>[0090] 简单碳源可以是任何容易获得的碳源。合适的碳源可以包括（但不限于）5-碳糖 或6-碳糖。5-碳糖的非限制性实例包含（但不限于）木糖和阿拉伯糖。6-碳糖的非限制 性实例包含（但不限于）葡萄糖、甘油、甘露糖、半乳糖、以及山梨糖。在一个实施例中，该 简单碳源是葡萄糖。
[0091] 任选地，5-HTP从包括该代谢途径的下游部份或完整途径的细胞中分离。5-HTP可 以从细胞上清液中分离（如果该化合物被排出），或从细胞本身中分离。任选地纯化该分离 的5-HTP。纯化的5-HTP可以被用作起始材料用于其它化学或酶促反应以生产其它感兴趣 的生化制品。同样地，中间代谢物5-HAA可以从仅包含途径的上游部份的细胞中或从细胞 上清液中（如果5-HAA被排出）分离并且任选地纯化。根据本发明，该中间代谢物可以被 用作用于5-HTP生产的原料、或用于代谢工程中其他应用、或作为其它产物的酶促化学合 成的前体。
[0092] 任选地，分离的5-HTP作为食品添加剂、食品补充剂或营养食品被合并到食物产 品中。例如，分离的5-HTP可以被合并到动物饲料中，例如家畜或农畜的饲料。补充5-HTP 对于钙代谢可以具有有益作用，并且尤其适合用于怀孕与泌乳农畜，例如奶牛。因此，该制 造5-HTP的方法任选地包括包装和/或推广5-HTP作为动物食品补充剂、添加剂或营养食 品，以及将5-HTP合并到食物产品（例如，动物饲料或饮料）中。
[0093] 本发明的基因工程化细胞可以被用作益生菌。如在此所描述，作为益生菌的细胞， 其可以包含上游代谢途径、下游代谢途径、或者两者，可以以补充剂的形式进行给药或它们 可以被整合到食物产品中。任选地，该食物产品是发酵或培养的食物产品。示例性的食物 产品包括乳制品，例如奶、乳酪、或酸奶。乳酸杆菌属和芽胞杆菌属是用作益生菌的示例性 细菌细胞。
[0094] 实例
[0095] 本发明通过下列实例阐明。应该理解具体实施例、原料、量和方法应根据如本文所 阐述的本发明的范围和精神来宽泛地解释。
[0096]实例 I
[0097] 使用代谢改造大肠杆菌的5-羟色氨酸的前体定向生物合成
[0098] 新型生物合成途径经过设计和反向验证，使得从葡萄糖生产5-羟色氨酸 (5-HTP)。该途径利用了相关酶的宽松底物选择性，无需使用不稳定的色氨酸5-羟化酶。高 效价的5-HTP是通过大肠杆菌TrpDCBA的催化从5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)前体生产 的。新型的水杨酸5-羟化酶被用于将非天然底物邻氨基苯甲酸（AA)转化为5-HAA，而来自 葡萄糖的5-HAA生产通过使用模块优化而提高。最后，我们通过采用两步法组合了整个途 径以实现5-HTP的从头生产。本研究中使用的策略和概念将有益于用于其它化学制品的生 物合成的非天然途径的设计和建立。
[0099] 结果
[0100] 5-羟色氨酸（5-HTP)是一种天然的非蛋白原氨基酸，并且充当神经递质血清素的 直接生物合成前体。5-HTP已被证明对于治疗各种病况是有效的，包括抑郁症、失眠症、慢性 头痛以及与肥胖症有关的暴食。5-HTP的治疗效果应归于其提高血清素在大脑中合成的能 力。5-HTP通过口服剂量很好地被吸收并且可以很容易地穿越血脑屏障t
[0101] 目前，从非洲植物加纳籽中提取是商业生产5HTP的方法。然而，材料供应依赖于 季节性和地区性，这限制的5-HTP产量。尽管5-HTP的化学合成已被报道然而大规模在 经济方面是不可行的。生物合成提供了有希望的替代方法用于生产5-HTP。微生物具有更 加简单的遗传背景和代谢网络。它们生长更快并且生物量在简单的合成培养基中可以达到 高水平。已通过使用基因工程微生物成功地产生了很多重要的化学制品
[0102] 到目前为止，唯一报道的5-HTP生物合成途径是经由色氨酸，并且该反应是被色 氨酸5-羟化酶（T5H)所催化的。然而，当在微生物中表达时T5H是不稳定的并且需要特殊 的辅助因子5, 6, 7,8_四氢生物蝶呤（BH4)，该因子应该通过另外的酶反应再生 ' 这些问 题妨碍了该途径向5-HTP的经济生产应用。为了避免这些问题，我们建立了用于5-HTP生 物合成的新型人工途径。该途径利用了途径酶的底物耐受性并且实施了前体定向生物合成 的概念（图1)。
