表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制的制作方法

表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制的制作方法【专利摘要】本申请涉及表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中B细胞凋亡的抑制。本发明提供了提高非人转基因动物中的免疫球蛋白表达的新方法。例如，本发明提供了提高经遗传工程改造而表达一个或数个人的或人源化的免疫球蛋白转基因座的动物中的人源化免疫球蛋白生成的方法。这可以通过在动物的B细胞中特异性的过量表达凋亡抑制剂即兔bcl-2（其表达是由B细胞特异性启动子驱动的），由此增强B细胞的存活来进行。本发明进一步涉及用于选择性增强外源B细胞也就是表达任何免疫球蛋白转基因基因座的B细胞的存活胜过不表达转基因基因座的内源B细胞的存活的方法。选择性是通过只在外源B细胞中表达凋亡抑制剂而实现的，就是说，通过将外源免疫球蛋白表达与凋亡抑制剂表达偶联在一起。这后一种方法容许提高转基因所编码的（一种或多种）产物的表达和生成胜过转基因动物内源生成的免疫球蛋白。本发明还提供了新的凋亡抑制剂，兔bcl-2。【专利说明】表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中B细胞凋亡的抑制[0001]本申请是申请日为2006年8月2日、中国申请号为201110333692.8、发明名称为“表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中B细胞凋亡的抑制”的发明申请的分案申请。发明领域[0002]本发明涉及用于增强经历短期淋巴细胞生成(lymphopoiesis)的动物中的B细胞存活的方法。本发明进一步涉及用于增强表达外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座的转基因动物的B细胞存活以提高免疫球蛋白生成的方法。本发明进一步涉及用于选择性增强表达任何免疫球蛋白转基因基因座的外源B细胞的存活胜过不表达转基因基因座的内源B细胞的方法，其通过只在表达转基因所编码的免疫球蛋白的外源B细胞中但不在表达内源免疫球蛋白的B细胞中选择性表达任何凋亡抑制剂来实现。此方法容许提高转基因所编码的(一种或多种)产物的表达和生成胜过转基因动物内源生成的免疫球蛋白。本发明还提供了新的凋亡抑制剂，兔bcl-2。[0003]发明背景[0004]表达人-小鼠嵌合抗体的小鼠的产生记载于Pluschkeetal.,JournalofImmunologicalMethods215:27-37(1998)。表达人免疫球蛋白多肽的小鼠的产生记载于Neubergeretal.,Nature338:350-2(1989);Lonbergetal.,Int.Rev.1mmunol.13(I):65-93(1995);Bruggemannetal.,Curr.0pin.Biotechnol.8(4):455-8(1997)。使用BAC克隆产生转基因小鼠记载于Yangetal.,Nat.Biotechnol.15:859-65(1997)。表达人抗体的牛的产生记载于Kuroiwaetal.,NatureBiotech.20(9):889-894(2002)。[0005]动物中的基因转移(transgenesis)记载于WallRJ,Theriogenology57(I):189-201(2002)。转基因兔的产生记载于FanJetal.,Pathol.1nt.49:583-94(1999);Bremetal.，Mol.Reprod.Dev.44:56-62(1996)。转基因鸡的产生记载于Etchesetal.,MethodsinMolecularBiology62:433-450(1997);Painetal.,CellsTissuesOrgans165(3-4):212-9(1999);Shermanetal.,NatureBiotech.16:1050-1053(1998)。[0006]免疫球蛋白表达受损的兔记载于Chenetal.,J.1mmunol.150:2783-2793(1993);LamoyiEandMageRG,J.Exp.Med.162:1149-1160(1985)。无y球蛋白血症鸡记载于Frommeletal.,J.Tmmuno1.105(I):1-6(1970);Benedictetal.,Adv.Exp.Med.Biol.88(2):197-205(1977)。[0007]自细胞克隆动物记载于T.Wakayamaetal.,Nature394:369-374(1998);J.B.Cibellietal.，Science280:1256-1258(1998);J.B.CibelIietal.,NatureBiotechnology16:642-646(1998);A.E.Schniekeetal.,Science278:2130-2133(1997);K.H.Campbelletal.，Nature380:64-66(1996)。兔的核转移克隆记载于Sticeetal.,BiologyofReproduction39:657-664(1988);Challah-Jacquesetal.,CloningandStemCells8(4):295-299(2003)。[0008]表达人/人源化免疫球蛋白转基因座的非人转基因动物的产生和抗体自此类转基因动物的产生详细记载于PCT出版物WO92/03918、WO02/12437、及美国专利5，545，807、5，814，318和5，570,429。嵌合哺乳动物宿主的同源重组例示于美国专利5，416，260。用于将DNA引入胚胎的方法记载于美国专利5，567，607。胚胎干细胞的维持和扩增记载于美国专利5，453，357。[0009]包含2A肽序列的病毒蛋白质的切割活性记载于Palmenbergetal.,Virologyl90:754-762(1992);Ryanetal.,JGenVirol72:2727-2732(1991);Donnellyetal.,JGenVirol82:1027-1041(2001);Donnellyetal.,JGenVirol82:1013-1025(2001);Szymaczaketal.,NatureBiotech22(5):589-594(2004)。[0010]迄今为止，关于受凋亡抑制剂bcl-2调控的细胞存活机制的相对贡献的研究主要是在小鼠中进行的。bcl-2表达对细胞存活的影响记载于McDonnelletal.,Cell57:79-88,(1989);Strasseretal.,CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunologyl66:175-181，(1990);Knottetal.,Hybridomal5(5):365-371,(1996);Smithetal.,J.Exp.Med.191(3):475-784(2000);Strasseretal.，PNAS88:8661-8665，(1991);Kumaretal.,ImmunologyLetters65:153-159，(1999)。凋亡抑制剂bcl-XL表达对细胞存活的影响记载于Takahashietal.，J.Exp.Med.190(3):399-409(1999)。[0011]B细胞发育诸如持续的和短期的B淋巴细胞生成的机制综述于LanningD,OsborneBA,KnightKL,Immunoglobulingenesandgenerationofantibodyrepertoiresinhighervertebrates:akeyroleofGALT.MolecularBiologyofB-cells.AltFff,HonjoT,NuebergerMS,编，ElsevierLondon,p443(2004);FlajnikMF,Comparativeanalysisofimmunoglobulingenes:surprisesandportents.Nat.Rev.1mmunol.2:688，(2002)。