化随后 转化分支酸为AA的酶，即其具有邻氨基苯甲酸合酶活性（见图1)。因此，本发明的该新型 生物合成途径进一步包括一种或多种参与分支酸合成的酶，例如莽草酸途径酶，以及一种 或多种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶。
[0053] 该莽草酸途径涉及多种酶并构成了被细菌、真菌、藻类、寄生生物以及植物所利用 用于生物合成芳族氨基酸的代谢途径。分支酸是该途径中的中间代谢物。应当理解的是， 尽管本发明总体的工程化代谢途径的最上游部分一般被称为莽草酸途径（见图1)，因为莽 草酸是分支酸的上游代谢物，术语莽草酸途径酶应该理解为宽泛地涵盖参与分支酸生物合 成的酶。
[0054] 该莽草酸途径可以包含莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶以及3-脱 氧-D-阿糖庚酮醛酸7-磷酸（DAHP)合酶。参与在大肠杆菌中生产初级代谢产物邻氨基苯 甲酸（AA)的酶描述于孙等人（2013,《应用环境微生物学》，79 :4024-4030)。
[0055] 编码参与分支酸生物合成的酶（例如，莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙 醛酶和/或DAHP合酶）的基因可以是宿主细胞内源的，或者它们可以从任何适当的生物体 中获得。这些酶可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个或多个引入宿主细胞的载 体（例如，质粒）上的一个或多个内源基因的额外拷贝来增强它们表达。在其他实施例中， 一种或多种编码莽草酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、转羟乙醛酶和/或DAHP合酶的基因可 以从不同生物体中获得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染 色体外元件，例如质粒。应当理解的是，在具有用于分支酸合成的内源性途径以使得该细胞 能够产生代谢物分支酸的宿主生物中，可操作地编码一种或多种莽草酸途径酶（例如，如 下以及实例I所述的"ΑΡΤΑ"模块）的染色体外元件（例如，质粒）包括进来，无论对该细 胞是内源或对该细胞是异源性的，都是任选的。
[0056] 在一些实施例中，莽草酸激酶由aroL编码，磷酸烯醇丙酮酸合酶由ppsA编码，转 羟乙醛酶由tktA编码，而DAHP合酶由aroG编码。一种或多种莽草酸途径中的酶可以是反 馈抑制突变体。"反馈抑制突变体"不对意在限制酶活性的细胞控制机理应答，并甚至将在 产物已经积累到生理学有用的水平之后继续催化反应。例如，ar 〇Gfto编码反馈抑制突变体 DAHP合酶。该莽草酸途径可以从任何适当的生物体中获得。例如，莽草酸途径可以是大肠 杆菌莽草酸途径。在一个优选实施例中，新型生物合成途径包括大肠杆菌莽草酸途径，其包 括APTA模块，包括莽草酸激酶（逆oL)，磷酸烯醇丙酮酸合酶（epsA)，转羟乙醛酶（iktA)，以 及DAHP合酶broG)，其是反馈抑制突变体（由ar 〇Gfto编码）。该模块与增强的分支酸可 用性相关。该APTA模块表达一种或多种增加向分支酸碳流的酶。例如，第一模块的示例性 组分描述于林等，2013,《自然通讯》，4 :2603。
[0057] 在一个实施例中，具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶包括来自色氨酸生物合成途径 的TrpE或TrpG中的至少一个。在一个优选实施例中，邻氨基苯甲酸合酶活性可以通过TrpE 和TrpG的组合供给。在大肠杆菌中，TrpE和TrpG分别由trpE和trpG编码，其存在于基 因簇中。因此，在邻氨基苯甲酸合酶活性是由在宿主细胞中表达TrpE和TrpG两者所提供 的实施例中，它们可以通过单个的基因（trpEG)表达，并且可以被称为TrpEG。邻氨基苯甲 酸合酶也可以包括反馈抑制突变体。例如，trpE ftoG编码反馈抑制突变体邻氨基苯甲酸合 酶。优选地，当宿主细胞仅表达该生物合成途径的上游部份时，该宿主细胞被修饰成删除原 生存在的trpD。
[0058] 具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶可以是宿主细胞内源的，或者它可以从任何适 当的生物体中获得。大肠杆菌邻氨基苯甲酸合酶是具有邻氨基苯甲酸合酶活性的示例性 酶。在一个实施例中，新型生物合成途径包括大肠杆菌TrpEG，其是反馈抑制突变体（由 trpEftoG编码）。优选地，该大肠杆菌邻氨基苯甲酸合酶trpEftoG存在于低拷贝数质粒中。
[0059] 具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个 引入宿主细胞的载体（例如，质粒）上的该一种或多种内源基因的额外拷贝来增强它的表 达。在其他实施例中，一种或多种编码邻氨基苯甲酸合酶活性的基因可以从不同生物体中 获得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质 粒。