[0103] 该途径设计的第一步（图1，步骤1，最下游）是为了找到5-HTP的一种简单前 体。在大肠杆菌色氨酸生物合成途径中，邻氨基苯甲酸（AA)是色氨酸的前体，并通过由 TrpDCBA催化的五个酶促反应转化为色氨酸。5-HTP是色氨酸的类似物，而其对应的前体应 当是5-羟基邻氨基苯甲酸（5-HAA)。据报导，被取代的AA也可以通过该途径转化为对应 的被取代的色氨酸M。为了研究反应细节，构建了中拷贝数质粒pCS-trpDCBA。tnaA和rpE 被敲除的、含有pCS-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW2被用于体内测定。敲除tnaA可以防止产 物色氨酸以及5-HTP降解，而敲除trpE可以阻断AA的原生合成。
[0104] 结果显示AA和5-HAA都能够经受这些途径酶，分别生产色氨酸以及5-HTP。生物 转化系统针对5-撤厶的体内比活（57.44±0.94以]?/00/11)是针对厶厶（151.37±2.93 4]\1/(?/ h)的体内比活的约40%，这指示5-羟基基团在某种程度上影响酶活性（图2)。我们还将 trpDCBA克隆进了低拷贝数质粒，以出产pSA-trpDCBA。有趣的是，当含有pSA-trpDCBA的菌 株BW2被用于体内测定时，中间体5-羟基吲哚（5-HI)在培养物中积累，这指示由TrpB催 化的反应是限速步骤（图3A)。为了测试这部分途径的能力，我们连续向含有pCS-trpDCBA 的 BW2 培养物供给 5-HAA。在 12h 中，生产了 1102. 43±24· 95mg/L 的 5-HTP (图 3B)。
[0105] 5-HTP生物合成的第二步（图1中步骤2)是为了从初级代谢产物合成5-HAA。AA 是5-HAA的一种潜在前体，因为AA的5-羟化将引起5-HAA的形成。然而，目前还没有AA 5-羟化酶的报告。值得注意的是，两种水杨酸5-羟化酶（S5Hs)已经从罗尔斯通菌属菌株 U2和铜绿假单胞菌菌株JB2中得以表征&气S5H将水杨酸羟化为龙胆酸（GA)，并且参与 芳香化合物的降解。由于水杨酸（2-羟基苯甲酸）和AA (2-氨基苯甲酸）具有十分相似的 分子结构，我们假设S5H也可以羟化AA。为了测试这一假设，我们搜索了蛋白数据库并且发 现编码推定的S5H的基因簇。该聚簇克隆自富养罗尔斯通氏菌H16并且表示为salAB⑶。 不同于前两种S5H，该聚簇位于染色体上而不是移动的质粒上。SalABC显示出与来自罗尔 斯通菌属菌株U2的那些有高的蛋白序列相似性（57% -75% )，而SalD显示出与来自罗尔 斯通菌属菌株U2的那些仅有13%的相似性。
[0106] 为了表征该基因簇并且测试SalD的必要性，我们构建了两种高拷贝数质粒 pZE-salABO)以及pZE-salABC。用这两种质粒分别转化tnaA和trpD敲除的大肠杆菌菌株 BW3。敲除trpD可以阻断原生的TrpDCBA消耗AA和5-HAA。
[0107] 该体内测定显示出SalABCD可以转化水杨酸为GA，其具有268. 72 ±7. 79 μ M/OD/h 的比活性。然后，我们进一步测试了对AA的酶活性。正如预期的那样，该酶系统也可以将 AA转化为5-HAA，尽管其具有略微低的比活性（216. 06 ±2. 02 μ M/OD/h)。然而，SalABC对 AA的比活性显著地降低至16. 75 ±2. 06 μ M/OD/h，这证实SalD是S5H的必要成分（图4)。 在此值得一提的是，SalABCD需要NAD (P) H而不是BH4作为辅助因子，而且前者在大肠杆菌 中是丰富的代谢产物。
[0108] 我们还测试了另一种酶组合来羟化AA，其由邻氨基苯甲酰-辅酶A合成酶（PqsA) 和水杨酰-辅酶A 5-羟化酶（SdgC)组成。PqsA参与2, 4-二羟基喹啉的生物合成，其是由铜 绿假单胞菌产生的细胞外的代谢物' SdgC参与链霉菌属菌株WA46进行的水杨酸降解' 该体内测定显示出AA可以通过这两种酶的相继催化而转化为5-HAA。然而，与SalAB⑶的比 活性相比较，该组合的比活性不是所希望的（15. 44±0. 92 μΜ/OD/h)(图4)。然后，我们连 续向含有质粒pZE-salABCD的菌株BW3培养物供给AA。在12h中，生产了 442. 51 ±6. 25mg/ L 的 5-HAA (图 5)。
