一种农药残留降解复合菌及生产方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于农药残留降解的复合菌菌剂及其生产方法，属于环境微生物技术应用领域，复合菌由如下菌种组成：枯草芽孢杆菌30-40%、地衣芽孢杆菌30-40%、放线菌10-20%、反硝化细菌10-20%、光合细菌10-20%，具体产品中各微生物组合总数为100%.产品性状为液体或固体；所述的农药残留降解复合菌的制备方法，包括一级种子液的制备，二级种子液发酵，生产液发酵，单独发酵完成后将发酵液装入贮液罐步骤；所使用的微生物以异养菌为主，能够产生生物活性酶。
【专利说明】一种农药残留降解复合菌及生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于应用生物【技术领域】，涉及一种农药残留降解的微生物复合菌及其生产方法。
【背景技术】
[0002]农药是农业环境的主要有机污染物全国每年使用的农药量达50万-60万t，使用农药的土地面积在2.8亿hm2以上，农田平均施用农药13.9 kg/hm2。直接进入土壤的农药，大部分可被土壤吸附，残留于土壤中的农药，由于生物和非生物的作用，形成具有不同稳定性的中间产物或最终产物无机物。喷施于作物体上的农药，除部分被植物吸收或逸入大气外，约有1/2左右散落于农田，又与直接施用于田间的农药构成农田土壤中农药的基本来源。农作物从土壤中吸收农药，在植物根、茎、叶、果实和种子中积累，通过食物、饲料危害人体和牲畜的健康。截止2011年底，全国受污染的耕地约有1000万hm2，有机污染物污染农田达3600万hm2，主要农产品的农药残留超标率高达16%-20%;这些农药残留广泛分布于土壤、水体、大气及农产品中，难以利用大规模的工程措施消除污染。实际上，在自然界主要依靠微生物缓慢地进行降解，这是依靠自然力量、不产生二次污染的理想途径。但自然环境复杂，单位面积内菌种的含量低，农药生物降解的效率低和时间漫长，因此，加强农药的生物降解研究、解决农药对环境及食物的污染问题，是人类当前迫切需要解决的课题之一。
[0003]
本发明的目的是提供一种含多种微生物细菌的农药残留降解复合菌。
[0004]微生物降解农药的过程就是通过微生物各种代谢途径把有机农药完全矿化或降解成无毒的其他成分，人工构建单位面积“工程菌”的种类和细菌含量，为微生物细菌降解农药提供必要的条件。
[0005]微生物细菌降解农药的本质是酶促反应，化合物通过一定的方式进入细菌体内，然后在各种酶的作用下，经过一系列的生理生化反应，最终将农药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。经过试验表明，如莠去津作为假单胞菌ADP菌株的唯一碳源，有3种酶参与了降解莠去津的前几步反应。第一种酶是A tzA，催化莠去津水解脱氯的反应，得到无毒的羟基莠去津，此酶是莠去津生物降解的关键酶；第二种酶是AtzB，催化羟基莠去津脱氯氨基反应，产生N—异丙基氰尿酰胺；第三种酶是A tzC，催化N —异丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和异丙胺。最终莠去津被降解为C02和NH3。微生物所产生的酶系，有的是组成酶系，如门多萨假单胞菌DR — 8对甲单脒农药的降解代谢，产生的酶主要分布于细胞壁和细胞膜 组分；有的是诱导酶系，由于降解酶往往比产生该类酶的微生物菌体更能忍受异
常环境条件，酶的降解效率远高于微生物本身，特别是对低浓度的农药，利用降解酶作
为净
化农药污染的有效手段。现在试验已经证明，编码合成这些酶系的基因多数在质粒上，如2，4 一 D农药的生物降解，即由质粒携带的基因所控制。通过质粒上的基因与染色体上的基因的共同作用，在微生物体内把农药降解。
[0006]本发明的另一个目的是提供上述农药残留降解微生物复合菌的生产方法。
[0007]本发明的目的是通过下列技术措施实现的:
一种农药残留降解复合菌，该复合菌各组分微生物在微生物总质量中的质量百分比为:枯草芽孢菌30~40%，地衣芽孢杆菌30~40%，放线菌10~20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10~20%。具体产品中所述个微生物组分之和为100%。
[0008]上述的一种农药残留降解复合菌，每克或没ml该微生物复合菌中菌含量不低于
6.0X IO8CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶海量不低于200U.上述的一种农药残留降解复合菌的制备方法，该方法是将各组分微生物分别培养再按一定比例混合制成微生物复合菌
所述的农药残留降解复合菌的制备方法，包括下述步骤:
a.一级种子液的制备:分别将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化产碱杆菌菌种接种到无菌的Ph7.0~7.5的营养肉汤中，放线菌接种在灭菌的淀粉液体培养基中，30 ~37
0C，150~200rpm，过夜培养；光合细菌在光合细菌液体培养基中，30~37°C，光照培养4~7
天，光照强度1000~2000LX，获得各菌种的一级种子液；
b.二级种子液发酵:分别将步骤a所培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化产碱杆菌、放线菌一级种子液按发酵罐体积10~15%的接种量接入发酵罐，培养基同步骤a所用，30~37°C，150~200rpm，通入经0.45 μ m滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积0.5-1倍/min,压力在0.1~IMPa,发酵12~18小时；
c.生产液发酵:分别将二级种子液打入发酵罐中，培养基同步a所用，接种量为发酵罐体积的8-12%，30~37°C，150~200rpm，通入经0.45 μ m滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积0.8-1倍/min，压力在0.5~1.0MPa,发酵24~36小时；光合细菌直接将一级种子液接种到透明的装有光合细菌液体培养基的发酵罐中，接种量为发酵罐体积的8~12%，30~37°C，光照培养4-7天，光照强度1000-2000LX ；
d.单独发酵完成后将发酵液装入贮液罐，按照各组分微生物在微生物总质量的质量百分比取枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌30%~40%，放线菌10~20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10~20%混合制成液体微生物复合菌剂；
所述的一种农药残留降解复合菌的制备方法，步骤d中液体微生物复合菌剂的菌含量 不低于6.0X108CFU/ml，蛋白酶活性不低于300U/ml，淀粉酶海量不低于200U/ml。
[0009]本发明有益效果:
采用本发明获得农药残留降解复合菌有以下优点:
I)所使用的微生物能够产生生物活性酶
通过现代微生物分离技术、分子生物学技术和酶工程技术筛选能过产生蛋白酶、淀粉
酶 的菌株作为农药残留降解微生物复合菌的目的菌，这些菌能够产生大量的蛋白酶、淀粉酶.蛋白酶的含量不低于300U/g或者300U/ml，淀粉酶不低于200U/g或者200U/ml.这些酶能够有效的对农药产生酶促反应2)所使用的微生物以异养菌为主
不同的微生物繁殖方式和吸取营养的途径不同，就直接导致它们的繁殖速度不同，差异十分巨大，所选微生物为异养菌，因此进入环境后，只要营养充足就能快速繁殖，通过人工投放以后能迅速形成优势菌群。
[0010]3)所使用的微生物还能产生抗生素样物质
所选用的微 生物如芽孢杆菌、放线菌能产生抗生素样物质，对致病菌有抑制作用，从而减少其它致病菌在土壤.农作物.水体和空气中的繁殖数量
4)所选用的微生物为多种微生物的混合体，它们具有较强的针对性和组合能力，在载体中不互相排斥，在环境中相互协调，效果明显提高。使用时不需要复杂的工程.工艺，对作物和土壤喷雾方式施用，使用方便
本发明所选用的菌株特性及功能如下:
I)枯草芽孢杆菌:能产生蛋白酶、淀粉酶以及枯草杆菌素。
[0011]2)地衣芽孢杆:细菌的繁殖充分的利用土壤和空气中的氮.磷.氨氮.硫化氢等营养物质，耐高温，同时能产生蛋白酶、杆菌肽等。
[0012]3)放线菌:充分的利用粪便.污水和空气中的氮.磷.氨氮.硫化氢等作为自身繁殖的营养物质，同时能够生长抗生素类物质，抑制其它致病菌的生长繁殖，但对其它五种菌不会产生抑制作用
4)反硝化产碱杆菌:通过实验表明，该菌种对六六六农药有降解作用，而六六六农药的自然降解需要三十年时间，而通过人工在单位面积制造工程菌，提高单位面积菌种的含量，就会加速农药的降解
5)光合细菌:能利用粪便尿液中的氨氮.硫化氢等作为自身繁殖的营养物质，从而有效降解粪便.尿液和空气中的氨氮、硫化氢等恶臭气体
6)所选菌种属于农业部318公告范围，对人.畜，农作物和环境没有伤害，没有二次污
染
7)以上菌种均可以市购或从各保藏单位获得 复合菌的【具体实施方式】
一。施用时间:
1.在施用农药一周后，复合菌按照1:5的比例稀释，然后用喷雾器对作物和土壤进行均匀喷雾。每亩复合菌用量在五公斤
2.在农作物收获后，土地整理后，对土壤进行喷洒，亩用三公斤复合菌
3.在冬季温度低于10度或夏天室外气温达到40度时，不能施用菌种
4.全年施用复合菌亩用8公斤，在农药残留较重的区域可以加大用量 实施案例:
1.实施地点:四川省都江堰市
2.用户情况介绍:都江堰市猕猴桃种植户
