mAb 检测 NP，GM-CSF pAb 检测 GM-CSF)。4 ° C孵育8h，用PBST洗涤3次后，加入红外标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠 IgG，4 ° C孵育 4 h，用PBST洗涤3次后，红外成像仪采集图像分析。
[0037] 含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的免疫学特性研宄： 将48只C57BL/6小鼠随机分为4组，每组12只。按下表1所示的分组及剂量，采用皮 下注射方式进行免疫，14 d后加强免疫一次，28 d后再加强免疫一次，共免疫3次，各组的 免疫剂量如表1所示。GM-CSF+VLP表示以重组鼠 GM-CSF与汉坦病毒VLP联合免疫。
[0038] 1、体液免疫反应检测： (1)小鼠血清中特异性抗体的检测：将经纯化的HTNV GP和NP全长肽稀释至0. 15 μ g/ ml，分别包被96孔聚苯乙烯微板，4 °C过夜，PBST洗涤三次后加入含1% BSA的PBS缓冲液， 37 °C孵育I h。PBST洗涤三次，加入倍比稀释的各组小鼠血清和正常小鼠血清，37 °C孵 育I h。PBST洗涤三次，加入1:1000稀释的HRP标记羊抗小鼠 IgG，37 ° C孵育I h。PBST 洗涤三次，拍干后加入TMB显示液，室温避光静置20 min后加入2 M H2SOjS止反应，多功 能酶标仪读取450 nm吸光度值。以正常小鼠血清检测结果为阴性，实验组小鼠血清检测数 值与阴性比值大于2. 1判定结果为阳性。
[0039] (2)小鼠血清中中和抗体检测：前一日将Vero E6细胞以胰蛋白酶消化，1000 rpm 离心5 min，用含10% FBS的RPMI-1640培养液重悬，调整浓度至I X IO5个/ml，加入96孔 细胞培养板，每孔100 μL。将各组小鼠血清用0. 22ym滤器过滤除菌，加 RPMI-1640按 1:80、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 稀释，与 100 TCID50 的 HTNV 病毒 1:1 体积混合， 37 °C，CO2培养箱中孵育I h。将96孔板中培养液弃去，PBS洗2次，将病毒与血清混合液 依次加入孔板，每个样品加4个复孔，每孔200 μ 1，同时设置不加病毒的孔。将3G1 mAb按 相同方法稀释后与100 TCID50的HTNV病毒1:1混合，孵育后加入孔板作为对照。37 °C， CO2培养箱孵育12 d后将孔板室温/-80 ° C反复冻融3次，1000 rpm离心10 min后吸出 孔板中上清待用。
[0040] 1A8 mAb包被96孔聚苯乙烯微板，4 °C过夜。PBST洗涤三次，加入上述上清，37°C 孵育I h。PBST洗涤三次，加入1:400稀释的HRP-1A8, 37° C孵育I h。PBST洗涤三次，拍 干后加入TMB显色液，室温避光静置20 min，多功能酶标仪读取450 nm吸光度值，以正常细 胞孔检测值为阴性，实验孔读值与阴性比值小于2. 1认为病毒被中和，4个复孔中有三个或 全部四个孔比值小于2. 1则认为该稀释比例的血清有中和作用。
[0041] 2、细胞免疫反应检测： (1)小鼠脾细胞细胞因子分泌水平的检测：处死小鼠，75%酒精浸泡3 min后，置于超净 工作台内剪开小鼠腹部皮肤和腹膜，取出脾脏，200目筛网研磨后加2 ml红细胞裂解液，室 温静置2 min，加含2% FBS的RPMI-1640并轻柔混匀，室温静置5 min终止裂解，1000 rpm 离心5 min，弃去上清并加入含10% FBS的RPMI-1640培养液将细胞重悬，置37°C，C02细胞 培养箱中培养。前一日将ELISP0T孔板按照说明书要求预处理并包被IL-2、IL-4、IL-10抗 体（IFN-γ检测试剂盒提供预包被板)，4 °C过夜。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入含 10% FBS的RPMI-1640培养液4 °C封闭6 h。将各组小鼠脾细胞分为三部分，用含5% FBS 的RPMI-1640培养液调整浓度至2 X IO7个/ml，分别加入ELISP0T孔板中，每孔50 μ 1，再 分别加入20 μ g/ml的Gn肽池、Gc肽池及NP肽池，每孔50 μ 1。同时设置加入相同浓度 ConA、只加入脾细胞、只加入培养液的孔作为对照，孔板置于37 °C C02培养箱孵育24 h。 弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，分别加入试剂盒提供的生物素标记抗IFN- γ、IL-2、IL-10、 IL-4单克隆抗体，4 °C孵育过夜。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入试剂盒提供的HRP 标记抗生物素抗体，室温静置4 h。弃去孔板中液体，PBS洗涤5次，加入TMB显色液，置于 37 °C恒温箱，待孔板底部有斑点形成后，去离子水冲洗以终止反应。避光待孔板干燥后， ELISP0T检测仪读取每孔斑点数，计算斑点形成细胞数（Spot-forming cells，SFC)。
[0042] (2)免疫小鼠脾细胞CTL杀伤活性的检测：将各组小鼠脾细胞分为三部分，分别加 入10 μ g/ml的GP肽池及NP肽池，并同时与25 U/ml的IL-2混合。37 °C 0)2细胞培养 箱中培养24 h，将各肽池刺激的小鼠脾细胞均稀释成2 X IO7个/ml、I X 107个/ml、0. 5 X 107个/ml、0. 25X IO7个/ml的浓度，作为杀伤实验的效应细胞。将HTNV感染的小鼠腹腔巨噬 细胞胰蛋白酶消化，1000 rpm离心5 min，加含10% FBS的RPMI-1640重悬细胞，并调整浓 度至2X IO5个/ml，作为杀伤实验的靶细胞。将各浓度的效应细胞和靶细胞1:1混合，形成 100:1、50:1、25:1、12. 5:1的效靶比。将效应细胞-靶细胞混合液加入到U底96孔细胞培 养板中，每孔100 μ 1。同时设置乳酸脱氢酶（LDH)孔作为阳性对照，靶细胞与裂解液混合 (靶细胞LDH最大释放)、只加入效应细胞(效应细胞自发释放LDH)、只加入靶细胞(靶细胞自 发释放LDH)和只加入培养液的孔（阴性对照)，37 ° C CO2培养箱中孵育24 h。1000 rpm离 心孔板10 min，将上清转移至新96孔微板中，加入试剂盒提供的底物，每孔50 μ 1，加入I M H2SOjS止反应。室温避光静置20 min，多功能酶标仪读取490 nm吸光度值，按以下公式计 算杀伤效率：
