本发明属于残余石油利用
技术领域：
，具体涉及一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法。
背景技术：
：对老油田进行深度开发，提高石油采收率已成为当前老油田开发的中心任务。现有提高采收率的技术存在的主要问题是提高幅度有限，大量的残余石油滞留地下。而怎样利用大量残存在油藏中的石油又成为一项重要课题。通过微生物降解石油产甲烷，从而对残余石油进行利用，成为一条有效途径。微生物厌氧降解石油产甲烷过程是多种菌群参与的多步骤反应，在整个降解过程中，影响反应速率的因素非常多。油藏中的实验也证实了在有机质(特别是残余石油)降解过程中，公认的降解终端产物是甲烷，而电子受体耗尽是甲烷产生的基础，具体来说产甲烷古菌和其它功能菌群协同作用，最终使残余石油得到降解并产生甲烷。而地质学的研究也表明，在数千年来，油藏内部一直自发进行着微生物降解石油产甲烷，因为地球内部的厌氧环境有利于这一过程的进行。有研究表明：油藏中的微生物群体是由微好氧菌群和兼性厌氧型以及严格厌氧型细菌组成的，烃类提供了它们存活的基础条件，其可能原因是随着油藏的开采，会大量注入水和其它物质，这改变了油藏本来的环境。目前，还没有一种简单有效的，筛选厌氧降解石油烃产甲烷菌群的方法出现。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，所述筛选方法本发明以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群，本发明同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物。本发明的技术方案是，一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，包括以下步骤：s1、取样：分别从油田的不同区域采集油田采出液和含油污泥，作为样品；s2、厌氧培养：将所述油田采集液和含油污泥分别按照厌氧条件培养；s3、培养结果测定：一段时间后，测量油田采出液和含油污泥的甲烷产量；s4：菌种混合：筛选油田采集液中产气量大于0.4μmol/d和含油污泥中产气量大于1.15μmol/d的样品，取培养液分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，并将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液进行混合，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。本发明以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群，本发明同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物。再使用所述混合物或从中提取出菌群，进行石油烃的厌氧降解以产生甲烷。为保证样品质量和多样性，优选的，步骤s1中，所述油田采出液的原油密度为0.87-0.93g/cm3，原油粘度为61.6-169.3mpas，采集所述油田采出液后，使用氮气密封保存；取距地面30cm以下被石油污染的含油率为5.8-11.3％的含油污泥，取样后在-5℃下厌氧保存。在油田的不同区域采集油田采出液或含油污泥，并将不同的样品分别按照厌氧条件培养；厌氧培养为：取30-40g的油田采出液或含油污泥，和60ml无机盐富集培养基充入到120ml无菌瓶中，30℃下富集培养直到培养瓶中能检测到稳定的甲烷产量，培养结束。本发明中，使用的所述无机盐富集培养基的成分及含量为：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述无机盐富集培养基能够满足菌群生长的需要，保证菌群的正常生长。为使菌群生长的更好，优选的，所述无机盐富集培养基中还包括维生素水溶液5ml，所述维生素水溶液中维生素的成分及浓度为：维生素h2.0mg/l，维生素b92.0mg/l，维生素b610mg/l，维生素b15.0mg/l，维生素b25.0mg/l，维生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。进一步的，所述无机盐富集培养基中还包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及浓度为：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化钴0.1g/l，无水氯化锰0.1g/l，氯化亚铁0.1g/l，六水氯化钴0.18g/l，氯化锌0.1g/l，五水硫酸铜0.01g/l，十二水硫酸铝钾0.02g/l，硼酸0.01g/l，两水钼酸钠0.01g/l和六水氯化镍0.025g/l。所述无机盐富集培养基的配制方法为：将培养基中除刃天青、维生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他组分混合，加热煮沸的同时不断通入氮气，直到培养基由粉色变为无色，停止加热，待体系冷却后，加入维生素水溶液和微量元素水溶液，灭菌后加入最终质量比为0.03％的九水硫化钠、最终质量比为0.02％的碳酸氢钠，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要现用现配。由于含油污泥的粘度和浓度较大，为便于后续的厌氧培养，优选的，在对所述含油污泥进行厌氧培养之前，向所述含油污泥中加入10倍重量的无机盐富集培养基进行初级培养6-8小时，初级培养结束后取上清液继续进行厌氧培养。本发明中，使用色谱仪对生成的甲烷产量进行测定，其中fid的温度为200℃，气化进样器的温度为150℃；色谱柱的初温为35℃，保持15min后以5℃/min的升温速度升温至200℃，并保持5min，取样时使用气体收集器从样品上方收集气体，然后再用密封注射器取样和进样，进样体积为0.3ml。为了验证最终产生的气体为油田采集液或含油污泥中的菌群产生，优选的，所述筛选方法还包括使用灭菌组对培养结果进行验证：使用灭菌后的样品按照所述厌氧条件培养，若最终灭菌后的样品经厌氧条件培养后无甲烷产生，则证明甲烷气体由样品中的菌群产生。