作为都江堰市特色优势产业之一，猕猴桃产业也成为了农户增收致富的一个重要途径。目前，都江堰市共有猕猴桃种植面积约12万亩，挂果面积近7万亩，2011年产量达2.65万吨，产值超过2亿元。全市已有10家专业从事猕猴桃生产和销售的企业，12家猕猴桃专合组织，并建设了猕猴桃气调保鲜库近I万吨，一般性冷藏库约5000吨，有效增加了猕猴桃产业附加值，延长了产业链条。成功入选2008“奥运推荐果品”，远销日本、韩国、美国、欧盟等十多个国家和地区。都江堰也发展成为了全国最大的海沃特猕猴桃生产出口基地
为了保护都江堰猕猴桃品牌形象，都江堰市还制定并实施了《都江堰猕猴桃品牌保护工作方案》，即统一生产管理技术和标准；已有四个专业合作社进行了有机食品认证。
[0013]3.实验经过:
通过市科技局科技计划立项，2011年开始，猕猴桃协会组织三个乡镇的部分种植户农药残留降解实验，通过市土肥站的每次使用后监测，通过使用复合菌以后，在使用农药后的七天使用后，在经过五天左右(视天气情况)，在作物表面基本上检测不到药物残留。特别是在猕猴桃采摘前一个月，复合菌按照1:10的比例稀释，对猕猴桃果子喷雾，完全降解了猕猴桃表面因空气污染造成的药物残留，并对预防细菌性病变有很好的防止效果。
[0014]通过以上实验证明复合菌在农药残留降解方面技术的可靠性。
【权利要求】
1.一种农药残留降解复合菌，其特征在于该复合菌各组微生物在微生物总质量中的质量百分比为:枯草芽孢杆菌30%~40%，地衣芽孢杆菌30%~40%，放线菌10%~20%，反硝化细菌10%~20%，光合细菌10%~20%。
2.根据权利要求1所述的一种农药残留降解复合菌，其特征在于每克或每ml该微生物复合菌中菌含量不低于8.0X 108CFU,蛋白酶活性不低于300U，淀粉酶含量不低于150U。
3.如权利要求1或2所述的农药残留降解复合菌的制备方法，其特征在于该方法是将各组微生物分别培养再按一定比例混合制成微生物复合菌。
4.根据权利要求3所述的一种农药残留降解复合菌的制备方法，其特征在于它包含下述步骤:
a.一级种子液的制备:分别将活化的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化产碱杆菌菌种接种到无菌的PH7.0-7.5的营养肉汤中，放线菌接种在灭菌的淀粉液体培养基中，3(T37°C，150-200rpm，过夜培养；光合细菌在光合细菌液体培养基中，30-37°C，光照培养4-7天，光照强度1000-2000LX ;获得各菌种的一级种子液；
b.二级种子液发酵:分别将步骤a所培养的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、反硝化产碱杆菌、放线菌一级种子液按发酵罐体积10-15%的接种量接入发酵罐，培养基同步骤a所用，30^370C，150-200rpm，通入经0.45 μ m滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积的0.5-1倍min，压力0.1~1MPa，发酵12~18小时；
c.生产液发酵:分别将二级种子液打入发酵罐中，培养基同步骤所用，接种量为发酵罐体积的8-12%，30^37 0C，150-200rpm，通入经0.45 μ m滤膜过滤的过滤空气，通气量为发酵罐体积的0.8-1倍min，压力0.5~1.0MPa,发酵24~36小时；光合细菌直接将一级种子液接种到透明的装有光合细菌液体培养基的发酵罐中，接种量为发酵罐体积的8-12%，30~37°C，光照培养4-7天，光照强度1000-2000LX ； d.单独发酵完成后将发酵液装入贮液獾，按照各组分微生物在微生物总质量中质量百分比取枯草芽孢杆菌30~40%，地衣芽孢杆菌30~40%，放线菌10~20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10-20%混合制成液微生物复合菌； 或者将单独发酵的发酵液通过离心或者加载体吸附，形成固体，按照各组分微生物在微生物总质量中的质量百分比取枯草芽孢杆菌30-40%，地衣芽孢杆菌30-40%，放线菌10~20%，反硝化细菌10~20%，光合细菌10~20%混合制成固体微生物复合菌。
5.根据权利要求4所述的一种农药残留降解复合菌的制备方法，，其特征在于步骤d中液体微生物复合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / ml，淀粉酶含量不低于200U / ml ;固体微生物复合菌的菌含量不低于6.0X IO8CFU / g，蛋白酶活性不低于300U / g，蛋白酶含量不低于200 U/ml。
【文档编号】C12N1/20GK103966113SQ201310033585
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2013年1月29日
【发明者】李朝均 申请人:都江堰惠农生物技术有限责任公司