抗胰腺癌单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学诊断领域，涉及抗胰腺癌单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是恶性程度高、发展快和预后差的肿瘤，约占全身各种恶性肿瘤的 1% -4%，占消化道恶性肿瘤的8% -10%。由于其发病隐匿，临床症状不典型，造成其早期 诊断困难，多数患者就诊时已属中晚期。胰腺组织解剖位置较深，周围毗邻腹腔重要脏器及 大血管，侵袭能力强，多数患者失去根治性手术的机会。该肿瘤对放疗和化疗不敏感，容易 出现远处转移，并且局部复发早，综合治疗效果差，导致五年生存率不足5%。
[0003] 糖链抗原19-9 (CA19-9)是唾液酸化的乳-N-岩藻戊糖II，属于唾液酸化的Lewis a血型抗原，由Koprowski等在1979年通过免疫小鼠获得。它在胰腺癌血清中的阳性率可 达70% -85%，目前仍然是临床最常用的血清肿瘤标志物。Ni等报道，CA19-9诊断胰腺癌 的敏感性能达80%，其特异性只有43%。尤其在一些良性疾病中（如胆道系统梗阻，胰腺 炎和肝硬化等）也可出现CA19-9的升高，其特异性不高给临床工作者带来不少困惑。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供抗胰腺癌单克隆抗体。
[0005] 本发明的另一目的是提供分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0006] 本发明的又一目的是提供该单克隆抗体及其特异性抗原的应用。
[0007] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0008] -株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，于2011年8月31日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :C201173。
[0009] 由所述的保藏号为CCTCC NO :C201173的杂交瘤细胞株NM002-1分泌的抗人胰腺 癌的单克隆抗体NJ002-1。
[0010] 所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。
[0011] 所述的单克隆抗体NJ002-1优选在制备胰腺癌早期诊断试剂或辅助诊断试剂中 的应用。
[0012] 所述的诊断试剂优选包括免疫组织化学检测试剂或血清免疫检测试剂。
[0013] 所述的血清免疫检测试剂进一步优选酶联免疫吸附检测试剂。
[0014] 所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌预后诊断试剂中的应用；。
[0015] 所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为检测靶标在制备胰腺癌诊断或预 后试剂中的应用。
[0016] 所述的单克隆抗体NJ002-1在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
[0017] 所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗胰腺癌的药物中 的应用。
[0018] 有益效果：
[0019] 本发明以人胰腺癌细胞系SW1990为免疫原，用杂交瘤技术，筛选到一株能够稳 定分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1 (CCTCC NO :C201173)。该杂交瘤 (CCTCC NO :C201173)所分泌的单抗NJ002-1产量多、效价高，对胰腺癌细胞系有特异性反 应，与正常胰腺细胞、健康人PBMC及其他一些常见的肿瘤细胞系（肺癌、肝癌、乳腺癌及结 肠癌）无反应或低反应性。
[0020] 免疫组织化学结果显示，NJ002-1特异性抗原在胰腺癌组织中的表达高于胰腺良 性疾病组织（76. 7% vs. 17. 6%，p〈0. 001)。进一步分析发现：在低分化患者该抗原的阳性 表达率高于高分化患者（82. 4% vs. 62. 2%，p = 0. 022);且在肿瘤浸润程度深，存在淋巴转 移的患者中该抗原的阳性表达率分别高于浸润程度低，无淋巴转移者（83. 0% vs. 60. 0%， p = 0. 010 ;91. 2% vs. 63. 9%，p〈0. 001);差异有统计学意义。生存分析显示，该抗原表达 阳性的患者的生存时间短于表达阴性的患者（P = 0. 021)。
[0021] 双抗体夹心ELISA法结果显示，胰腺癌患者血清中该抗原的表达较健康体检者高 (p〈0. 05)。血清中NJ002-1特异性抗原的ELISA检测对胰腺癌患者诊断的敏感性和特异性 分别为50. 6%和90. 0%。NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌的分化程度、浸润深度、淋巴 结转移及预后密切相关；同时，在胰腺癌患者血清中该抗原的阳性检出率及特异性均较高。
[0022] 此外，85例胰腺癌患者血清NJ002-1特异性抗原的检出率虽低于CA19-9,但两者 联合检测的阳性率86. 8% (79/85)明显高于CA19-9单项的阳性率75. 8% (69/85)，差异有 统计学意义（X2= 5. 221，P < 0.05)，且二者联合检测，可以克服CA19-9特异性较差的缺 陷，可见NJ002-1有望作为胰腺癌辅助诊断试剂，进一步提高胰腺癌检测的敏感性和特异 性。