3、疫苗对病毒感染动物的保护作用： 在第二次加强免疫后第14 d，以100LD50的汉坦病毒（HTNV 76-118)感染各组小鼠，每 组感染4只，腹腔注射，100 μL/只。注射后第3 d，颈脱白处死小鼠，取各组小鼠的心脏、 肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑进行检测。
[0043] (1)小鼠脏器组织中病毒抗原的检测： 将小鼠各脏器组织加入RPMI-1640并充分研磨，室温/-80°C反复冻融三次，10, 000 rpm 4 °C离心30 min，0.45 μm滤器过滤彻底去除组织碎块后BCA法测定各组总蛋白浓 度，加 RPMI-1640统一稀释成I mg/ml。采用2. 1. 5中ELISA方法检测HTNV抗原。
[0044] (2)小鼠脏器中病毒核酸的检测： HTNV S基因及小鼠 GAPDH引物序列如下：
取各组小鼠脏器加入液氮后研碎，加入组织总RNA提取试剂盒提供的裂解液，重复研 磨后按照试剂盒要求提取组织总RNA。以提取的总RNA为模板，使用RT-PCR试剂盒将其反 转录为cDNA。将获得的cDNA分为两部分，以HTNV Forward/Reverse为引物进行实时定量 PCR检测HTNV特异性核酸，同时使用小鼠 GAPDH Forward/Reverse为引物进行实时定量PCR 检测作为对照。
[0045] 本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书 而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于： 基于哺乳动物细胞表达系统能够正确折叠、组装和翻译后修饰蛋白的特点，通过构建 真核表达载体，共转染dhff CHO细胞，组装含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒。2. 根据权利要求1所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于： 所述制备方法由以下步骤实现： 步骤一：载体构建： 将汉坦病毒76-118株核衣壳蛋白S基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，构建S基 因表达载体； 将汉坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo载体CMV启动子下，GM-CSF基因 克隆入SV40启动子下，构建M基因和GM-CSF基因的共表达载体； 步骤二：含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备： 将步骤一得到的两种载体各10 U g共转染dhfr_ CHO细胞，于培养基培养24 h后弃去 维持培养基，PBS洗涤三次后加入无血清筛选培养基，48 h后收集含有VLP的培养上清；经 蔗糖密度梯度离心纯化后，低温保存。3. 根据权利要求2所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于： 步骤二中，培养基为含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黄嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的頂DM 培养基。4. 根据权利要求3所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法，其特征在于： 步骤二中，无血清筛选培养基为含500 nM MTX、800 y g/ml G418的Hycell培养基。5. 如权利要求4所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒的制备方法制得的病毒样颗粒。6. 如权利要求5所述的包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒在制备肾综合征出血热预防疫 苗方面的应用。
【专利摘要】本发明涉及包含GM-CSF的汉坦病毒样颗粒及其制备方法和应用。对于多个蛋白组成的VLP，基于昆虫细胞表达系统需要制备表达各个蛋白的杆状病毒，再以不同的比例共同感染昆虫细胞，需要大量工作摸索共感染比例，并且产品中混合的杆状病毒为后期纯化带来一定的困难。本发明基于哺乳动物细胞表达系统，通过构建真核表达载体，共转染dhfr- CHO细胞，组装含有GM-CSF的汉坦病毒样颗粒。本发明使嵌合VLP的各个组分均能表达，构建的真核表达载体上含有多个筛选标记，通过筛选可以建立稳定表达嵌合病毒样颗粒的细胞株，便于大规模生产和制备，可用于汉坦病毒感染引起的肾综合征出血热的预防。
【IPC分类】A61P31/14, C12N15/40, A61K39/12, C12N15/85, C12N7/04, C12R1/93
【公开号】CN104974990
【申请号】CN201510386604
【发明人】吴兴安, 王芳, 张晓晓, 应旗康, 刘梓谕, 张芳琳, 程林峰, 于澜, 张亮, 徐志凯
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年7月6日