[0096] 4. 1NJ002-1特异性抗原在胰腺癌患者血清中的表达
[0097] NJ002-1特异性抗原在胰腺癌中的阳性率为50. 6% (43/85)，明显高于胰腺良性 肿瘤组以及健康体检组（50. 6% vs 18. 2%，X2= 7· 451，P < 0· 05 ;50· 6% vs, 10. 0%，X 2=10. 098, P < 0. 05)。同时，将85例胰腺癌患者和40例健康体检者检测结果进行ROC曲线 分析，如图3,对应曲线下面积AUC = 0. 831 (标准误0. 041 ;95%可信区间0. 751-0. 912)。 cut-off值为2. 1时，对应的灵敏度为50. 6%，特异性为90. 0%。
[0098] 4. 2NJ002-1特异性抗原在手术前后的应用
[0099] 85例胰腺癌患者均进行胰腺根治性手术，包括28例胰（头）十二指肠切除术、 28例胰体尾切除术、24例保留幽门胰十二指肠切除术和5例联合血管切除的胰十二指肠 切除术。根治性手术前、后血清NJ002-1特异性抗原表达阳性率分别为50. 6% (43/85)和 23.5% (20/85)，差异有统计学意义（X 2= 8. 938, P <0.05)。
[0100] 4. 3胰腺肿瘤常用肿瘤标志物与本方法的比较
[0101] 85例胰腺癌患者血清NJ002-1特异性抗原的检出率虽低于CA19-9,但两者联合检 测的阳性率86. 8% (79/85)明显高于CA19-9单项的阳性率75. 8% (69/85)，差异有统计学 意义（X2= 5. 221，P <0· 05)，见表 7。
[0102] 表785例胰腺腺癌NJ002-1特异性抗原及CA19-9的单项和联合检测结果阳性 [n(%)]
[0103]
[0104] 上述实验结果表明：NJ002-1特异性抗原不仅在胰腺癌组织中高表达，而且在胰 腺癌患者血清中的表达程度高于健康对照，提示富含该抗原的肿瘤细胞可能移行至血管内 进入到血液循环中，为该抗原成为胰腺癌诊断的分子靶标提供有力的依据。ROC曲线分析 表明该抗原在诊断胰腺癌方面有一定的实用价值，且敏感性和特异性较理想。通过双抗体 夹心ELISA法检测血清中NJ002-1特异性抗原，可以为临床诊断胰腺癌提供有力的证据， NJ002-1特异性抗原可以作为新的胰腺癌的血清肿瘤标志物，有望用于该疾病的早期辅助 诊断。
[0105] 实施例6软琼脂克隆形成实验
[0106] 1、方'法
[0107] 生理盐水制备3 %琼脂糖溶液，高压蒸汽灭菌。在6孔细胞培养板中制备双层凝胶 琼脂。底层为支持层，将含10% FBS的L 15完全培养基与3%琼脂糖按5 :1比例混合，配 制成含0. 5 %琼脂糖的培养基，2ml/孔，加入6孔板中，室温冷却凝固。收集处于对数生长 期的胰腺癌SW1990细胞，用完全培养基制成单细胞悬液，37°C保温，取适量的单细胞悬液 与3 %琼脂糖溶液、不同浓度单克隆抗体NJ002-1溶液充分混合，2ml/孔，铺板制成含0. 3 % 琼脂糖的上层琼脂，每孔含有2X IO4个细胞，抗体终浓度分别为0、200 μ g/ml、400 μ g/ml、 800 μ g/ml、1600 μ g/ml和2000 μ g/ml，每剂量设3个平行孔。常温下待琼脂凝固后，将培 养板移入37°C、5% CO2培养箱中培养2周。倒置显微镜下计数，将多50个细胞的集落判定 为一个克隆，计算克隆形成率、抑制率。克隆形成率=(克隆数/接种细胞数）X 100%;抑 制率=(1 -实验组克隆形成率/对照组克隆形成率）X 100%。
[0108] 2、结果
[0109] 在双层琼脂培养基中，对照组SW1990细胞生长旺盛，一般7 - 10天可形成细胞集 落，2周后观察，集落数量多且明显增大。单抗NJ002-1作用后的细胞形成集落显著减少，且 集落远小于对照组，部分细胞不能在软琼脂中生长形成集落，呈单个散在的细胞（图4)。 [0110] 软琼脂克隆形成实验表明：单克隆抗体NJ002-1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990 在软琼脂中的克隆形成，并且其抑制程度与抗体的作用浓度呈正相关。200 μ g/ml单抗作用 2周后克隆抑制率为29. 79 %，400 μ g/ml单抗组抑制率达65. 96 %，而800 μ g/ml或更高浓 度的单抗组几乎无克隆生长（表8)。统计分析发现：200 μ g/ml和400 μ g/ml单抗组克隆 数与对照组相比显著减少（P〈〇. 001，P〈〇. 001)，200 μ g/ml单抗组和400 μ g/ml单抗组克隆 数相比也有显著差异（P〈〇. 001)。
[0111] 表8单抗NJ002-1对SW1990软琼脂克隆形成的影响（η = 3)
[0112]
[0113] 注：*P〈0. 001，与对照组比ΓΡ〈0. 001，与200 μg/ml单抗组比
[0114] 实施例7裸鼠移植瘤模型实验
[0115] 1、方法：