[0012]因为从抗体产量的立场看在体型较大的转基因动物像兔、鸡、绵羊和牛中生产抗体是有利的，所以非常希望创建表达更高量的转基因所编码产物的、B细胞凋亡受到抑制的大型建立者动物。然而，B细胞发育在经历短期淋巴细胞生成的物种(像兔、鸡、绵羊和牛)中相对于特征为持续B淋巴细胞生成的动物(像小鼠)差异显著。如此，不清楚凋亡抑制剂在用于经历短期淋巴细胞生成的动物时是否会获得与更广泛研究的、具有持续B淋巴细胞生成的动物中一样的成功，或者，凋亡抑制剂对抗体产量和/或抗体亲和力的影响会是什么。[0013]发明概述[0014]一方面，本发明提供了一种多肽，其包含新的凋亡抑制剂多肽，也就是SEQIDN0:5的兔bcl-2多肽。在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的SEQIDNO:5的兔bcl-2多肽。在又一个实施方案中，所述异源氨基酸序列是表位序列。在另一个实施方案中，所述异源氨基酸序列是免疫球蛋白序列。在还有一个实施方案中，所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白的Fe区。本发明还提供了一种核苷酸序列，其编码SEQIDNO:5的兔bcl-2多肽。一方面，本发明提供了一种载体、表达盒或转基因表达构建物，其包含编码兔bcl-2多肽的核酸分子。另一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其经过编码SEQIDNO:5的兔bcl-2多肽的核酸序列的转化。又一方面，本发明提供了一种分离的宿主细胞，其经过包含编码兔bcl-2多肽的核酸分子的载体、表达盒或转基因表达构建物的转化。[0015]在有些方面，可以使用任何凋亡抑制剂基因，例如选自下组的凋亡抑制剂:bcl_2、胱天蛋白酶-9-DN突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶-9S、crmA、z-VAD-fmk、z-DEVD-fmk、B-D-fmk、z-YVAD-fmk、Bcl-xL,Mcl-UXIAP,TIAP,KIAP,NAIP,cIAPl、cIAP2、API1、API2、API3、API4、HIAP1、HIAP2、MIHA、MIHB、MIHC、ILP、ILP-2、TLAP、存活蛋白、livin、apollon、BRUCE、MLIAP,SODD和FLIP及其变体。在有些具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂基因可以是哺乳动物的bcl-2基因。在一些优选的实施方案中，所述哺乳动物bcl-2基因选自人bcl-2、小鼠bcl-2和SEQIDNO:5的兔bcl-2。在一个优选的实施方案中，所述bcl_2是SEQIDNO:5的兔bcl-2。[0016]一方面，本发明提供了一种转基因表达构建物，其包含编码凋亡抑制剂的核酸分子，其中所述凋亡抑制剂是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的，如此在B细胞中特异性表达。[0017]另一方面，本发明提供了一种转基因表达构建物，其包含编码融合蛋白的转基因，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点。[0018]本发明进一步提供了用于增强经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中的免疫球蛋白或免疫球蛋白链表达的方法，包括向所述经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中引入至少一种包含凋亡抑制剂转基因的转基因构建物，其中所述凋亡抑制剂转基因是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的，由此携带所述转基因构建物的B细胞的凋亡得到抑制且免疫球蛋白或免疫球蛋白链的生成得到增强。[0019]又一方面，本发明提供了用于增强经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中的免疫球蛋白或免疫球蛋白链表达的方法，进一步包括再向所述转基因动物中引入至少一种编码外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座的转基因。在此方法中，所述两种转基因可以存在于相同的或不同的转基因表达载体上。在后一种情况中，可以同时的或序贯的将所述不同的转基因表达载体引入所述转基因动物。[0020]本发明还提供了用`于选择性增强非人转基因动物的外源B细胞中的外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链表达的方法，包括向所述动物中引入编码融合蛋白的转基因构建物，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点，由此外源B细胞的存活和外源免疫球蛋白的生成得到增强。[0021]在任何方面，任何上文所述转基因构建物或方法中所使用的蛋白酶切割位点选自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的位点。在多个优选的实施方案中，使用的是弗林蛋白酶(furin)切割位点。[0022]在本发明的所有方面，所述B细胞特异性启动子/增强子可以选自⑶19、⑶20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b、mb_l、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白K轻链、免疫球蛋白\轻链和免疫球蛋白J链的启动子/增强子或其修饰形式。在多个具体的实施方案中，所述B细胞特异性启动子/增强子是免疫球蛋白K轻链基因启动子或其修饰形式。[0023]在本发明的所有方面，优选的外源免疫球蛋白/免疫球蛋白链转基因基因座是人/人源化免疫球蛋白重链和/或轻链序列。[0024]在本发明的所有方面，本发明的自身切割肽可以得自病毒的2A/2B或2A样/2B序列。如此，所述病毒可以选自小RNA病毒科、马A型鼻炎病毒(ERAV)科、小RNA病毒样昆虫病毒科和C型轮状病毒科。所述病毒还可以选自口蹄病病毒(FMDV)、马A型鼻炎病毒(ERAV)和Thoseaasigna病毒(TaV)。[0025]在本发明的又一方面，本发明涉及包含上文所述转基因构建物的非人转基因动物。例如，优选将凋亡抑制剂转基因引入经历短期淋巴细胞生成的动物。所述动物包括但不限于兔、鸟类、鸡、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴。所述经历短期淋巴细胞生成的动物可以进一步包含转基因，例如编码免疫球蛋白/免疫球蛋白链转基因的。从另一方面来说，可以将融合蛋白编码转基因引入任何非人动物。[0026]如此，在本发明的多数方面，除非有规定，非人动物选自啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)、兔、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、牛、猪、绵羊、山羊、马、驴和其它牲畜。在本发明的有些方面，所述非人转基因动物可以或是在生命早期基本上停止了通过基因重排进行的抗体多样化，或是在其生命的第一个月里基本上停止了抗体多样化。在一个具体的实施方案中，所述非人转基因动物是兔。[0027]本发明涉及下述各项:[0028]1.一种多肽，其包含SEQIDNO:5的兔bcl-2多肽。[0029]2.项I的多肽，其中所述SEQIDNO:5的bcl_2多肽与异源氨基酸序列融合。[0030]3.项2的多肽，其中所述异源氨基酸序列是表位序列。[0031]4.项2的多肽，其中所述异源氨基酸序列是免疫球蛋白序列。[0032]5.项4的多肽，其中所述免疫球蛋白序列是免疫球蛋白的Fe区。[0033]6.一种分离的核酸分子，其包含编码SEQIDNO:5的兔bcl_2多肽的序列。[0034]7.一种载体、表达盒或转基因表达构建物，其包含项6的核酸分子。[0035]8.项7的转基因表达构建物，其中所述兔bcl-2凋亡抑制剂的表达是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的。