专利名称：抗菌蛋白β－1－3,1－4－葡聚糖内切酶和裂解酶L27及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27及其用途，尤其是利用这两种酶及其编码基因、以及含有这两个酶切割功能域的缩微融合肽段的重组基因、重组肽的用途。这些用途包括作为药物组分、农药组分、消毒剂组分、牙膏组分、饲料制备酶制剂组分等。
背景技术：
随着抗生素的广泛使用，病原菌耐药性成为了影响公共健康的重要问题。对微生物细胞壁有水解功能的酶能够溶解微生物细胞壁而使其死亡，而复合酶克服了一种抗生素只能预防一种病原菌或一种血清型病原菌的不足，具有更广谱更高效的抗菌活性，同时也不存在药物残留和耐药性的问题。
β-1-3，1-4-endoglucanase(lichenases，EC 3.2.1.73)能分解含有β-糖苷键链成的葡萄糖聚合物，使其降解为低分子量片段，在食品、酿造、饲料和日化等工业方面应用。葡聚糖酶在抗真菌中也有重要作用，可降解病原菌细胞壁的主要成分——葡聚糖，导致病原菌细胞破裂，生长受阻，不能继续侵染和为害农作物。
lytic enzyme L27是一种细胞裂解酶，属于Subtilase family，在芽孢杆菌属中报道很少。Kim S.Y.等对lytic enzyme L27抗菌谱的研究显示其对革兰氏阳性菌有抗菌活性，但对革兰氏阴性菌和真菌没有抗菌活性。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种重组表达β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的工程菌；2.获得大量纯化的β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27；3.利用含有β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的工程菌及其重组产物作为药物或者消毒剂；4.获得含有β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27切割功能域的缩微融合肽段。
本发明的技术方案如下采用本领域技术人员熟知的技术，从芽孢杆菌基因组扩增β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27基因，或者进行缩微化，构建融合基因，在大肠杆菌等适宜的宿主表达，纯化表达产物，并检测效果。
实现上述目的的基本技术路线为
总体技术方案是克隆包括提取芽孢杆菌基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的大肠杆菌宿主细胞。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基等能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.工程菌的构建按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA克隆到适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的工程菌。
3.功能基因的筛选 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。
4.利用含有功能基因的重组菌，进行功能应用。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，得到了1.一种重组表达芽孢杆菌β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的工程菌；2.获得大量纯化的β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27；3.利用含有β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的工程菌作为药物组分；4.含有β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的各种混合物在药物、农药、牙膏和饲料制备中的应用。
图1.β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶基因的PCR产物。
图2.lytic L27的PCR产物。marker DL2000 2.空质粒对照 3.重组菌菌落PCR鉴定 4.Bacillus sp.基因组PCR图3.重组蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase亲和层析纯化图。1.杂蛋白峰2.非特异吸收峰3.特异吸收峰(目的蛋白)图4.重组蛋白Lytic enzyme L27亲和层析纯化图。1.杂蛋白峰2.非特异吸收峰3.特异吸收峰(目的蛋白)图5.重组蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase SDS-PAGE。1.总蛋白2.亲和层析后纯化收集峰3.小分子量蛋白marker图6.重组蛋白Lytic enzyme L27 SDS-PAGE。1.小分子量蛋白marker2.空质粒转化菌总蛋白3.重组菌总蛋白4-8.亲和层析后纯化收集峰图7.牛奶平板检测重组蛋白的蛋白酶活性。空质粒对照2.beta-1-3，1-4-endoglucanase重组蛋白3.lytic enzyme L27重组蛋白。
图8.重组蛋白抑菌活性检测。1.空质粒2.重组蛋白beta-1-3，1-4-endoglueanase 3.重组蛋白lytic enzyme L27 5.重组蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27混合物(a)重组蛋白对白色假丝酵母抑菌活性。(b)重组蛋白对大肠杆菌抑菌活性。(c)重组蛋白对铜绿假单孢菌抑菌活性。
具体实施例方式
我们分离到一株高产蛋白酶的芽孢杆菌，通过16s rDNA鉴定其属于Bacillus spp.。纯化单一活性峰冷干产物，SDS-PAGE分离得到两个条带，经肽指纹图谱鉴定这两种蛋白分别为β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27。抑菌实验证明蛋白样品对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌有显著的抑菌效果(另文发表)。克隆β-1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27的成熟蛋白，在大肠杆菌中表达，纯化重组蛋白进行活性鉴定。我们的结果显示，两种蛋白的协同作用有更强的抗菌作用。这些研究将为抗菌蛋白的理论研究和复合酶抗菌的进一步应用奠定基础。