如果若最终灭菌后的样品经厌氧条件培养后有甲烷产生，则证明甲烷气体不全由样品中的菌群产生，此时需要重新采用，重复以上步骤，以得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。本发明的有益效果为：所述筛选方法本发明以油田采出液和含油污泥作为样品，对其中的菌群进行厌氧培养，在不加入碳源的情况下，菌群只能利用石油烃作为碳源，进而培育筛选出能够利用石油烃作为碳源的菌群，同时为了得到适应性更强的降解石油烃混合菌群，本发明同时使用油田采出液和含油污泥作为样品，并根据油田采出液和含油污泥中菌群的不同属性分别筛选出产气量大于0.4μmol/d和1.15μmol/d的样品，进而将其混合，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。实施例一种厌氧降解石油烃产甲烷菌群的筛选方法，包括以下步骤：s1、取样：分别从油田的不同区域采集油田采出液和含油污泥，作为样品；本步骤中，采集某油田区块的六口油井采出液调研取样，将数个塑料桶装满(约5l)，取样之前通入氮气密封，取样后迅速运回实验室，低温保存，编号为yh1-yh6；取4份距地面30cm以下被石油污染的含油率为5.8-11.3％的含油污泥，取样后在-5℃下厌氧保存，分别编号为th1-th6；其中，yh1-yh6的理化性质如表1所示。表1：yh1-yh6的理化性质附注1：yh代表厌氧培养油田采出液，后面的编号为取样地油井编号s2、厌氧培养：将所述油田采集液和含油污泥分别按照厌氧条件培养；将不同的样品分别按照厌氧条件培养，厌氧培养为：取30-40g的油田采出液或含油污泥，和60ml无机盐富集培养基充入到120ml无菌瓶中，30℃下富集培养直到培养瓶中能检测到稳定的甲烷产量，培养结束。使用的所述无机盐富集培养基的成分及含量为：kh2po45.0g，k2hpo45.0g，nh4cl5.0g，nacl1.0g，mgcl22.0g，cacl20.1g，酵母粉0.5g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，硫酸亚铁铵0.5g和刃天青1.0mg，加水定容至1l。所述无机盐富集培养基中还包括维生素水溶液5ml，所述维生素水溶液中维生素的成分及浓度为：维生素h2.0mg/l，维生素b92.0mg/l，维生素b610mg/l，维生素b15.0mg/l，维生素b25.0mg/l，维生素b120.1mg/l，硫辛酸5.0mg/l。所述无机盐富集培养基中还包括微量元素水溶液5ml，所述微量元素水溶液中的成分及浓度为：次氮基三乙酸1.5g/l，氯化钴0.1g/l，无水氯化锰0.1g/l，氯化亚铁0.1g/l，六水氯化钴0.18g/l，氯化锌0.1g/l，五水硫酸铜0.01g/l，十二水硫酸铝钾0.02g/l，硼酸0.01g/l，两水钼酸钠0.01g/l和六水氯化镍0.025g/l。将培养基中除刃天青、维生素水溶液和微量元素水溶液之外的其他组分混合，加热煮沸的同时不断通入氮气，直到培养基由粉色变为无色，停止加热，待体系冷却后，加入维生素水溶液和微量元素水溶液，灭菌后加入最终质量比为0.03％的九水硫化钠、最终质量比为0.02％的碳酸氢钠，以及刃天青，密封保存。其中，刃天青需要现用现配。由于含油污泥的粘度和浓度较大，为便于后续的厌氧培养，在对所述含油污泥进行厌氧培养之前，向所述含油污泥中加入10倍重量的无机盐富集培养基进行初级培养6-8小时，初级培养结束后取上清液继续进行厌氧培养。s3、培养结果测定：培养400天后，测量油田采出液和含油污泥的甲烷产量；本发明中，使用色谱仪对生成的甲烷产量进行测定，其中fid的温度为200℃，气化进样器的温度为150℃；色谱柱的初温为35℃，保持15min后以5℃/min的升温速度升温至200℃，并保持5min，取样时使用气体收集器从样品上方收集气体，然后再用密封注射器取样和进样，进样体积为0.3ml。具体来说，本实施例中甲烷的产气测定的具体操作为：气体组分：安捷伦气相色谱仪。检测器：fid200℃；气化进样器150℃；色谱柱：pona弹性石英毛细柱(50m×0.2mm×0.5μm)；柱温：初温35℃，15min；5℃/min升温至200℃，5min。取样时先用气体收集器从上方收集气体，然后再用密封注射器取样，进样体积：0.3ml，将标准气体用高纯氮气稀释成不同浓度，在上述条件下进行分析，修正的面积归一法定量气体含量。本实施例中，各样品的产气量详见表2所示表2：各样品的产气量结果表样品编号yh1yh2yh3yh4yh5yh6产气量(μmol)70.599.261.7108.3246.90样品编号th1th2th3th4th5th6产气量(μmol)68.546625.692.560.730.8s4：菌种混合：筛选油田采集液中产气量大于0.4μmol/d和含油污泥中产气量大于1.15μmol/d的样品，取培养液分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，并将最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液进行混合，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。从表2中能够得知，yh5和th2符合要求，所以yh5和th2分别作为最优油田采集液培养液和最优含油污泥培养液，将yh5和th2的培养液进行混合，即得到含有降解石油烃混合菌群的混合物。需要说明的是，yh6中未检出甲烷生成，可能的原因是本实施例采用厌氧培养，而yh6中可能含有好氧菌，本实施例并未对yh6进行灭菌处理。为了验证最终产生的气体为油田采集液或含油污泥中的菌群产生，所述筛选方法还包括使用灭菌组对培养结果进行验证：使用灭菌后的样品按照所述厌氧条件培养，结果发现，无论是油田采集液还是含油污泥，其最终产生的甲烷的量均为0，由此能够得出，本实施例中，甲烷气体均由样品中的菌群产生，并且使用本实施例中的方法，得到能够降解石油烃混合菌群的混合物。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12