一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一株生物合成蒜糖醇的大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法与应用，公开了一株大肠埃希氏菌重组菌株strainII。实验证明，利用该菌株的静息细胞反应可以将D-果糖转化为蒜糖醇，该稀少糖醇在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
【专利说明】一株生物转化生产蒜糖醇的大肠杆菌工程菌株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说是涉及利用基因工程技术和微生物学方法制备的一株大肠埃希氏菌工程菌株及其构建方法，以及将其用于转化生产蒜糖醇中的应用。
【背景技术】
[0002]稀少糖(Rare Sugar)是自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物(2002年国际稀少糖学会ISRS定义)，其味道类似于蔗糖，但具有热量低、稳定性高、甜味协调、无吸湿性、无致龋齿性、耐受性高等优点，对改善特殊人群的饮食起到重要作用。另外，大量研究结果还表明稀少糖在抗癌、清除自由基、神经保护等诸多方面发挥着重要的生理活性作用，还可和蛋白及多肽等活性物质发生美拉德反应从而优化其功能活性(Zeng Y, Zhang X，Guan Y， Sun Y.Characteristics and antioxidant activity of Maillard reactionproducts from psicose-lysine and fruetose-lysine model systems.J Food Sc1.2011，76 (3):C398_403 ;Sun Y，Hayakawa S，Ogawa M，Fukada K，Izumori K.1nfluenceof a rare sugar, d—Psicose， on the physicochemical and functional propertiesof an aerated food system containing egg albumen.J Agric Food Chem.2008，56(12):4789-4796.)。功能性稀少糖具有独特的生物学活性，市场开发潜力较大。
[0003]蒜糖醇(allitol)是一种六碳稀少糖醇，具有一定的降血糖功能，而且降糖过程缓慢平稳，即使大量服用也不 会发生低血糖危险，服用安全，可用于制备治疗糖尿病药物；另外，蒜糖醇具有对称性，可以作为D-型和L-型六碳稀少糖相互转化的连接中心。因此，蒜糖醇不仅可用于甜味剂、保健品、降糖药物，还可以用来生产其它稀少己糖。
[0004]目前，蒜糖醇的生产方式主要是提取法和化学转化法，生产效率低，成本高。日本的研究学者何森健(Izumori Ken)教授建立的Izumoring策略为稀少糖的生物转化提供了一条新的途径(Izumori K.1zumoring: a strategy for bioproduction of all hexoses.J Biotechnol.2006, 124 (4): 717-722)。研究发现，某些微生物可以实现D-阿洛酮糖和蒜糖醇之间的相互转化，如集聚肠杆菌.agglomerans 221e (MuniruzzamanS， Tokunaga H, Izumori K.Conversion of D-psicose to allitol by Enterobacteragglomerans strain 221e.J Ferment BioengVolume.1995, 79 (4): 323-327),该文献报道了以D-阿洛酮糖为底物转化生产蒜糖醇，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其他副产物；又如产气肠杆菌aerogenesIK7(GullapalIi P, Takata G, Poonperm ff, Rao D, Morimoto K, Akimitsu K, Tajima S，Izumori K.Bioproduction of D-psicose from allitol with Enterobacter aerogenesIK7: a new frontier in rare ketose production.Biosci Biotechnol Biochem.2007,71 (12):3048-3054),该文献只报道了以蒜糖醇为底物转化生产D-阿洛酮糖，国内尚未有相关报道。国外的主要专利有:
[I]Ikumori Takeshi, Tsuzaki keij1.Ribitol dehydrogenase and its productionand use.Japan, JP19940218155, 1994-08-20.该专利公开了利用产气肠杆菌如^/^<3<^6?/.aerogenes IK7生产1_脱氧_L_阿洛酮糖和1_脱氧_L_果糖等脱氧稀少糖的方法，但是没有涉及生广蒜糖醇的方法。
[0005][2]Izumori Ken, Morimoto Kenji, Takata Goro, Tokuda Masaaki, TsujisakaYoshio, Takeshita Kei, Tsusaki Keiji, Okuma Kazuhir0.Microorganism withability to produce deoxy polyol dehydrogenase and use thereof.Japan,JP20060313672, 2006-11-20.该专利公开了利用集聚肠杆菌Enterobacter agglomerans 221e的氧化和还原作用分别生产多种稀少糖和糖醇的方法，但该菌底物特异性较差，如以D-果糖和D-阿洛酮糖混合物进行转化可能生成其它副产物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一株用于转化生产蒜糖醇的大肠埃希氏菌(BscherichiaCoIi)工程菌株。