1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和培养基Bacillus sp.由本实验室分离鉴定。质粒pET32a(+)、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α和E.coli BL21(DE3)、白色假丝酵母、大肠杆菌标准菌株、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为本实验室保存。藤黄微球菌(Micrococcus luteusCNCC(B)28001)由四川省抗生素研究所王明蓉研究员惠赠。
LB培养基酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，定容至1000ml，固体培养基中添加2％琼脂。。
1.1.2主要试剂限制性内切酶EcoR I、HindIII和Xho I、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；PfuDNA聚合酶、dNTP和buffer、IPTG购自merck；DNA胶回收试剂盒购自Bioflux；Ni2+-Sepharose和_KTA prime蛋白纯化系统购自Amersham Biosciences；低分子量蛋白标准购自上海生化所研究所。
1.2目的基因PCR扩增和克隆根据GenBank中Bacillus licheniformis株β-1-3，1-4-endoglucanase和Bacillussubtilis株lytic enzyme L27的基因序列，自行设计一对扩增该成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，β-1-3，1-4-endoglucanase引物序列为G15’-AGCGAATTCATGCAAACAGGTGG-3’；G25’-GGTGAGCTCTTTTTGAAAGCGCACC-3’(划线序列分别为EcoRI和HindIII酶切位点)。以Bacillus sp.基因组DNA为模板，以G1，G2为引物进行PCR，反应条件95℃ 5min；95℃ 45s，55℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃10min。纯化后的PCR产物和质粒pET32a(+)以EcoRI和HindIII双酶切后，切胶纯化后，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至感受态E.coli BL21(DE3)，经菌体PCR筛选获得原核表达重组质粒pET32a-G。送Invitrogen公司测序。
根据GenBank中和Bacillus subtilis株lytic enzyme L27的基因序列，自行设计一对扩增该成熟蛋白基因的PCR引物(由Invitrogen公司合成)，序列为L15’-CCCAAGCTTATATTAAAGCCCCTGCTC-3’；L25’-TACCTCGAGTTATTGTGCAGCCGC-3’(划线序列分别为HindIII和Xho I酶切位点)。以Bacillus sp.基因组DNA为模板，以cf，cr为引物进行PCR，反应条件95℃ 5min；95℃ 45s，52.5℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；72℃10min。纯化后的PCR产物和质粒pET28a(+)以HindIII和Xho I双酶切后，切胶纯化后，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化至感受态E.coli BL21(DE3)，经菌体PCR筛选获得原核表达重组质粒pET32a-L27。送Invitrogen公司测序。
1.3目的基因的表达和SDS-PAGE分析将原核表达重组克隆接种于10ml(含20μg/ml氨苄青霉素)的LB培养基中，37℃200rpm/min培养过夜。1％接种到50ml LB(含20μg/ml氨苄青霉素)中，37℃200rpm/min培养至OD6000.5～0.8，加IPTG至1mmol/L诱导表达，诱导4h。以同样的方法诱导含空质粒pET32a(+)的E.coli BL21(DE3)做对照。
诱导收获的的菌液1ml，离心收集菌体。加入100μl2×SDS凝胶上样缓冲液，振荡混匀，沸水煮沸5min，12000rpm/min离心10min，取上清15μl进行12％SDS-PAGE。
1.4重组蛋白的纯化及浓度测定按上面的方法诱导500ml重组菌。菌液4℃离心30min。用20ml 1×Ni2+-SepharoseBinding buffer(20mmol/L NaH2PO4，500mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH7.4)重悬细胞。冰上超声破碎菌体，4℃离心，弃沉淀，上清0.45μm的滤膜过滤，然后用Ni2+-Sepharose亲合柱对蛋白进行纯化。10倍柱体积Binding buffer，10倍柱体积的Wash buffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，80mmol/L咪唑，pH7.4)，10倍柱体积的Elutionbuffer(20mmol/LNaH2PO4，500mmol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH7.4)。收集洗脱峰，SDS-PAGE分析。洗脱的重组蛋白4℃透析过夜。蛋白浓度采用Bradford法进行。
1.5重组蛋白活性测定1.5.1 CMC(羧甲基纤维素)法测定纤维素酶的活性取1支小试管(15mm×150mm)，加羧甲基纤维素钠溶液2.0mL，于50℃水浴中预热2～3min，加稀释酶液0.5mL，保温30min，取出加入3，5-二硝基水杨酸2.5mL，沸水浴煮沸5min，冷却后用分光光度计530nm处比色测定OD值。另取小试管加羧甲基纤维素钠2.0mL，先加入2.5mL 3，5-二硝基水杨酸，再加酶液0.5mL，其他操作同样品测定作空白测定。CMC酶活力＝B×n/0.5mg/g·30′·50℃(B-从标准曲线中查得的净葡萄糖毫克数(mg)；n-酶液稀释倍数；0.5-测定时吸取稀释酶液毫升数(mL))。[16]1.5.2蛋白酶活性测定方法1.5.2.1牛奶平板检测蛋白酶活性。
1.5.2.2经典蛋白酶活性检测方法。以酪蛋白为底物，取5％酪蛋白1ml，加入3.9ml Tris-HCL(0.2mol/L，pH7.1)缓冲液，于37℃恒温水浴中预热5min，加入蛋白酶样品0.1ml，37℃反应20min。加50％三氯乙酸(TCA)终止反应，离心(10000r/min，10min)取上清液，280nm下测OD值。以先加TCA再加酪蛋白为空白对照。在此条件下每分钟增加0.001个OD值为一个酶活力单位(U)[13]。
