片在玻片上，用〇.〇75mol/L KCl低渗处理，用甲醇冰醋酸固定液固定，经 10% Giemsa染色IOmin,镜下检测染色体。杂交瘤细胞的染色体数目范围为100~106条， 因为小鼠细胞的染色体数目为40条，而SP2/0细胞染色体数目平均为62~68条，证明杂 交瘤细胞中的染色体来自免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,均属杂交瘤细胞染 色体核型。
[0046] 3. 4单抗特异性的鉴定：用纯化的单抗NJ002-1与上述8种细胞系及健康人PBMC 分别做间接细胞ELISA分析，观察有无阳性反应。结果显示，单抗NJ002-1仅对胰腺癌细胞 (SW1990、Panc-l和BxPC-3)抗原具有较强反应，对其他肿瘤细胞（SPCAUH印G2、Colo 205、 ZR-75-30)抗原、人正常胰腺细胞（HPDE6c7)抗原及健康人PBMC均无反应。
[0047] 实施例4
[0048] 1.标本来源
[0049] 实验标本的组织来源于南京医科大学第一附属医院2009年-2014年行胰腺切除 的手术患者（胰腺癌120例，胰腺良性疾病17例）。所有患者在手术前均未接受过放疗或 化疗，且经病理检查确诊。查找相应的肿瘤组织石蜡标本，所有标本均经10%福尔马林固定 和石蜡包埋，由南京医科大学第一附属医院病理科存档并提供。在120例胰腺癌患者中，男 性64例，女性56例，中位年龄为62岁。按照2014版AJCC癌症分期手册的标准进行??Μ 分期，I期26例，II期80例，III期5例，IV期7例，2例无分期资料；Tl、T2共30例，T3、T4 共88例，2例无浸润深度资料；无淋巴结转移者61例，有淋巴结转移者57例。按照2004年 WHO胰腺癌分类标准进行分化程度评估，高分化癌37例，低分化癌68例，无分化程度资料者 15例。17例胰腺良性疾病包括12例胰腺浆液性囊腺瘤、2例胰腺假性囊肿和3例胰腺炎。 详细资料见表1。
[0050] 表1胰腺癌病人基本资料
[0051]
[0052]
[0053] 2.免疫组织化学染色
[0054] 免疫组织化学染色具体流程参考韩月，王芳，徐婷，等.NJ001-1特异性抗原在 肺腺癌中的表达及临床意义[J].中华检验医学杂志.2013, 36(10) :895-898。一抗为单克 隆抗体NJ002-1，以1 %的PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，确诊胰腺癌切片作为阳性对 照。快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物购自福州迈新生物技术开发公司；DAB显色试剂盒 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
[0055] 结果判定：根据肿瘤细胞内棕黄色阳性反应百分率和染色程度进行综合判定分 析。阳性百分率为在高倍视野下，每200个肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比，随机做5次。 阳性率计分标准：〇分（阳性百分率0 % )，1分（1~33 % )，2分（34-66 % )，3分（67~ 100%)。染色程度记分标准：无染色，浅黄色，棕黄色，棕褐色分别计为0，1，2,3分。两种 方法得分的乘积为0，1，2,3,4,6,9。将得分结果分为-(0)，+(1，2)，++(3,4)，+++(6,9)四 个等级，其中++，+++判定为阳性表达。
[0056] 3.随访
[0057] 收集的120例胰腺癌病例通过电话或门诊进行随访，共获得72例患者完整随访资 料，随访率60%。生存时间计算以月为单位，以手术日期作为观察起点，从手术日期到由于 胰腺癌复发或转移而死亡的日期或随访截止日期为止，非肿瘤死亡病例和完全失访病例按 统计学要求以截尾数据处理。
[0058] 4.统计学方法
[0059] 应用SPSS16. 0统计软件进行数据分析。计数资料采用x 2检验或者Fisher确切 概率法。生存分析采用Kaplan-Meier曲线法，两组生存期比较采用log-rank检验。采用 逐步引入-剔除法进行多因素 Cox比例风险模型分析。p〈0. 05为差异有统计学意义。
[0060] 5.结果
[0061] 5. 1NJ002-1特异性抗原在胰腺癌及胰腺良性疾病组织中的表达
[0062] 本实验组织标本包括120例胰腺癌及17例胰腺良性疾病组织，所有免疫组化检测 结果见表2-3。
[0063] 表2胰腺癌患者石蜡组织切片NJ002-1特异性抗原免疫组化结果一览表
[0064]
[0065]
[0069] 表3胰腺良性疾病患者石蜡组织切片NJ002-1特异性抗原免疫组化结果一览表
[0070]
[0071]
[0072] NJ002-1特异性抗原的表达以细胞浆为主，与之前的研宄结果一致。在绝大部分胰 腺良性疾病组织中未见该抗原表达，少量组织呈微弱表达；胰腺癌组织中可见大部分出现 较多棕黄色或棕褐色颗粒，显示该抗原的表达明显增强（图1)。
