一种同时检测多种紫杉烷类的方法与流程

本发明属于采用仪器对化学成分进行检测技术领域，涉及一种对多种紫杉烷类同时检测的方法。

背景技术：

紫杉烷类化合物是从植物中得到的一大类天然产物，是一组具有三环五甲基十五碳烯骨架的而萜类小分子活性物质群，包括紫杉醇(Taxol)、以及它们的半合成前体10-脱乙酰巴卡亭III（10-DAB）和巴卡亭III（BAT III）等，它们是红豆杉属植物特有的次生代谢成分。紫杉烷类中最有名的物质是紫杉醇，已于1992年美国FDA批准用于治疗卵巢癌，2011年紫杉醇制剂的国际市场销售额为37亿美元，是目前癌症治疗领域的主要药物。随着人们对紫杉烷类物质的关注，现已从各种红豆杉植物和细胞培养物中发现了400多种紫杉烷。各种紫杉烷的生物和药用特征不同或强弱各异，取决于红豆杉的数量及分布，及其生长环境和生态基础，因此，同时检测生物样品中主要的紫杉烷，了解紫杉烷的分布特性和代谢规律，不仅有利于探明紫杉醇的制药资源，而且有助于揭示各种紫杉烷类在红豆杉体内的生理调控机制以及它们之间的关系和相互作用。

目前在紫杉烷类的同时检测过程中，《中国红豆杉中多种紫杉烷同时检测的液质联用方法的建立》《HPLC法测定不同部位南方红豆杉中紫杉烷类化合物的含量》等文献采用的有机试剂种类和用量均较多，检测成本比较高，最低检测限浓度较高，不能同时对低浓度的紫杉烷类进行检测。

技术实现要素：

本发明旨在解决对10-DAB、BAT III和Taxol等多种紫杉烷类同时检测技术问题，与现有检测方法的不同，在于只选择了乙腈和水作为流动相，并且优化了流动相洗脱梯度方法，缩短了紫杉烷类的检测时间，同时降低了最低检测限浓度。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种同时检测多种紫杉烷类的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）采用乙醇、甲醇或乙腈，配制不同浓度的10-DAB、BAT III和Taxol的标准品溶液，浓度范围为0.2 μg/ml~1 mg/ml，然后经 0.22或0.45 μm过滤膜过滤，或10000~12000 rpm离心处理，作为检测标准品；

（2）检测仪器：Waters ACQUITY-UPLC，色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱温：20~50℃，流速：0.1~1.0 ml/min，样品池温度：5~20℃，进样量1~20 μl，每个样品运行时间为8~16 min，其流动相配制和流动相梯度洗脱条件如下：

流动相A：色谱乙腈

流动相B：含有0~10%（v/v）色谱乙腈的超纯水

流动相梯度洗脱条件如表1 所示：

表1流动相洗脱条件设置

本发明所描述的方法适用于其它多种紫杉烷类的同时检测，例如DAB-I，BAT VI，三尖杉宁碱等。

本发明进一步公开了多种紫杉烷类同时检测的方法在用于紫杉烷类10-DAB、BAT III和Taxol同时检测方面的应用。主要指的是同时降低了紫杉烷类10-DAB、BAT III和Taxol最低检测限浓度。其中10-DAB、BAT III和Taxol的最低检测浓度分别低于为0.14 µg/ml、0.13 µg/ml和0.07 µg/ml。

本发明的方法可以实现对紫杉烷类10-DAB、BAT III和Taxol的同时检测，减少流动相使用的有机试剂种类，缩短检测时间和降低最低检测限浓度：减少流动相中有机试剂的使用，在此方法中，只有有机试剂乙腈的使用；缩短同时对紫杉烷类Taxol、BAT III和10-DAB进行检测的时间。