[0060] 具有邻氨基苯甲酸合酶活性的酶不限于任何特定的邻氨基苯甲酸合酶。术语"邻 氨基苯甲酸合酶"意指任何具有邻氨基苯甲酸合酶活性的单个分子或多个分子；g卩，其能够 催化分支酸的转化以出产AA。术语邻氨基苯甲酸合酶包括任何天然存在的邻氨基苯甲酸合 酶以及其任何片段或任何修饰，包括由天然存在的邻氨基苯甲酸合酶的插入、缺失或突变 编码的酶，只要邻氨基苯甲酸合酶活性被保留。该邻氨基苯甲酸合酶可以对该细胞是内源 或对该细胞是异源性的。
[0061] 途径优化。本发明的上游途径（出产5-HAA)可以任选地通过分为三个模块而优 化，然后针对对三个模块的每一个中的酶进行编码的质粒而评估不同拷贝数（即表达水 平）的作用。大肠杆菌宿主细胞的示例性优化描述于实例I，而该实例可以很容易地推广 到其它宿主细胞。模块按逐步朝向最上游部分移动而编号。模块1由SalAB⑶组成，表达 S5H，其催化由AA形成5-HAA ;模块2是trpEftoG模块，表达具有邻氨基苯甲酸合酶活性的 酶，其催化转化分支酸为AA ;而模块3是APTAG模块，其在莽草酸途径中表达四种酶（AroL， PpsA，TktA，AroGfto)以增加向分支酸合成的碳流量（孙等人，2013,《应用环境微生物学》， 79 :4024-4030)。根据优化结果，上游途径的一个优选实施例是宿主细胞包含高拷贝数的表 达S5H的质粒用于模块1，例如实施例1所描述的pZE-salAB⑶；而低拷贝数的表达邻氨基 苯甲酸合酶的质粒用于模块2,例如实施例1所描述的pSA-trpEfbrG。在模块3中莽草酸 途径酶的额外拷贝的表达是任选的，前提是宿主细胞原生地表达莽草酸途径酶从而出产分 支酸代谢物，其为AA的代谢前体。应当理解的是，在一些实施例中更普遍的是，如果酶内源 地存在于宿主细胞内，在模块1，2或3中没有酶是由质粒表达的；也就是说，经由任何内源 酶的质粒或其它载体的过量表达是任选的。应当进一步理解，本发明不限于示例于模块1， 2或3中特定的酶；相反地，具有所描述活性的任何酶或一组酶，无论是内源性的或是异源 性的，可以被用于本发明的代谢途径。
[0062] 下游生物合成途径
[0063] 由5-HAA合成5-HTP。在大肠杆菌色氨酸生物合成途径中，通过由TrpDCBA (图2A， 上图）催化的酶促反应将邻氨基苯甲酸（AA)转化为色氨酸（TP)。令人惊讶地，我们发现 TrpDCBA显示出宽松底物选择性，并且非原生底物5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)也可以通 过由TrpDCBA(图2B，下图）催化的酶促反应转化为5-HTP。
[0064] 因此，本发明的该新型生物合成途径包括一种或多种具有色氨酸生物合成活性的 酶，并且显示出宽松底物选择性以使得它们能够运用5-HAA作为底物。在这方面，术语"色 氨酸生物合成活性"意指催化AA转化为色氨酸（TP)的能力，而不限于任何具体的色氨酸生 物合成酶。可使用任何具有色氨酸生物合成活性以及显示出催化5-HAA转化以出产5-HTP 能力的一种或多种酶。具有色氨酸生物合成活性的酶包括任何天然存在的色氨酸生物合成 酶以及其任何片段或任何修饰，包括由天然存在的色氨酸生物合成酶的插入、缺失或突变 编码的酶，只要色氨酸生物合成活性被保留。色氨酸生物合成活性可以对该细胞是内源或 对该细胞是异源性的。
[0065] 在一些实施例中，色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD中的至少一 个提供。优选地，色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD提供。在大肠杆菌中， TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD分别由trpA，trpB，trpC和trpD编码，其存在于基因簇中。在 色氨酸生物合成活性由TrpA，TrpB，TrpC以及TrpD所提供的实施例中，它们可以通过单个 的基因（trpDCBA)或多个基因（例如，trpA和trpDCB)表达，并且可以被称为TrpDCBA。例 如，色氨酸生物合成活性可以是大肠杆菌的色氨酸生物合成活性。在一个实施例中，新型生 物合成途径包括大肠杆菌色氨酸生物合成途径（由trpDCBA编码）。大肠杆菌trpDCBA可 以存在载体上，例如质粒。在一些实施例中，该质粒是一种低拷贝数质粒。
[0066] 色氨酸生物合成活性可以以原生的量存在，或者可以通过表达在一个引入宿主细 胞的载体（例如，质粒）上的编码该活性的一种或多种内源基因的额外拷贝来增强它的表 达。在其他实施例中，一种或多种编码色氨酸生物合成活性的基因可以从不同生物体中获 得，并且或者基因水平上整合到宿主细胞，或者表达自一个或多个染色体外元件，例如质 粒。
[0067] 总之，该新型生物合成途径催化简单碳源（例如，葡萄糖）转化为5-HTP。该新型 生物合成途径包括1)上游部份，其催化简单碳源转化为5-HAA，其中上游部份包括一种或 多种莽草酸途径酶（例如，参与分支酸生产的酶），至少一种具有邻氨基苯甲酸合酶活性的 酶，以及至少一种具有水杨酸5-羟化酶（S5H)活性的酶；2)下游部份，其经由色氨酸生物 合成