[0036]9.项8的转基因表达构建物，其中所述B细胞特异性启动子/增强子选自⑶19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-1、CD79b、mb_l、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白K轻链、免疫球蛋白\轻链和免疫球蛋白J链基因的启动子/增强子或其修饰形式。[0037]10.一种分离的宿主细胞，其是经过项7的载体、表达盒或转基因表达构建物的转化的宿主细胞。[0038]11.用于增强经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中的免疫球蛋白或免疫球蛋白链表达的方法，包括向所述经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中引入至少一种包含凋亡抑制剂转基因的转基因构建物以生成所述转基因动物，其中所述凋亡抑制剂转基因是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的，由此携带所述转基因构建物的B细胞的凋亡得到抑制且免疫球蛋白或免疫球蛋白链的生成得到增强。[0039]12.项11的方法，其中所述转基因动物选自兔、鸟类、鸡、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴。[0040]13.项11的方法，其中所述转基因动物是兔。[0041]14.项11的方法，其中所述B细胞特异性启动子/增强子选自⑶19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-l、CD79b、mb-l、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白K轻链、免疫球蛋白\轻链和免疫球蛋白J链的启动子/增强子或其修饰形式。[0042]15.项11的方法，其中所述凋亡抑制剂选自bcl-2、胱天蛋白酶-9-DN突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶_9S、crmA、z-VAD-fmk>z-DEVD-fmk>B-D-fmk>z-YVAD-fmk>Bc1-Xl>Mcl-l、XIAP、TIAP、KIAP、NAIP、cIAPl、cIAP2、APIl、API2、API3、API4、HIAPl、HIAP2、MIHA、MIHB、MIHC、ILP、ILP-2、TLAP、存活蛋白、livin、apollon、BRUCE、MLIAP、SODD和FLIP及其变体。[0043]16.项11的方法，进一步包括向所述经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中再引入至少一种编码外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座的转基因。[0044]17.项16的方法，其中所述外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链是人的/人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链序列。[0045]18.项17的方法，其中所述外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座与所述凋亡抑制剂转基因存在于相同的转基因表达载体上。[0046]19.项17的方法，其中所述外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座与所述凋亡抑制剂转基因存在于不同的转基因表达载体上。[0047]20.项19的方法，其中同时将每种所述转基因表达载体引入所述转基因动物。[0048]21.项19的方法，其中序贯将每种所述转基因表达载体引入所述转基因动物。[0049]22.一种经历短期淋巴细胞生成的非人转基因动物，其包含至少一种包含凋亡抑制剂转基因的转基因构建物，其中所述凋亡抑制剂转基因是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的。[0050]23.一种经历短期淋巴细胞生成的非人转基因动物，其包含至少一种包含凋亡抑制剂转基因的转基因构建物和至少一个外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座，其中所述凋亡抑制剂转基因是由B细胞特异性启动子/增强子驱动的。[0051]24.项23的非人转基因动物，其中所述外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链是人的/人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链序列。[0052]25.项22或23的非人转基因动物，选自兔、鸟类、鸡、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴。[0053]26.一种转基因表达构建物，其包含编码融合蛋白的转基因，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点。[0054]27.项26的转基因表达构建物，其中所述蛋白酶切割位点选自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的位点。[0055]28.项26的转基因表达构建物，其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。[0056]29.项26的转基因表达构建物，其中所述免疫球蛋白或免疫球蛋白链是人的/人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链。[0057]30.项26的转基因表达构建物，其中所述自身切割肽衍生自病毒的2A/2B或2A样/2B肽。[0058]31.项30的转基因表达构建物,其中所述病毒选自小RNA病毒科、马A型鼻炎病毒(ERAV)科、小RNA病毒样昆虫病毒科和C型轮状病毒科。[0059]32.项31的转基因表达构建物，其中所述病毒选自口蹄病病毒(FMDV)、马A型鼻炎病毒(ERAV)和Thoseaasigna病毒(TaV)。[0060]33.项26的转基因表达构建物，其中所述凋亡抑制剂选自bcl-2、胱天蛋白酶-9-DN突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶-9S、crmA、z-VAD-fmk、z-DEVD-fmk、B-D-fmk、z-YVAD-fmk、Bcl-XL、Mcl-l、XIAP、TIAP、KIAP、NAIP、cIAPl、cIAP2、APIl、API2、API3、API4、111八？1、11^^2、]\0拟、]\0冊、]\011(:、11^、11^-2、1'^^、存活蛋白、1“111、3?011011、8冊。￡、]\^1八？、SODD和FLIP及其变体。[0061]34.项26的转基因表达构建物，其中所述凋亡抑制剂是哺乳动物的bcl-2。[0062]35.项34的转基因表达构建物，其中所述哺乳动物bcl_2选自人的bcl_2、小鼠的bcl-2和兔的bcl-2。[0063]36.一种分离的宿主细胞，其是经过项26的转基因表达构建物的转化的宿主细胞。[0064]37.用于选择性增强非人转基因动物的外源B细胞中的外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链表达的方法，包括向所述动物中引入编码融合蛋白的转基因构建物，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点，由此所述外源B细胞的存活和所述外源免疫球蛋白的生成得到增强。[0065]38.项37的方法，其中所述外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链是人的/人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链。