[0109] 构建5-HTP生物合成的最后一步（图1中步骤3,最上游）是连接非原生下游部分 途径与大肠杆菌原生新陈代谢。由于我们以前的工作已报道了在大肠杆菌中生产AA'这 里我们通过组合AA的生产和转化部分途径来优化来自葡萄糖的5-HAA生产。5-HAA的生 物合成途径分为三个模块（图1)。模块1由salAB⑶组成，其催化由AA形成5-HAA ;模块 2是trpEftoG模块，其将分支酸转化为AA ;而模块3是APTAG模块，其在莽草酸途径中表达 四种酶（AroL，PpsA，TktA，AroGfto)以增加向分支酸合成的碳流量。
[0110] 模块优化结果显示，当模块1在高拷贝数质粒（pZE-salAB⑶）中而模块2在低拷 贝数质粒（pSA-trpEfbfG)中（图6)时获得最高的5-HAA效价（224. 31±8· 89mg/L)。模块 3的引入没有进一步改善该效价。此外，中间体AA在所有情况中积累，这指示即使由高拷贝 数质粒表达，模块1仍然是限速步骤。
[0111] 达到来自葡萄糖的5-HAA生产之后，我们试图组合整个途径以实现5-HTP的从头 生产。用质粒pSA-trpE fbfG、pZE-salABO)、以及pCS-trpDCBA转化tnaA敲除的大肠杆菌菌 株BW1。将阳性转化子用于摇瓶实验。令我们惊讶的是，在培养24h之后，培养物中没有 5-HTP积累，而产生205. 14±6. 71mg/L色氨酸。对于这种现象的一个解释是TrpDCBA显示 出对AA比对5HAA更高的底物亲和性和比活性并且无需羟化，AA直接被转化为色氨酸。另 一可能的解释是TrpE和TrpD已经演化形成异四聚体复合物以减少底物扩散 M。该酶复合 物的形成可以防止SalAB⑶到达它的底物AA。
[0112] 为了解决这一问题，然后我们开发了两步法用于生产5-HTP。首先，含有 pSA-trpEfbfG以及pZE-salABCD的大肠杆菌菌株BW3用于从葡萄糖生产5-HAA。24h后，离 心除去细胞，上清液与等体积的含有pSA-trpDCBA以及pCA-trpDCBA的大肠杆菌菌株BW2 的培养物混合。通过用氨苄青霉素抗性基因替换质粒pCS-trpDCBA的卡那霉素耐受性基 因来构建质粒pCA-trpDCBA。进一步将产生的5-HAA转化为5-HTP，而最终效价可以达到 98. 09±3. 24mg/L(图7)。此外，还产生了 23. 05±0. 83mg/L色氨酸作为副产物，并且未观 察中间体5-HI的积累。
[0113] 方法
[0114] 菌株、质粒以及培养基菌株以及质粒分别总结在表1和表2中。将大肠杆菌菌株 XLl-Blue用作用于标准克隆以及质粒繁殖的宿主。将大肠杆菌菌株BW1、BW2、BW3用于体 内测定以及5-HAA和5-HTP的生产。将卢里亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani，LB)培养基用 于接种体制备以及细胞繁殖。将改良的M9培养基用于5-HAA以及5-HTP的微生物合成。 LB培养基包含10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物以及10g/L NaCl。改良的M9基本培养基 包含 10g/L 葡萄糖、6g/L Na2HPO4,0.5g/L NaCl，3g/L KH2PO4, lg/L NH4Cl，lmM MgSO4,0· ImM CaCl2,2g/L酵母提取物，2g/L柠檬酸钠以及lOOmg/L丝氨酸。当需要时，将氨苄青霉素、卡 那霉素、氯霉素分别以100 μ g/mL、50 μ g/mL、34 μ g/mL添加到该培养基。
[0115] 表1.此研究中使用的菌株。
[0116]
[0117] CGSC* :大肠杆菌遗传库存中心（Coli Genetic Stock Center)
[0118] 质粒构建将质粒pZE12-luc、pCS27、pSA74用于基因克隆、蛋白质表达、以及途径 装配（林等，2013,《自然通讯》，4 :2603)。基因 salAB以及salCD从富养罗尔斯通氏菌基因 组DNA中扩增。基因 pqsA以及sdgC分别从铜绿假单胞菌和链霉菌属菌株WA46基因组DNA 中扩增。基因 trpDCBA从大肠杆菌基因组DNA中扩增。通过使用KpnI、BamHI、以及XbaI 将salAB以及salCD亚克隆进质粒pZE12-luc中来构建质粒pZE-salABCD。使用相同的方 法来构建质粒pZE-sal