[0007]本发明所提供的大肠埃希氏菌{Escherichia coif)工程菌株的名称为strainII，该菌株已于2014年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为CGMCC N0.9024。
[0008]本发明另一目 的在于提供一种构建大肠埃希氏菌(Bscherichia coif)工程菌株strain II CGMCC N0.9024的方法，包括以下步骤:
(I)PCR扩增来源于瘤胃菌sp.)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因(办￡0，连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体pET-obe ；PCR扩增来源于产酸克雷伯硫Uilebsiellei oxytoca) CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因Crt/A)和来源于念珠菌{Candida me thyli ca ) X81129的甲酸脱氢酶基因(Λ/A),连接到载体pCDFDuetTM-l上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体釋-rdh-fdh ；PCR扩增来源于运动发酵单孢菌(办?offlmassubsp.?9/^7Υ.5)ΖΜ4的葡萄糖转运蛋白基因
(^//)，连接到PACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-^7八
[0009](2)向大肠埃希氏菌BL21 star中导入D-阿洛酮糖3_差向异构酶的表达载体pET-办e、核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCW-rdh-fdh和葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-g7/,得到重组大肠埃希氏菌strain II。
[0010]本发明还一目的在于提供所述大肠埃希氏菌(Bscherichia coif)工程菌株strain II CGMCC N0.9024在转化生产蒜糖醇中的应用。
[0011]具体的，将大肠埃希氏菌{Escherichia coli )工程菌株strain II CGMCCN0.9024重悬于Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，制备成细胞浓度达到0D_=40-80 (优选为60)的静息细胞溶液；然后使用D-果糖作为底物，底物浓度为5-15% (优选为10%，质量/体积百分浓度)，在30-45°C (优选为42°C)、pH 6.0-8.0 (优选为7.0)、厌氧条件下反应12-18h (优选为15h)，将底物转化为蒜糖醇。
[0012]采用以上技术方案，本发明提供了一株大肠埃希氏菌工程菌株strain II及其构建方法。实验证明，利用该菌株的静息细胞，可以D-果糖为底物，转化生产蒜糖醇。因此，本发明的大肠埃希氏菌工程菌株strain II可应用于蒜糖醇生产领域，生产的蒜糖醇在食品和医药行业具有广泛的应用前景。
[0013]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为构建大肠埃希氏菌co7i)工程菌株strain II和用其转化生产蒜糖醇的技术路线。
[0015]图2为大肠埃希氏菌工程菌株strainII静息细胞以D-果糖为底物转化生产蒜糖醇最适反应温度的结果。
[0016]图3为大肠埃希氏菌工程菌株strainII静息细胞以D-果糖为底物转化生产蒜糖醇最适反应pH的结果。
[0017]图4为大肠埃希氏菌工程菌株strainII静息细胞以不同浓度D-果糖为底物转化生产蒜糖醇的结果。 【具体实施方式】
[0018]本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
[0019]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook, J., Russell, David ff.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
[0020]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0021]本发明中所用引物由大连宝生物公司合成。
[0022]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0023]实施例1、构建大肠埃希氏菌iBscherichia coli)工程菌株strain II
本发明具体提供一株用于生产蒜糖醇的大肠埃希氏菌iBscherichia coli)工程菌株strain II及其构建方法，其技术路线如图1所示，包括以下三个方面:(I)将来源于瘤胃菌iRuminococcus sp.)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因(<φ--)连接到载体ρΕΤ21上,构建表达载体PET-办e，该基因表达产物可以将D-果糖转化成D-阿洛酮糖；(2)将来源于产酸克雷伯氏菌)CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因(ro%)和来源于念珠菌{Candida methylicam\\29的甲酸脱氢酶基因(Λ*)连接到载体pCDFDuet?-l上，构建双酶表达载体成观—rdh-fdh, rdh基因的表达产物可以将D-阿洛酮糖转化成蒜糖醇，fdh的表达产物作为辅酶再生系统中的关键酶，在其催化甲酸脱氢的同时将NAD+转化成NADHJt为D-阿洛酮糖转化为蒜糖醇反应中的辅酶因子；(3)将来源于运动发酵单孢菌mobilis subsp.mobilis)WA的葡萄糖转运蛋白基因iglf)连接到pACYC184M载体上，构建表达载体pACYC184M-g7/，该基因表达产物可以提高D-果糖转运到细胞内部的速率。