[0066]39.项37的方法，其中所述蛋白酶切割位点选自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的位点。[0067]40.项37的方法，其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。[0068]41.项37的方法，其中所述自身切割肽的基因得自病毒的2A/2B或2A样/2B。[0069]42.项41的方法，其中所述病毒选自小RNA病毒科、马A型鼻炎病毒(ERAV)科、小RNA病毒样昆虫病毒科和C型轮状病毒科。[0070]43.项41的方法，其中所述病毒选自口蹄病病毒(FMDV)、马A型鼻炎病毒(ERAV)和Thoseaasigna病毒(TaV)。[0071]44.项37的方法，其中所述凋亡抑制剂选自bcl-2、胱天蛋白酶-9-DN突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶_9S、crmA、z-VAD-fmk>z-DEVD-fmk>B-D-fmk>z-YVAD-fmk>Bc1-Xl>Mcl-l、XIAP、TIAP、KIAP、NAIP、cIAPl、cIAP2、APIl、API2、API3、API4、HIAPl、HIAP2、MIHA、MIHB、MIHC、ILP、ILP-2、TLAP、存活蛋白、livin、apollon、BRUCE、MLIAP、SODD和FLIP及其变体。[0072]45.项37的方法，其中所述非人转基因动物选自啮齿类动物、灵长类动物、兔、鸟类、牛、猪、绵羊、山羊、马和驴。[0073]46.一种非人转基因动物，其包含至少一种编码融合蛋白的转基因构建物，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点，由此所述融合蛋白得到表达。[0074]47.项46的非人转基因动物，其中所述动物选自啮齿类动物、灵长类动物、兔、鸟类、牛、猪、绵羊、山羊、马和驴。[0075]附图简述[0076]图1显示了兔多肽序列(SEQIDNO:5)与衍生自其它物种的其它bcl_2分子(SEQIDN0S:11-20)的氨基酸比对。[0077]图2:SEQIDN0:1，在kIB细胞特异性启动子控制下的合成人bcl_2凋亡抑制载体。[0078]图3:SEQIDNO:2，编码兔IgG_M2_自身切割肽F2A-人bcl2融合蛋白FRTrpsL-neoFRT的DNA片段。[0079]图4:SEQIDNO:3，侧翼为FRT和FRT2位点、编码rpsL-neo的DNA片段。[0080]图5:SEQIDN0:4，侧翼为FRT和FRT2位点、编码兔IgM_M2_自身切割肽F2A-经过密码子优化的人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0081]图6:SEQIDN0:5，兔bcl-2多肽序列。[0082]图7:SEQIDN0:6，编码兔IgM_M2_自身切割肽F2A-经过密码子优化的人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0083]图8:SEQIDN0:7，编码兔IgM_M2_自身切割肽F2A-人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0084]图9:SEQIDNO:8，编码IgG_M2_自身切割肽F2A-经过密码子优化的人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0085]图10:SEQIDN`0:9，编码兔IgM_M2_弗林蛋白酶切割位点_自身切割肽F2A-人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0086]图11:SEQIDNO:10，编码兔IgG_M2_弗林蛋白酶切割位点-自身切割肽F2A-经过密码子优化的人bcl2融合蛋白的DNA片段。[0087]发明详述[0088]定义[0089]除非另有说明，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版，J.Wiley&Sons(NewYork,NY1994)和March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure第4版,Johnffiley&Sons(NewYork,NY1992)为本领域技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导。[0090]本领域技术人员将认识到与本文所述方法和材料相似或相当的许多方法和材料可用于实施本发明。事实上，本发明绝非限制于所述方法和材料。为本发明目的，下文定义了以下术语。[0091]“B细胞”定义为能够在其生命周期的有些阶段经历免疫球蛋白基因区段重排和表达免疫球蛋白基因的B谱系细胞。这些细胞包括但不限于早期原B细胞(earlypro-B-cell)、晚期原B细胞(latepro-B-cell)、大前B细胞(largepre-B-cell)、小前B细胞(smallpre-Bcell)、未成熟B细胞、成熟B细胞、记忆B细胞、浆细胞等。[0092]“凋亡抑制剂”指其存在或表达在靶细胞中造成凋亡降低的分子或物质，不管潜在的机制是什么。优选的是，凋亡抑制剂使靶细胞的凋亡相对于不存在抑制剂时的凋亡降低至少大约50%、或至少大约60%、或至少大约70%、或至少大约75%、或至少大约80%、或至少大约85%、或至少大约90%、或至少大约95%。[0093]术语“人Ig基因转基因座或基因座或区段”在用于本文时包括人Ig基因基因座或其区段的天然存在序列和人Ig基因基因座或其区段的天然存在序列的简并形式二者，以及编码与人Ig基因基因座或其区段的天然存在序列所编码的多肽基本上相同的多肽序列的合成序列。在此语境中，“基本上”意味着氨基酸序列同一性的程度优选是至少大约85%-95%、或更优选至少大约90%-95%、或甚至更优选至少大约95%、或最优选至少大约98%。在一个具体的实施方案中，所述人Ig基因区段使得所述免疫球蛋白分子在人体中没有免疫原性。在这里，术语“人/人源化免疫球蛋白(Ig)重链和/或轻链基因座”或“人/人源化Ig基因座”可互换使用。[0094]术语“人抗体”和“人免疫球蛋白”在本文中用于指包含完全人的序列的抗体和免疫球蛋白分子。[0095]术语“人源化抗体”和“人源化免疫球蛋白”在用于本文时意指包含人免疫球蛋白多肽序列(或人免疫球蛋白基因区段所编码的多肽序列)的至少一部分的免疫球蛋白分子。本发明的人源化免疫球蛋白分子可以自经工程化改造而生成人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物分离。相对于自该动物或衍生自该动物的细胞所制备的非人源化免疫球蛋白分子，这样的人源化免疫球蛋白分子对灵长类动物、尤其是人的免疫原性较低。人源化免疫球蛋白或抗体包括在基因转换动物中通过基因转换(geneconversion)和体细胞高突变(somatichypermutation)而进一步多样化的免疫球蛋白(Ig)和抗体。这样的人源化Ig或抗体不是“人(源)的”，因为它们不是由人天然生成的(因为人类不是通过基因转换来使其抗体全集多样化的)，可是人源化Ig或抗体对人没有免疫原性，因为它们在其结构中具有人Ig序列。[0096]“转基因或转基因构建物”指具有编码天然的或合成的蛋白质的序列的DNA片段，其中所述蛋白质通常在该动物或该动物的细胞中找不到。术语“转基因构建物”在本文中用于指包含结构性“目的基因”和推动基因转移的其它序列的多核苷酸分子。本发明涉及至少两种转基因构建物:1)由B细胞特异性启动子驱动的兔bcl-2凋亡抑制剂转基因，和2)人Ig基因座-自身切割肽-凋亡抑制剂转基因构建物。[0097]“转基因表达载体或表达构建物”指在本发明的一种或数种转基因构建物之外编码在非人转基因动物的特定细胞内时间性的、细胞特异性的或增强的表达一种或多种目的转基因所需要的其它调控性DNA序列的DNA片段。[0098]“人/人源化Ig基因座-自身切割肽-凋亡抑制剂转基因或转基因构建物”指如下的转基因构建物，它转录成单一mRNA，并由于下文所讨论的自身切割机制而翻译成两种多肽，也就是人/人源化免疫球蛋白链和凋亡抑制剂。