[0023] 综上所述，NJ002-1的特异性抗原有望成为诊断胰腺癌和预测患者预后的新的肿 瘤标志物，其单克隆抗体NJ002-1在胰腺癌诊断制剂中应用。
[0024] 此外，单克隆抗体NJ002-1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990在软琼脂中的克隆 形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。单抗NJ002-1在裸鼠体内能显著抑 制人胰腺癌移植瘤的生长，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。表明单克隆抗体 NJ002-1有望成为治疗胰腺癌的药物。
【附图说明】
[0025] 图1胰腺癌及胰腺良性疾病的NJ002-1特异性抗原的免疫组化结果（X 200)
[0026] 其中A图为胰腺良性疾病_，B-D图为胰腺癌+，++，+++。
[0027] 图2胰腺癌患者的生存曲线
[0028] 图3胰腺腺癌患者血清中NJ002-1特异性抗原的ROC曲线
[0029] 注：曲线下面积为0. 831 (标准误为0. 041，，9%置信区间为0. 751-0. 912)。
[0030] 图4 SW1990在软琼脂上形成的克隆（X 100)
[0031] A.对照组 B. 200 μ g/ml Ab C. 400 μ g/ml Ab D. 800 μ g/ml Ab
[0032] 图5单抗NJ002-1抑制SW1990移植瘤的生长
[0033] A图肿瘤生长曲线，B图平均肿瘤重量，C图各组切除肿瘤。
[0034] 生物材料保藏信息
[0035] 杂交瘤细胞株NM002-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201173。
【具体实施方式】
[0036] 实施例1杂交瘤的制备
[0037] I. 1动物免疫取6~8周雌性BALB/c小鼠，每只用2X106SW1990细胞/次腹腔注 射免疫4次，每次间隔3周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血，间接细胞ELISA法检测小鼠 血清抗体效价，待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行融合，融 合前3d加强免疫1次。
[0038] 1. 2间接细胞ELISA试验于96孔板上接种2 X IO5/孔的SW1990细胞，至细胞生长 融合达 80%，95% 乙醇固定，PBS 洗 3 次，0.2% Triton-X-IOO 通透 20min，再用 50g/L BSA 37°C封闭2h，依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100 μ L，37°C温育lh，再经PBS洗3次 后，加入I :1000稀释的HRP标记的羊抗鼠 IgG 100 μ L，37°C温育45min，经PBS洗涤后，加 入TMB显色液，37°C温育IOmin后终止反应，用酶标仪测定450nm时吸光度（A)值，以未免 疫小鼠血清（1:1000)作为阴性对照。
[0039] 1. 3细胞融合取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液，与处于对数生长期的骨髓瘤细 胞SP2/0进行融合（姚晓玲，柳晓燕，吴强，等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原 的纯化[J].中国免疫学杂志，2006, 22 (12) : 1140-1145.)，首次融合960孔，融合1周后出 现细胞克隆，有800孔生长杂交瘤细胞，融合率约为83%。按照1. 2中的方法进行间接细胞 ELISA试验筛选阳性杂交瘤细胞（将1. 2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂 交瘤细胞培养上清），进行转种和4次有限稀释法亚克隆，获得稳定分泌抗SW1990单抗且阳 性最强的2株杂交瘤细胞株NM002-1及NM002-2。
[0040] 实施例2单抗腹水的制备及纯化
[0041] 取8~10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0. 5mL石蜡油，IOd后分别腹腔注射生长 良好的杂交瘤细胞NM002-1及NM002-2约I X IO6/只，1~2周后抽吸腹水，37°C Ih后，4°C过 夜，次日分别将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ002-1 及 NJ002-2。
[0042] 实施例3单抗的鉴定
[0043] 3. 1单抗Ig亚类的鉴定：纯化单抗用PBS 1:10000稀释，按照测定试剂盒说明书 操作。单抗NJ002-1及NJ002-2的亚类均为IgG，轻链为κ链。
[0044] 3. 2单抗效价的测定：分别将纯化的单抗NJ002-1及NJ002-2用PBS倍比稀释，分 别取100 μ L加入包被有SW1990细胞的96孔板中，用间接细胞ELISA法测定A45c^，能与包 被细胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体NJ002-1效价为8 X 106， 单克隆抗体NJ002-2效价为4Χ106。将杂交瘤细胞株ΝΜ002-1于2011年8月31日保藏于 中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO :C201173。
[0045] 3. 3染色体鉴定：将对数生长的杂交瘤细胞NM002-1秋水仙碱处理8h，再收集细 胞，经离心甩