[0024]具体来讲，本发明大肠埃希氏菌(Bscherichia coli)工程菌株strain II的构建方法，包括以下步骤:
(1)利用引物I和引物2PCR扩增来源于瘤胃菌sp.)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因(办e)，连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体pET-办e ;利用引物3和引物4 PCR扩增来源于产酸克雷伯硫(Jlebsielleioxytoca) 的核糖醇脱氢酶基因(《*)，利用引物5和引物6 PCR扩增来源于念珠菌methylica) 的甲酸脱氢酶基因连接到载体pCDFDuet?-l上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCDF-ri/Α-Λ* ;利用引物7和引物8PCR扩增PCR扩增来源于运动发酵单抱菌mobilis subsp.ZM4的葡萄糖转运蛋白基因iglf、，连接到PACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-^7/0引物序列如下:
【权利要求】
1.大肠埃希氏菌{Escherichiacoli )工程菌株strain II,保藏编号为CGMCCN0.9024。
2.—种构建权利要求1所述大肠埃希氏菌{Escherichia coli )工程菌株strain IICGMCC N0.9024的方法，即向大肠埃希氏菌中引入D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因、核糖醇脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和葡萄糖转运蛋白基因，得到重组大肠埃希氏菌，命名为strain II。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于:构建携带D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因、核糖醇脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和葡萄糖转运蛋白基因的重组大肠埃希氏菌strain II的具体方法包括以下步骤: (1)PCR扩增来源于瘤胃菌sp.)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因(办￡0，连接到载体pET-21a上，构建D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体pET-obe ；PCR扩增来源于产酸克雷伯硫Uilebsiellei oxytoca) CGMCC7662的核糖醇脱氢酶基因Crt/A)和来源于念珠菌{Candida me thyli ca ) X81129的甲酸脱氢酶基因(Λ/A),连接到载体pCDFDuetTM-l上，构建核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体釋-rdh-fdh ；PCR扩增来源于运动发酵单孢菌(办?offlmassubsp.?9/^7Υ.5)ΖΜ4的葡萄糖转运蛋白基因(^//)，连接到PACYC184M载体上，构建葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-^// ； (2)向大肠埃希氏菌BL21star中导入D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体pET-办e、核糖醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的双酶表达载体pCW-rdh-fdh和葡萄糖转运蛋白的表达载体pACYC184M-g7/,得到重组大肠埃希氏菌strain II。
4.权利要求1所述大肠埃希氏菌CfocAericAiaco7i)工程菌株strain II CGMCCN0.9024在转化生产蒜糖醇中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于利用大肠埃希氏菌coli)JL程菌株strain II CGMCC N0.9024转化生产蒜糖醇的方法如下: 将大肠埃希氏菌co7i)工程菌株strain II CGMCC N0.9024重悬于Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中，制备成细胞浓度达到0D_=40-80 (优选为60)的静息细胞溶液；然后使用D-果糖作为底物，底物浓度为5-15% (优选为10%，质量/体积百分浓度)，在30-45°C (优选为42°C)、pH 6.0-8.0 (优选为7.0)、厌氧条件下反应12_18h (优选为15h)，将底物转化为蒜糖醇。
6.用权利要求5所述方法得到的蒜糖醇。
7.权利要求6所述蒜糖醇在制备医药品(如糖尿病治疗药物)中的应用。
8.权利要求6所述蒜糖醇在保健品中的应用。
9.权利要求6所述蒜糖醇作为其它稀少糖生产原料的应用。
【文档编号】A61K31/047GK103952358SQ201410186502
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月6日 优先权日:2014年5月6日
【发明者】朱玥明, 李泓漪, 曾艳, 门燕, 孙媛霞 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所