本发明中10-DAB、BAT III和Taxol的保留时间分别为3.753 min、5.578 min和8.767 min；降低对紫杉烷类Taxol、BAT III和10-DAB的最低检测浓度。此方法下，10-DAB、BAT III和Taxol的最低检测浓度分别低于0.14 µg/ml、0.13 µg/ml和0.07 µg/ml。

本发明对多种紫杉烷类同时检测的方法重点考察了流动相的选择，最终选择了乙腈和水，减少有机试剂的使用，减少污染。

本发明对多种紫杉烷类同时检测时的流动相梯度洗脱条件进行了摸索，最终提高Taxol、BAT III和10-DAB的分离度，降低保留时间，缩短检测时间；

本发明对多种紫杉烷类同时检测时的检测装置和检测器进行了选择，最终选择了 Waters UPLC和PDA检测器，能够降低最低检测限浓度，拓宽方法学的适用浓度范围；

本发明可以提高多种紫杉烷类同时检测的分离度，缩短紫杉烷类的保留时间，效率有很大的提高；在本发明中，配制10-DAB、BAT III和Taxol标准品的浓度分别为16.62、16.83和17.17 µg/ml，然后经0.22 μm针式滤头过滤，得到检测样品A。

本发明中，检测仪器：Waters ACQUITY-UPLC，色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱温：50℃，流速：0.5 ml/min，样品池温度：10 ℃，进样量1 μl，每个样品运行时间为14 min，流动相A为色谱乙腈，流动相B为含有8%（v/v）色谱乙腈的超纯水，其流动相配置和流动相梯度洗脱条件如表2所示：

表2 流动相梯度洗脱条件设置

对检测样品A按照如上方法进行检测，得到检测样品A的色谱图，如图1所示。

本发明公开的对多种紫杉烷类同时检测的方法与现有方案所不同的关键点在于：

（1）本发明采用UPLC对10-DAB、BAT III和Taxol同时检测，所使用的流动相试剂、梯度洗脱方法、分离柱类型、柱温、检测池温度和流动相流速，并且该方法对其它多种紫杉烷类的同时检测。具有缩短10-DAB、BAT III和Taxol等紫杉烷类的检测时间；减少检测过程中使用的有机试剂种类和用量的特点。

（2）本发明的检测方法具有降低紫杉烷类10-DAB、BAT III和Taxol的最低检测限浓度的特点，根据信噪比S/N>3确定最低检测限，本发明中10-DAB、BAT III和Taxol的最低检测浓度分别低于为0.14 µg/ml、0.13 µg/ml和0.07 µg/ml。

表3 信噪比和最低检测限数据：

附图说明:

图1为10-DAB、BAT III和Taxol三种紫杉烷类的色谱图；

图2 为10-DAB、BAT III和Taxol三种紫杉烷类的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。

实施例1：

本发明通过乙醇配置不同浓度的10-DAB、BAT III和Taxol的标准品溶液, 20 μm过滤膜过滤，检测仪器：Waters ACQUITY UPLC，色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.1 x 100 mm，2.7 μm，柱温：40℃，流速：0.5 ml/min，样品池温度：10℃，设置流动相梯度如表4所示，在此条件下得到标准品的分离色谱图，如图2所示：

表4 流动相梯度洗脱条件设置：

实施例2：

在实施例1所述的方法进行10-DAB、BAT III和Taxol三种紫杉烷类标准品检测，得到相关的方法学数据如表5所示：

表5 10-DAB、BAT III和Taxol三种紫杉烷类的方法学数据：

实施例3

本发明与目前HPLC检测方法相比较，能够明显地缩短检测时间，降低最低检测限度浓度，对比结果如表6所示：

表6 常规HPLC方法与本发明相比较：

结果表明，使用HPLC或者ES-MS对紫杉烷类进行检测时，检测时间均较长，目前检测手段中紫杉醇的保留时间大于20 min，采用此方法后，紫杉烷类的分离度提高，紫杉醇的保留时间缩短至8.8 min，效率提高50% 以上，同时可以降低最低检测限浓度。