[0099]术语“自身切割肽”在用于本文时指与该肽序列自身内的两个氨基酸残基之间发生的切割活性有关的肽序列。例如，在2A/2B肽或在2A/2B样肽中，切割发生在2A肽上的甘氨酸残基与2B肽上的脯氨酸残基之间。这是通过翻译过程中的“核糖体跳跃机制”(ribosomalskipmechanism)发生的,其中2A/2B肽的2A甘氨酸残基与2B脯氨酸残基之间的正常肽键形成受损，但不影响2B肽剩余部分的翻译。所述核糖体跳跃机制在本领域是众所周知的，而且已知被数种病毒用于表达数种由单一信使RNA编码的蛋白质。[0100]术语“内源Ig(免疫球蛋白)表达B细胞”和“内源B细胞”可互换使用，指那些表达动物的内源免疫球蛋白基因座的B细胞。[0101]术语“外源Ig(免疫球蛋白)表达B细胞”和“外源B细胞”指那些经历引入所述B细胞的外源人/人源化Ig转基因座的生产性重排(productiverearrangement)的非人动物的B细胞。作为分开的表达构建物或作为还编码凋亡抑制剂的同一表达构建物的一部分，将人/人源化Ig基因座引入所述B细胞。人/人源化Ig基因座的生产性重排导致人/人源化Ig和转基因所编码凋亡抑制剂的表达。结果是，表达外源免疫球蛋白的B细胞中的凋亡得到抑制且细胞存活得到增强。[0102]“凋亡抑制剂基因的B细胞特异性表达”意指凋亡抑制剂基因产物优选在免疫细胞中、更优选在B细胞中的表达。凋亡抑制剂基因在免疫细胞或B细胞中的特异性表达是使用免疫特异性的启动子或优选的是使用B细胞特异性的启动子来驱动凋亡抑制剂基因的表达而实现的。[0103]“凋亡抑制剂的选择性表达”意指凋亡抑制剂基因产物优先在外源B细胞中而非在表达转基因动物天然免疫球蛋白的内源B细胞中的表达。优选的是，凋亡抑制剂在外源B细胞中的表达水平与内源B细胞中的表达相比高至少大约2倍、更优选至少大约5倍、甚至更优选至少大约10倍、最优选至少大约50倍。[0104]“抗体”(Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其它抗体样分子二者。术语“抗体”在本文中以最广义使用，明确覆盖但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(只要它们展现出所需特异性)。[0105]术语“Ig基因区段”在用于本文时指动物和人种系中存在的编码Ig分子各部分的DNA区段，它们在B细胞中聚到一起以形成重排的Ig基因。如此，Ig基因区段在用于本文时包括V基因区段、D基因区段、J基因区段和C区基因区段。VDJ或VJ区段的功能性重排导致免疫球蛋白重链或轻链的表达。[0106]术语“抗体多样性”和“抗体全集”可互换使用，指生物体能够表达的所有抗体特异性的整体。[0107]有能力经历基因重排和基因转换的Ig基因座在本文中也称作“功能性”Ig基因座，而具有功能性Ig基因座所产生的多样性的抗体在本文中也称作“功能性”抗体或“功能性”抗体全集。[0108]术语“单克隆抗体”用于指由B细胞单克隆合成的抗体分子。[0109]术语“多克隆抗体”用于指由一群B细胞合成的一群抗体分子。[0110]术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，在以单数或复数使用时，一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，可以是未经修饰的RNA或DNA，或者是经过修饰的RNA或DNA。如此，例如，如本文所定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包含单链和双链区的DNA、单链和双链RNA、及包含单链和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子(其可以是单链的，或者更通常的是双链的，或包含单链和双链区)。另外，术语“多核苷酸”在用于本文时指包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三链区。所述区中的链可以来自相同分子或来自不同分子。所述区可以包含一种或多种所述分子的整个，但更通常的是只牵涉有些分子的一个区域。三股螺旋区的所述分子之一常常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”明确包括cDNA。该术语包括包含一种或多种经修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。如此，主链为了稳定性或其它原因而经过修饰的DNA或RNA是“多核苷酸”，正如该术语在本文中所指的。此外，包含非常见碱基(诸如肌苷)或经修饰碱基(诸如氣化碱基)的DNA或RNA包括在如本文所定义的术语“多核苷酸”内。一般而言，术语“多核苷酸”涵盖未修饰多核苷酸的所有化学、酶和/或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括简单的和复杂的细胞)特征性DNA和RNA的化学形式。[0111]术语“非人(转基因)动物”在用于本文时包括但不限于哺乳动物，诸如例如非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)、非啮齿类的哺乳动物(诸如例如兔、猪、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴)、和鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等等)。[0112]术语“非灵长类动物”在用于本文时包括但不限于灵长类以外的哺乳动物，包括但不限于上文具体所列哺乳动物。[0113]短语“主要通过基因转换和/或体细胞高突变来创建初始抗体全集以创建抗体多样性的动物”或“基因转换动物”及其语法同义词用于指这样的动物，其中抗体多样化的主要机制是基因转换和/或高突变，与基因重排成对比。这样的动物包括但不限于兔、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等等)、牛和猪。特别优选的非人动物是兔和鸡。[0114]“在生命早期停止抗体基因重排”的动物意指那些通常在生命的第一个月里停止免疫球蛋白基因重排的动物。此类动物的例子包括但不限于兔、鸟类(例如鸡)、绵羊、山羊、牛、猪和马。[0115]详述[0116]本发明至少部分基于如下认识，即经历短期淋巴细胞生成的非人转基因动物中免疫球蛋白(包括免疫球蛋白链)的生成可以通过在该动物的B细胞中表达凋亡抑制剂而得到显著提高。结果是，B细胞的存活得到增强且免疫球蛋白的生成得到提高。[0117]本发明进一步基于新的凋亡抑制剂，兔bcl-2的鉴定。因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于提高非人转基因动物中的免疫球蛋白表达的方法，其通过使用B细胞特异性启动子在动物的B细胞中过量表达兔bcl-2，由此增强B细胞存活来实现。[0118]本发明进一步涉及用于选择性增强经历短期淋巴细胞生成的非人动物中外源B细胞即表达免疫球蛋白转基因基因座的B细胞的存活胜过不表达所述转基因基因座的内源B细胞的存活的方法。选择性是通过将外源免疫球蛋白表达与凋亡抑制剂表达偶联在一起来实现的。在内源B细胞中，凋亡抑制剂不表达，因此凋亡不受抑制。这样的选择性表达导致转基因所表达的免疫球蛋白胜过转基因动物内源生成的免疫球蛋白而优先生成。[0119]bcl-2凋亡抑制剂(本文首次公开的兔序列以外的)的过量表达主要是在小鼠中研究的，其中由于B淋巴细胞、免疫球蛋白分泌细胞和血清免疫球蛋白的大大过量显示了放大的且延长的对免疫的抗体应答，这要归功于B谱系细胞和抗原特异性记忆B细胞寿命的延长；McDonnelIetal.,Cell,57:79-88,(1989);Strasseretal.,CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology,166:175-181,(1990);Knottetal.,Hybridoma,15(5):365-371，(1996);Smithetal.,J.Exp.Med.,191(3):475-784(2000);Strasseretal.,PNAS,88:8661-8665,(1991);Kumaretal.,ImmunologyLetters,65:153-159,(1999)。