微小分子RNA-1247-5p作为新型肿瘤治疗分子靶标的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种内源性的非编码小分子RNAs稳定过表达细胞系的建立方法，尤 其涉及miR-1247-5p在肝癌细胞株H印G2细胞稳定过表达细胞系的建立以及其在预防与治 疗肝癌疾病中作为新的肿瘤标志物以及抗肿瘤药物研制中的用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌是目前世界上发病率仅次于胃癌和食道癌的第三大的恶性肿瘤。肝癌恶性 程度极高，预后较差，死亡率居各种恶性肿瘤前列。肝癌主要分为原发性肝癌以及转移 性肝癌两大类，在我国，肝癌的死亡率占常见肿瘤的第二位。在肝癌的发病机制中，fct/ β-catenin信号通路主要通过激活下游c-myc，cyclingDl，c-iun等祀基因的转录而导致 肝癌的发生与发展，同时GSK3 β /APC/Axin降解复合体的功能异常也是肝癌进展过程中的 重要因素。因此，通过分子治疗的方法可以有效控制肝癌的发生与发展，开展肝癌发病机制 及临床治疗的研究是减轻其危害的根本途径。
[0003] MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性非编码单链RNA，其长约为18~25 个核苷酸。miRNA通过Watson-Crick碱基互补匹配原则，对革EmRNA进行降解或抑制翻译来 调节蛋白的表达。据预测，人类约含有1000个miRNA，参与调控超过30%的蛋白编码基因， 在生物体的生长、发育、分化等方面起着重要的作用。miRNA的异常表达，参与肿瘤的各种生 物学过程，包括肿瘤细胞增殖、凋亡和迁徙、侵袭等。越来越多的证据表明，microRNA可作 为一种癌基因或抑癌基因，参与调控多种癌症的发生和发展过程。依此推断，miRNA可作为 一种癌基因或抑癌基因。
[0004] 以慢病毒载体作为研究小分子MicroRNA的手段已被多种研究采用，利用慢病毒 携带外源基因可以持续在宿主细胞内稳定表达的特点，可以持续稳定表达对肿瘤细胞有某 些特定功能的基因，建立稳定表达系可以更好的对这一基因的生物学功能以及其应用价值 提供模型基础。
[0005] 通过miRBase检索成熟miR-1247_5p序列信息，TargetScan、miRanda等进行革巴 基因预测，miR-1247-5p靶向抑制预测靶基因 WNT3基因的表达。无翅型MMTV整合位点 家族成员 3 (winglesstype MMTV integration site family member3，WNT3)存在于 Wnt/ β -catenin信号通路上游。WNT信号通路是一条存在于低等生物至高等生物中的高度保守 通路，其通路成员具有高度同源性，调控了包括动物胚胎早期发育，器官形成，组织再生等 生物学过程，在多个体外肿瘤模型中WNT信号通路均存在不同程度激活。在众多的miRNA 中，miR-1247已经被研究证实在多种肿瘤模型中表达异常，并很可能参与肿瘤的进程，成为 潜在的抑癌基因，而目前miR-1247-5p在肝癌肿瘤细胞中的调控作用机制及对其增殖与凋 亡进程影响的研究仍不清楚，因此，开发以miR-1247-5p为策略的肝癌疾病的预防、诊断和 治疗的基础研究和抗肿瘤药物研究具有重要的意义和应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种微小分子RNA-1247-5p(miR-1247-5p)在肝癌细胞 HepG2细胞中稳定表达的方法以及在预防与治疗肝癌疾病及抗肿瘤药物中的作用，所述 miR-1247-5p 的核苷酸序列如下所示：5' -ACCCGUCCCGUUCGUCCCCGGA-3'。
[0007] 本发明的研究基础：
[0008] 1.本发明成功获得了能够过表达miR-1247_5p的慢病毒颗粒，病毒有效滴度达到 lxl08TU/ml，利用慢病毒反复侵染的方法，经过对细胞多次培养传代，荧光显微镜下观察， 携带有miR-1247-5p外源基因的细胞占 95%以上，实时荧光定量检测细胞miR-1247-5p表 达量上升630倍。
[0009] 2.本发明通过TargetScarumiRanda等预测软件对miR-1247_5p进行祀基因预测， 通过双荧光素酶验证了其对WNT3具有特异性靶向抑制作用。
[0010] 3.本发明通过western blot证实了 miR-1247_5p过表达能够特异性明显抑制 WNT3蛋白表达水平。
[0011] 4.本发明通过CCK-8、Hoechst染色和流式细胞术同时证明，miR-1247-5p通过抑 制靶标WNT3的表达，下调其在肿瘤细胞高表达的水平，调控细胞周期，并使肿瘤细胞调往 趋势增加进而有效抑制细胞的增值，促进肿瘤细胞的凋亡。
[0012] 5.本发明同时从transwell细胞侵袭实验，证实了 miR-1247-5P能有效抑制肿瘤 细胞侵袭能力。
[0013] 6.本发明表明microRNA在临床实践中有非常重要的意义，将成为新一代的肿瘤 生物诊断标志物和用于肿瘤治疗的分子靶标。尤其是开辟了以miR-1247-5p为主的肿瘤疾 病全新靶标的研究，也为研制抗肿瘤新药开辟新的途径。
【附图说明】
[0014] 图1显示了 pSicoR/miR-1247-5p重组慢病毒侵染HepG2细胞后,显微镜下绿色突 光表达量。
[0015] 图2显示了提取经过多次传代后的HepG2细胞，实时荧光定量PCR检测 miR-1247-5p表达水平依然维持在较高水平。
[0016] 图3显示了提取福尔马林固定后石蜡包埋组织中RNA，反转录为cDNA，运用实时荧 光定量PCR方法检测miR-1247-5p在肝癌癌旁组织和癌变组织中表达情况。
[0017] 图4显示双荧光素酶报告系统验证miR-1247-5p靶向抑制WNT3荧光素酶活性。
[0018] 图5显示浓缩病毒上清液侵染肿瘤细胞western blot证实了 miR-1247_5p过表 达能够特异性明显抑制WNT3蛋白表达水平。
[0019] 图6显示CCK-8实验验证了 miR-1247-5p明显抑制肿瘤细胞H印G2细胞的增殖。
[0020] 图7显示hoechst染色实验验证了 miR-1247_5p明显促进肿瘤细胞HepG2细胞的 凋亡。
[0021] 图8显示流式细胞仪检测结果，miR-1247-5p能够使H印G2细胞凋亡趋势增加。
[0022] 图9显示Transwell实验验证了 miR-1247-5p明显抑制肿瘤细胞!fepG2细胞的迁 移和侵袭。
【具体实施方式】
[0023] I. miR-1247-5p过表达慢病毒的获得以及稳定表达miR-1247-5p细胞系的建立。
[0024] 在6孔细胞培养板中接种约IX IO6个HEK-293T细胞，每孔加入2mL含10% FBS DMEM完全培养基，37°C，5 % C02培养24h后，细胞密度达到80 %~90 %时，按照TransLipid Transfection Reagent 说明书，将三质粒系统（pSicoR-miR-1247_5p 过表达载体 L 5 μ g， pVSVGO. 45 μ g，A8. 911. 05 μ g)共转染至HEK-293T细胞中，收集转染48h和72h后的上清 液。4°C 3000g离心10min，去除细胞碎片，然后