[0073] NJ002-1特异性抗原在120例胰腺癌及17例胰腺良性疾病中的阳性率分别为 76. 7%和17. 6%，差异有统计学意义（P〈0. 001，表4)。
[0074] 表4NJ002-1特异性抗原在胰腺癌和胰腺良性疾病中的表达
[0075]
[0076] 5. 2NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌临床病理特征的关系
[0077] NJ002-1特异性抗原表达阳性率在肿瘤低分化及高分化组中分别为82. 4 % vs. 62. 2% ;浸润深度为T1/T2以及T3/T4组分别为60. 0% vs. 83. 0% ;无淋巴结转移及有 淋巴结转移组阳性率分别为63.9% vs.91.2%，经X2检验均存在统计学差异。该抗原的 表达情况与胰腺癌患者的年龄、性别、肿瘤直径无明显关系。在12例III/IV期的胰腺癌患 者中，该抗原表达的阳性率为100%，但与Ι/Π 期相比，无统计学差异（表5)。
[0078] 表5NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌患者临床病理特征之间的关系
[0079]
[0080] *采用Fisher确切概率法，其余用X 2检验。
[0081] 5. 3NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌患者预后的关系
[0082] 随访至2015年5月31号，随访终点为患者死亡，共有72例资料完整的病例纳入 我们的研宄。中位随访时间为12. I (3. 1-36)个月。NJ002-1特异性抗原表达阴性组有16 例，其中3例死亡；阳性组有56例，其中有31例死亡。阳性组（η = 56)的中位生存时间 为13. 2月，阴性组（η = 16)的平均生存时间为14. 6个月。NJ002-1特异性抗原阳性表达 组及阴性表达组之间的生存时间有显著差异，即该抗原表达程度越高，生存时间越短（Ρ = 0. 021，图 2)。
[0083] 上述实验结果表明：NJ002-1特异性抗原在大部分胰腺癌组织中表达水平较高， 而在胰腺良性疾病组织中表达较弱，提示该抗原可能会影响胰腺癌的进展。进一步的分析 证实，NJ002-1特异性抗原的表达与胰腺癌的分化程度、浸润深度及淋巴转移有着密切的关 系。可见，该抗原的高表达可能提示肿瘤侵袭性与转移能力较强。因此，单克隆抗体NJ002-1 可以用于制备免疫组化试剂，用于胰腺癌的诊断、预后以及预示肿瘤侵袭性与转移。
[0084] 实施例5
[0085] 1.血样：收集2014年6月至2015年5月南京医科大学第一附属医院收治的胰腺 肿瘤患者血清标本107例，包括85例胰腺癌、22例胰腺良性肿瘤，其中22例胰腺良性肿瘤 包括4例胰腺（假性）囊肿和18例浆液性囊性肿瘤。所有患者均行根治性手术且经组织 病理学确诊，并且所有患者在手术前均未接受过放疗或化疗。同时收集40例健康体检者血 清标本。临床病理参数见表6。
[0086] 表6不同类型胰腺肿瘤和对照组的临床病理参数
[0087]
[0088] 2.方法
[0089] 2. 1标本采集及处理：用血清分离胶真空采血管采集胰腺癌患者术前及术后第10 天静脉血2ml，室温静置20min后，2100x g离心10min，转移上层血清，再于4°C，16000x g 离心10min，吸取上层无细胞血清分装每管130 μ 1，置-70°C保存。
[0090] 2.2细胞培养：5?(：41细胞生长于含10%胎牛血清、10(^/1^青霉素及1001^/1^ 链霉素的RPMI 1640培养液中，37°C，5% CO2恒温培养箱中培养。
[0091] 2. 3双抗体夹心ELISA方法：以抗SPC-Al兔多克隆抗体（L 782 μ g/ml)包被96 孔酶标板，100 μ 1每孔，4°c过夜，洗板3次；3% BSA每孔300 μ 1，4°C封闭过夜，洗板3次； 加人待检血清50 μ 1每孔，37°C孵育2h，洗板6次；加 NJ002-1 -抗（5mg/ml，1:1000稀 释），每孔100 μ 1 (空白孔除外），37°C孵育lh，洗板6次；加山羊抗小鼠 IgG/辣根酶标记 (1:2000)，每孔100 μ 1 (空白孔除外），37°C孵育30min，洗板6次；每孔加人新鲜配制的底 物显色液100 μ 1，室温避光显色lOmin，加50 μ 1终止液终止反应。用酶联仪读取吸光度（A) 值，读数波长450nm。阳性和阴性对照分别为SPC-Al细胞裂解液、胎牛血清，空白对照为不 加任何成分。以本实验室前期检测的300份健康体检者的血清样本结果的P/N值的x±2s 即2. 1为判断界值（cut-off值）。
[0092] 2. 4电化学发光法检测CA19-9:通过罗氏Cobas e 602电化学发光免疫分析仪对 样本进行血清CA19-9的同步检测，试剂、定标液、质控品均由厂家原装提供。CA19-9以39U/ mL 为 cut-off 值。
[0093] 3.统计学处理
[0094] 采用SPSS19. 0软件对本次研宄的数据进行分析。各组间及手术前后阳性率比较 采用X 2检验或Fisher确切概率法，P〈0. 05为差异有统计学意义。
[0095] 4.结果