[0120]所靶向的B细胞群的凋亡照例在整个B细胞发育过程中发生。通过研究不同的物种，已经鉴定了B细胞发育的两种主要策略:持续的B淋巴细胞生成，正如在小鼠和人中发现的；和短期B淋巴细胞生成，之后在肠道相关淋巴样组织(GALT)中扩增，正如在鸡、兔、绵羊和牛中发现的(综述见LanningD,OsborneBA,Knight,KL,Immunoglobulingenesandgenerationofantibodyrepertoiresinhighervertebrates:akeyroleofGALT.MolecularBiologyofB-cells;AltFW,HonjoT,Nueberger,MS,编ElsevierLondon,p443(2004);FlajnikMF,Comparativeanalysisofimmunoglobulingenes:surprisesandportents.Nat.Rev.1mmunol.2:688,(2002))。[0121]在发生持续B淋巴细胞生成的物种中，B细胞主要在骨髓和胎肝中发育，而且免疫球蛋白基因通过组合V(D)J连接过程而实地多样化。此类物种中的大多数外周血淋巴细胞是具有未多样化VDJ和VJ基因的IgM+、IgD+、或幼稚B细胞，甚至在成熟个体中也是如此。如此，具有持续B淋巴细胞生成的动物中快速生成B细胞区室的压力可能较少，因为具有新抗原特异性的新B细胞持续生成。[0122]与此相反，在B淋巴细胞生成是短暂的GALT(肠道相关淋巴样组织)物种中，在生命早期在诸如卵黄囊和脾的组织中形成初始B细胞集合，之后免疫球蛋白(Ig)基因在GALT中多样化。因为B淋巴细胞生成停滞是迅速的，此初始B细胞区室必须快速扩增和多样化以产生具有生物学相关特异性的抗体。例如，鸡、绵羊和牛的Ig基因体细胞多样化甚至在出生前就开始了。后果是，例如成熟兔外周血淋巴细胞内的几乎所有VDJ基因高度多样化且缺少幼稚B细胞。但，成熟兔就是能够发动针对先前未见过的抗原的初次抗体应答。那是因为自GALT迁移至外周的B细胞似乎是初级B细胞全集的，即使它们的VDJ基因早已多样化，这些长命的和/或自我更新的B细胞能维持功能性抗体全集。还有可能的是，正如在兔的情况中，在具有短期B淋巴细胞生成的物种中，外源抗原刺激有助于驱动抗体全集的多样化。[0123]在正常小鼠中，在初级T细胞依赖性免疫应答期间，生发中心-B细胞中发生IgV区基因体细胞突变，如此产生变异的B细胞，它们表达的免疫球蛋白对抗原具有改变的亲和力。通过凋亡抑制正选择出亲和力得到提高的变体，最终这样的高亲和力B细胞构成抗原特异性记忆和抗体形成B细胞群的主体。具有低亲和力受体的B细胞未能接受此类抗原依赖性存活信号，并经历凋亡。记忆和抗体形成B细胞群中高亲和力B细胞的这种增多称作亲和力成熟。[0124]在bcl-2转基因小鼠中，bcl-2的过量表达导致不仅高亲和力B细胞的凋亡得到预防，而且低亲和力B细胞的凋亡也得到预防。bcl-2过量表达的小鼠有过多数目的记忆B细胞是未经亲和力选择的。与此相反，bcl-2小鼠中高亲和力骨髓抗体形成细胞的严格选择不受bcl-2转基因的影响，而且它们的数目与对照相比保持不变。[0125]尽管bcl-2过量表达对经历持续B淋巴细胞生成的其它动物中B细胞存活和发育的影响可能与小鼠中的情况相似，然而它在经历短期B淋巴细胞生成的动物的记忆和/或抗体形成B细胞的发育中的作用尚不清楚。[0126]因此，本发明致力于用于特别是在具有短期B淋巴细胞生成的动物中(像兔、鸟类、鸡、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴)过量表达凋亡抑制剂和在所述转基因动物中增强B细胞存活的方法。另外，在这些动物进一步表达Ig转基因座时，Ig转基因座的表达得到增强或延长，而且因为这些动物体型较大，所以它们的抗体产量应当也较大。如此，本发明致力于通过增强的B细胞存活来创建外源免疫球蛋白生成数量更大的体型更大的建立者动物。[0127]一方面，本发明致力于可用于增强B细胞存活的转基因构建物。转基因或转基因构建物是具有编码一种或数种天然的或合成的蛋白质的序列的DNA片段，其在所述动物或所述动物的细胞中通常找不到。可以通过多种技术将DNA片段引入动物的基因组，包括原核(pronuclei)显微注射、转染、核转移克隆、精子介导的基因转移、睾丸介导的基因转移、坐坐寸寸o[0128]在一个实施方案中，转基因构建物包含编码凋亡抑制剂即兔bcl-2多肽的核酸分子。“编码凋亡抑制剂的核酸分子”意指天然DNA序列，以及任何经过密码子优化的DNA序列，它们与天然DNA序列编码相同的多肽序列，但基于密码子简并性而具有不同的DNA序列。这个概念在下文中有详细讨论。在另一个实施方案中，转基因构建物包含编码任何凋亡抑制剂的核酸分子。凋亡抑制剂基因，诸如兔bcl-2基因或人bcl-2基因，优选在转基因动物的B细胞中依靠免疫特异性启动子来表达，优选B细胞特异性启动子。因此，凋亡抑制剂表达得到增强，优选只在B细胞中，导致非人转基因动物中增强的B细胞存活。“B细胞特异性启动子”意指通常控制B细胞中所表达基因的表达的任何B细胞特异性基因的启动子/增强子序列和/或其变体或工程化改造部分，其例子包括但不限于⑶19、⑶20、⑶21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72、Blimp-l、CD79b(也称作B29或IgP)、mb_l(也称作Iga)、酪氨酸激酶blk、VpreB、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白k轻链、免疫球蛋白\轻链、免疫球蛋白J链等的启动子/增强子。在一个优选的实施方案中，K轻链启动子/增强子驱动兔bcl-2凋亡抑制剂基因的B细胞特异性表达。[0129]在还有一个实施方案中，包含编码凋亡抑制剂的核酸分子的转基因构建物与包含外源免疫球蛋白或免疫球蛋白(Ig)链转基因基因座的转基因构建物一起共表达。在这个实施方案中，Ig转基因基因座与凋亡抑制剂转基因二者可以存在于同一转基因表达载体上，或者存在于两个不同的转基因表达载体上。在后一种情况中，可以同时的或序贯的将两个转基因表达载体引入非人转基因动物。[0130]本发明还提供了包`含编码融合蛋白的嵌合转基因的转基因构建物，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点。在这里，使用下文所述机制将凋亡抑制剂的表达与免疫球蛋白重链或轻链的表达连接或偶联在一起。这种转基因构建物也称作Ig基因座-蛋白酶切割位点-自身切割肽-凋亡抑制剂构建物。在这种构建物中，任选添加蛋白酶切割位点以推动从免疫球蛋白中(例如从M2_Ig外显子中)消除F2A自身切割肽序列，以预防F2A肽序列对信号传导(及因此的B细胞发育)的任何潜在干扰。蛋白酶切割位点可以得到任何组成性表达的蛋白酶的识别。可用于本发明的蛋白酶切割位点包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶等的。在一个优选的实施方案中，蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。[0131]上文所述嵌合转基因包含编码自身切割肽(例如2A肽或2A样肽)的DNA序列。转基因中免疫球蛋白编码序列与凋亡抑制剂序列之间自身切割肽编码序列的插入导致一种信使RNA的生成。然而，由于肽的自身切割机制，这种mRNA的翻译导致两种不同的蛋白质，免疫球蛋白和凋亡抑制剂。因此，可以将凋亡抑制剂的表达与VDJ或VJ区段的功能性重排偶联在一起。[0132]在本发明的一个这样的实施方案中，自身切割是由病毒的2A/2B肽或2A样/2B序列介导的，所述病毒包括小RNA病毒科、马A型鼻炎病毒(ERAV)科、小RNA病毒样昆虫病毒科或C型轮状病毒科。小RNA病毒科包括肠_、鼻_、心-和口(aphtho)-和蹄-口病(口蹄病)(FMDV)病毒。小RNA病毒样昆虫病毒科包括诸如传染性香病病毒(infectiousfIacherievirus,IFV)、果蝇C病毒(DCV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的病毒和昆虫病毒Thoseaasigna病毒(TaV)。