[0116] 25只裸鼠随机分为5组，设为生理盐水组、单抗组（200 μ g、400 μ g、800 μ g 3组） 和单抗对照组，每组5只。生理盐水组和单抗组裸鼠经右侧腋部皮下接种SW1990细胞悬 液，2 X IO6个细胞/只。单抗组接种当天开始腹腔注射200 μ 1不同浓度的单抗溶液，分别 含200 μ g、400 μ g、800 μ g单抗，前5天每天注射1次，之后每隔3天注射1次，连续2周 (累计注射9次）。生理盐水组以等体积的生理盐水代替单抗溶液，注射时间和途径相同。 单抗对照组5只裸鼠仅在腹腔注射200 μ 1单抗溶液，800 μ g单抗/只，抗体的注射时间同 单抗组。每日观察小鼠活动、精神状况、进食情况及肿块出现时间等并记录。自皮下结节出 现起，游标卡尺测量移植瘤长径（a)及短径（b)，移植瘤体积V = ab2/2。自接种肿瘤细胞 3周后，裸鼠颈椎脱臼处死，解剖分离肿瘤并称取瘤重、计算抑瘤率。抑瘤率=(1-单抗组 平均瘤重/生理盐水组平均瘤重）X 100%。
[0117] 2、结果：
[0118] 接种细胞后第9天，生理盐水组种植区最先出现肉眼可见的小结节，之后2天单抗 组出现小结节，成瘤率达100%。从第13天起测量肿瘤体积，观察至第21天。各组小鼠平均 肿瘤体积表现为：随着时间延长而增长，第17天起400 μ g、800 μ g单抗组与生理盐水组相 比，肿瘤体积的增长速度即有明显延缓，至观察结束时，差异持续存在（P〈〇. 001，P〈〇. 001， 图5A)。接种细胞3周后处死小鼠，分离肿瘤并称量肿瘤重量。生理盐水组、200 μ g、 400 以8、800 以8单抗组平均瘤重分别为（1.80±0.35)8，（1.57±0.32)8，（1.23±0.25) 8和 (I. 16±0.21)g。单因素方差分析进行组间比较，四组小鼠肿瘤重量具有统计学差异（F = 5. 410, P = 0. 009);两两比较发现400 μ g、800 μ g单抗组平均瘤重显著低于生理盐水组（P =0. 018, P = 0. 008) ;200 μ g单抗组与800 μ g单抗组间也存在显著差异（P = 0. 044)。 200以8、40(^8、80(^8单抗组抑瘤率由低至高分别为12.78%、31.67%和35.56%(图 5B、C)。800 μ g单抗对照组小鼠观察至实验结束，全部存活，生活状态正常，食欲旺盛，行动 自如，始终未见异常改变。
[0119] 结果表明：单抗NJ002-1在体内能显著抑制人胰腺癌移植瘤的生长。
【主权项】
1. 一株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，于2011年8月31日保 藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO !C201173。2. 由权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO :C201173的杂交瘤细胞株NM002-1分泌的 抗人胰腺癌的单克隆抗体NJ002-1。3. 权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌诊断试剂中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在 制备胰腺癌早期诊断试剂或辅助诊断试剂中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的诊断试剂包括免疫组织化学检测试 剂或血清免疫检测试剂。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的血清免疫检测试剂为酶联免疫吸附 检测试剂。7. 权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备胰腺癌预后诊断试剂中的应用；。8. 权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为检测靶标在制备胰腺癌诊 断或预后试剂中的应用。9. 权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。10. 权利要求2所述的单克隆抗体NJ002-1的特异性抗原作为靶点在制备治疗胰腺癌 的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了抗胰腺癌单克隆抗体及其应用。一株分泌抗人胰腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株NM002-1，2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201173。杂交瘤细胞株NM002-1分泌的抗人胰腺癌的单克隆抗体NJ002-1。本发明单抗NJ002-1特异性抗原在胰腺癌组织中的表达高于胰腺良性疾病组织；在低分化患者该抗原的阳性表达率高于高分化患者。且单克隆抗体NJ002‐1能够有效抑制胰腺癌细胞SW1990在软琼脂中的克隆形成，单抗NJ002‐1在裸鼠体内能显著抑制人胰腺癌移植瘤的生长。可见单克隆抗体NJ002‐1有望成为治疗胰腺癌的药物或制备成检测胰腺癌的诊断试剂。CCTCC NO：C20117320110831
【IPC分类】A61P35/00, C12N5/20, C12R1/91, A61K39/395, G01N33/577, C07K16/18
【公开号】CN104974988
【申请号】CN201510466976
【发明人】潘玥
【申请人】南京壬辰生物科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月31日