1.5.3抑菌活性检测方法检测菌大肠杆菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，藤黄微球菌，枯草芽孢杆菌，白色假丝酵母。
方法取菌液0.4ml，均匀涂布于平板固体培养基上，无菌操作将灭菌的滤纸片放置在培养基表面，轻轻加压，使其与培养基接触无间隙，样品点样量为20ul。在最适培养温度下培养10h，观察抑菌活性。
1.6生物信息学分析使用Vector NT I Suite9对蛋白序列以及氨基酸组成进行分析。使用在线软件SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对蛋白信号肽进行预测。使用NCBI的RPS-BLAST对氨基酸一级结构保守域进行比对。使用PredictProtein蛋白质结构预测软件进行蛋白质多重序列对比，预测二级结构、残基可溶性、跨膜螺旋位置、折叠拓扑类型。
2结果2.1 β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27基因的扩增和克隆以Bacillus sp.基因组DNA为模板，以G1，G2为引物进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖电泳分析，可见1条约800bp的DNA片断，与预期DNA片断大小一致。
纯化的β-1-3，1-4-endoglucanase PCR产物与pET32a(+)连接，构建的重组质粒通过菌体PCR检测(图1)，再通过测序鉴定，该序列和GenBank中Bacillus subtilis的β-1-3，1-4-endoglucanase序列比对，有100％的同源性。
以Bacillus sp.基因组DNA为模板，以L1，L2为引物进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖电泳分析，可见1条约800bp的DNA片断，与预期DNA片断大小一致。
1.纯化的Lytic enzyme L27 PCR产物与pET32a(+)连接，构建的重组质粒通过菌体PCR检测(图2)，再通过测序鉴定，该序列和GenBank中Bacillus subtilis的lytic enzyme L27序列比对，有100％的同源性。
2.2重组β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27的异源表达与纯化经过IPTG诱导，重组β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27目的蛋白均主要以胞内可溶形式表达。菌体超声波破碎后上清中的可溶重组蛋白经亲和层析纯化(图3)，在考马斯亮兰染色的SDS-PAGE上纯化可见单一条带(图4)。
2.3重组蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27蛋白酶活性的测定通过牛奶平板检测蛋白酶活性，空质粒样品没有明显的透明圈，但是重组菌β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27样品均可见明显的透明圈(图5)，说明重组蛋白β-1-3，1-4-endoglucanase和Lytic enzyme L27均有很强的蛋白酶活性。这个结果同时可以经典蛋白酶活性检测方法证明。(表1)两种蛋白混合物的蛋白酶活性。
表1.蛋白酶活性测定结果
2.4纤维素酶活性测定结果通过纤维素酶活性测定结果可知，beta-1-3，1-4-endoglucanase重组蛋白有纤维素酶活性，lytic enzyme L27重组蛋白没有纤维素酶活性。两种蛋白质混合物的纤维素酶活性。
表2纤维素酶活性测定结果
1.5抑菌活性检测使用革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单孢菌)、革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌)、真菌(白色假丝酵母)进行蛋白抑菌活性检测(图6)。结果显示同种浓度下，重组beta-1-3，1-4-endoglucanase对真菌(白色假丝酵母)有抑菌效果，重组蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lyticenzyme L27混合物协同作用时对白色假丝酵母有抑菌效果，且有强烈增效作用。重组蛋白beta-1-3，1-4-endoglucanase和lytic enzyme L27的混合物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、铜绿假单孢菌)有抑菌效果，但是同种浓度下，每个蛋白单独作用抑菌效果不明显。
权利要求
1.抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是含有表达抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的重组工程菌、纯化的重组酶以及利用纯化的酶或工程菌进行的应用。
2.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，作为治疗性药用混合物的组分。
3.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，作为化妆品的组分。
4.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，作为牙膏等的组分。
5.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，作为动物饲料制备的组分。
6.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，构建融合表达的工程菌或者重组酶。
7.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，将负责切割的功能域进行融合，仍然具有裂解活性的的缩微融合肽段及其用途。
8.权利要求1所述的抗菌蛋白β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的用途，其特征是利用β-1-3，1-4-葡聚糖内切酶和裂解酶L27的协同作用，作为农药的组分。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及抗菌蛋白β－1－3，1－4－葡聚糖内切酶和裂解酶L27及其用途，尤其是利用这两种酶及其编码基因、以及含有这两个酶切割功能域的缩微融合肽段的重组基因、重组肽的用途。这些用途包括作为药物组分、农药组分、消毒剂组分、牙膏组分、饲料制备酶制剂组分等。
文档编号A61K38/51GK1995337SQ20061009534
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者谢建平, 刘玉岭 申请人:西南大学