C型轮状病毒科包括牛的、猪的和人的C型轮状病毒。在更多实施方案中，切割序列可以包括来自脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、门戈病毒、猪捷申病毒(teschovirus)-l或Theiler氏鼠脑炎病毒(TMEV)等的2A样/2B序列。在一个优选的实施方案中，自身切割的蛋白质序列是口蹄病病毒(FMDV)、马A型鼻炎病毒(ERAV)或Thoseaasigna病毒(TaV)的2A/2B妝(Palmenbergetal.,Virologyl90:754-762(1992);Ryanetal.,JGenVirol72:2727-2732(1991);Donnellyetal.,JGenVirol82:1027-1041(2001);Donnellyetal.,JGenVirol82:1013-1025(2001);Szymaczaketal.,NatureBiotech22(5):589-594(2004))。如此，使用自身切割肽，将外源B细胞内的凋亡抑制剂基因的表达与Ig转基因座的表达连接或偶联在一起。外源B细胞胜过内源B细胞的选择性存活导致内源免疫球蛋白生成降低但Ig转基因座所编码的多肽/蛋白质的生成相应提高。[0133]尽管作为凋亡抑制剂的原型讨论了bcl-2，然而还包括其它凋亡抑制剂以用于嵌合转基因构建物。这些包括但不限于胱天蛋白酶-9显性负(dominantnegative)(胱天蛋白酶-9-DN)突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶-9S、crmA、z-VAD-fmk、z-DEVD-fmk、B-D-fmk和z-YVAD-fmk、其它bcl_2家族成员(像Bc1-Xl、Mcl_l、等)、促凋亡分子的抑制剂(像Bax、Bak、Bad)、“只含BH3域”分子的抑制剂(像Bid、Bim,PUMA、Noxa、等)、其它内源胱天蛋白酶抑制剂(像LAP(—种凋亡蛋白质抑制剂^包括但不限于乂^^^^^^^^^八^^^^丄、cIAP2、API1、API2、API3、API4、HIAPl、HIAP2、MIHA、MIHB,MIHC、ILP、ILP-2、TLAP、存活蛋白、livin、apollon、BRUCE、和MLIAP、等)、牵涉死亡受体下调的蛋白质(像SODD和FLIP等)及其变体。在一个具体的实施方案中，凋亡抑制剂基因可以是哺乳动物bcl-2基因；而在多个优选的实施方案中，哺乳动物bcl-2基因选自人bcl-2、小鼠bcl-2和SEQIDNO:5的兔bcl-2。在一个优选的实施方案中，使用SEQIDN0:5的兔bcl-2基因。[0134]在本发明的又一个方面，转基因编码免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链或其部分。基因座可以处于种系构型或重排形式。编码序列或其部分可以编码人的免疫球蛋白，导致人/人源化抗体的表达。[0135]编码人/人源化抗体的转基因包含Ig基因座或Ig基因座的大部分，其包含一个或数个人Ig区段(例如人IgV、D、J或C基因区段)。或者，转基因是人的免疫球蛋白基因座或其大部分。包含这样的人Ig基因座或这样的经修饰Ig基因座或经修饰Ig基因座部分的转基因，在本文中也称作“人/人源化Ig转基因座”，能够在转基因非人动物中经历基因重排，由此生成具有至少一部分人免疫球蛋白多肽序列的抗体的多样化全集。[0136]免疫球蛋白重链和轻链基因包含数个区段，它们由个别基因编码并由内含子序列分开。如此，在染色体14上找到了人免疫球蛋白重链的基因。重链可变区(VH)包含三个基因区段:V、D和J区段，接着是编码C区的多个基因。V区与C区由大间隔物分开，而编码V、D和J区段的个别基因也由间隔物分开。[0137]有两种类型的免疫球蛋白轻链:K和入。在染色体2上找到了人K轻链的基因，而在染色体22上找到了人\轻链的基因。抗体轻链可变区包括V区段和J区段，它们由分开的基因区段编码。在K轻链基因的种系构型中，大约有100-200个线性排列的V区基因，每个基因有其自己的前导序列，接着是大约5个J基因区段、和C区基因区段。所有V区由内含子分开，而且还有分开V、J和C区基因区段的内含子。[0138]另外，包含上文所述任一转基因构建物的载体可进一步包含编码抗生素选择标志物(像庆大霉素、新霉素或卡那霉素等)的DNA序列和/或表达载体的其它常规构件。[0139]本发明提供了用于增强经历短期淋巴细胞生成的非人转基因动物中的免疫球蛋白表达的方法，包括向经历短期淋巴细胞生成的转基因动物中引入至少一种包含由B细胞特异性启动子/增强子驱动的凋亡抑制剂转基因的转基因构建物。如此，所述具有转基因构建物的B细胞的凋亡受到抑制且免疫球蛋白或免疫球蛋白链的生成得到增强。在这种方法的又一个实施方案中，经历短期淋巴细胞生成的非人转基因动物可进一步包含外源免疫球蛋白或免疫球蛋白链转基因基因座。这导致外源免疫球蛋白的更高产量，可大大简化抗体纯化和生产。在这种情况中，可以或是作为还引入Ig转基因座的转基因表达构建物的一部分或是在不同转基因构建物上来引入凋亡抑制剂基因。[0140]本发明进一步提供了用于选择性增强非人转基因动物的外源B细胞中外源免疫球蛋白/免疫球蛋白链表达的另一种方法，其中外源B细胞中外源免疫球蛋白/免疫球蛋白链与凋亡抑制剂转基因的表达偶联在一起。相应的，内源B细胞或不表达Ig转基因座的B细胞中没有凋亡抑制剂的表达。由于外源免疫球蛋白转基因座的生产性重排和外源B细胞存活的提高，转基因所编码的免疫球蛋白的生成得到提高，胜过内源免疫球蛋白的生成。如此，外源B细胞的存活得到增强，而且外源免疫球蛋白/免疫球蛋白链的生成也得到增强。[0141]本发明进一步提供了编码兔bcl-2(—种凋亡抑制剂)的蛋白质、多肽或肽序列的核酸序列。还设想了兔bcl-2的给定核酸序列可以表现为尽管具有略微不同的核酸序列但编码相同蛋白质的天然变体。此外，术语功能性等效密码子在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的六种密码子，而且还指编码生物学等效氨基酸的密码子，正如本文中所讨论的。[0142]本发明中所使用的兔bcl_2DNA区段涵盖生物学功能等效修饰的多肽和肽。这样的序列可以是因已知在核酸序列和如此编码的蛋白质中天然存在的密码子冗余和功能等效性而引起的后果。或者，功能性等效蛋白质或肽可以经重组DNA技术的应用来创建，其中可以基于对所交换氨基酸特性的考虑来工程化改造蛋白质结构的变化。可以通过位点定向诱变技术来引入由人设计的变化，例如用于引入对蛋白质抗原性的改进、用于降低蛋白质对接受该蛋白质的受试者的体内毒性效果、或用以提高牵涉蛋白质的任何治疗的功效。[0143]在容许遗传密码的简并性时，本发明涵盖与兔bcl-2基因或人bcl-2基因的核苷酸序列分别具有至少大约50%、通常是至少大约60%、更通常的是大约70%、最通常的是大约80%、优选至少大约90%和最优选大约95%序列同一性的序列。这些也称作经过密码子优化的序列，而且在下文功能性等效密码子中有所讨论。[0144]术语生物学功能等效的在本领域是普遍了解的，而且在本文中做了进一步定义。相应的，在氨基酸水平具有大约70%和大约80%之间的、或更优选的是大约81%和大约90%之间的、或甚至更优选的是大约91%和大约99%之间的同一性的序列视为与兔bcl-2多肽是功能性等效的，倘若蛋白质的生物学活性得到维持的话。[0145]术语功能性等效密码子在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，诸如精氨酸或丝氨酸的六种密码子，而且还指编码生物学等效氨基酸的密码子。[0146]下文是基于改变蛋白质的氨基酸以创建等效的、或甚至改进的第二代分子的讨论。例如，某些氨基酸可用于替代蛋白质结构中的其它氨基酸，而与诸如例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用性结合能力没有可察觉的损失。由于是蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的生物学功能活性，因此可以在蛋白质序列中及在其潜在的DNA编码序列中进行某些氨基酸替代，而且仍然生成具有类似特性的蛋白质。如此，本发明人设想了可以在基因的DNA序列中进行各种变化，而其生物学效用或活性没有可察觉的损失，正如下文所讨论的。[0147]在进行这样的变化时，还可以考虑氨基酸的疏水性指数。疏水性氨基酸指数在赋予蛋白质以相互作用性生物学功能中的重要性在本领域得到了普遍了解(Kyte&Doolittle,1982)。公认氨基酸的相对疏水性特征促成所得蛋白质的二级结构,继而限定蛋白质与其它分子的相互作用，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等。[0148]本领域还了解可以高效进行基于亲水性的相似氨基酸的替代。美国专利4，554，101，收入本文作为参考，记载了蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性决定)与蛋白质的生物学特性有关联。如美国专利4，554，101中详述的，赋予氨基酸残基如下亲水性值:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。[0149]本领域了解可以用一种氨基酸替代具有相似亲水性值的另一种氨基酸而仍然生成生物学等效的和免疫学等效的蛋白质，在这样的变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的替代是优选的，那些在±1以内的是特别优选的，而那些在±0.5以内的是甚至更特别优选的。[0150]正如本文所概述的，氨基酸替代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑了上述各种特征的例示性替代是本领域技术人员众所周知的，包括:精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。[0151]用于制备依照本发明的多肽的另一个实施方案是肽模拟物的应用。模拟物是模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子(Johnsonl993)。肽模拟物应用后面的潜在原理在于蛋白质的肽主链的存在主要是为了确定氨基酸侧链的方向，从而推动分子相互作用，诸如抗体与抗原的相互作用。预计肽模拟物容许具有与天然分子相似的分子相互作用。可以将这些原理与上文概述的原理联合使用，以工程化改造具有凋亡抑制剂许多天然特性且具有改变和改进特征的第二代分子。[0152]如此，编码兔bcl-2和兔bcl-2的功能性等效多肽的变异核酸序列可用作本发明中的调亡抑制剂。[0153]免疫系统针对感染提供保护的能力依靠专门用以创建抗体多样性全集的遗传机制。B细胞中的抗体编码基因以容许可变(V)区中结合位点有无数组合的方式进行装配。估计自这种机制可产生超过IO12种可能的结合结构。在所有动物中，包括人，抗体生成过程自免疫球蛋白(Ig)基因座可变(V)、多样性(D)和连接(J)区段的重组开始。在这个步骤之后，根据动物的物种，使用两种一般机制来生成抗体的多样结合结构。[0154]在有些动物中，诸如人和小鼠，免疫球蛋白重链基因座上有多拷贝的V、D和J基因区段，而免疫球蛋白轻链基因座上有多拷贝的V和J基因区段。这些动物中的抗体多样性主要是通过基因重排产生的，即基因区段的不同组合以形成重排的重链可变区和轻链可变区。然而，在其它动物中，例如兔、鸟类(例如鸡、鹅和鸭)、绵羊、山羊和牛，基因重排在抗体多样性的产生中发挥较小的作用。例如，在兔中，只使用非常有限数目的V基因区段、最常见的是使用位于V区3’末端的V基因区段来进行基因重排以形成连续的VDJ区段。在鸡中，只使用一个V基因区段(与D区邻近的那个，或“3’近端V基因区段”)、一个D区段和一个J区段进行重链重排；而且只使用一个V基因区段(3’近端V区段)和一个J区段进行轻链重排。如此，在这些动物中，在由连接多样化产生的最初重排可变区序列中只有很少的多样性。重排Ig基因的进一步多样化是通过基因转换实现的，其中衍生自上游V基因区段的短序列替换重排Ig基因V基因区段中的短序列的一个过程。抗体序列的另外的多样化可以通过高突变来产生。[0155]免疫球蛋白(抗体)分属五类(IgG、IgM、IgA、IgE和IgD)，各自在免疫防御中具有不同的生物学作用。在血液中最丰富的和在应答感染时最有力的是IgG类。在人的IgG类中，根据构成Fe域的重链恒定区的结构,分成四个亚类(IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同种型)。抗体的F(ab)域结合抗原上的特异序列(表位)，而抗体的Fe域募集和活化免疫系统的其它成分以消除抗原。[0156]天然抗体和免疫球蛋白通常是异源四聚体糖蛋白，大约150，000道尔顿，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过共价二硫键与重链相连，而二硫键联接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规则的链内二硫键桥接。每条重链在一端具有一个可变域(VH)，接着是一些恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(VL)，在另一端具有一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链可变域与重链可变域排列在一起。认为特定的氨基酸残基形成轻链与重链可变域间的界面(Chothiaetal.，J.Mol.Biol.186:651(1985);NovotnyandHaber,Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.82:4592(1985))。[0157]术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链二者可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们通过三个⑶R连接。每条链中的⑶R通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的⑶R—起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。[0158]人-动物转基因座的创建容许创建以高产量表达多样化的、高亲和力的人/人源化(多克隆)抗体的转基因动物。一般而言，非人动物中免疫球蛋白(Ig)基因座的人源化牵涉一个或多个人Ig基因区段整合入动物的基因组以创建人/人源化免疫球蛋白基因座。如此，人/人源化Ig重链基因座的创建牵涉一个或多个V和/或D和/或J区段、和/或C区区段整合入动物的基因组。类似的，人源化Ig轻链基因座的创建牵涉一个或多个V和/或J区段、和/或C区区段整合入动物的基因组。[0159]不管在染色体中的位置，本发明的人/人源化Ig基因座有能力在非人动物中经历基因重排和基因转换和高突变，由此生成人/人源化Ig分子的多样化全集。有能力经历基因重排和基因转换的Ig基因座还称作“功能性”Ig基因座，而具有功能性Ig基因座所产生的多样性的抗体还称作“功能性”抗体或抗体分子的“功能性”全集。[0160]一方面，其中抗体全集的多样化在生命早期停止的动物可用于本发明。B细胞发育自造血干细胞。在抗原暴露前，B细胞经历一系列成熟步骤，其终产物是成熟B细胞，它在其细胞表面上表达独特的膜相关IgM和通常的IgD及其它细胞表面信号分子。尽管在人中，通过基因重排进行的抗体多样化在整个生命中发生，然而在其它动物中，抗体全集的多样化在生命早期就停止了，通常在生命的第一个月里。[0161]在本发明的一个方面，可以对其施用本发明DNA构建物的动物包括但不限于哺乳动物(例如人、非人灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)、非啮齿类动物(例如兔、猪、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴))和鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等等)。可以对其施用本发明DNA构建物的动物包括“基因转换动物”，就是说，主要通过基因转换和/或体细胞高突变来创建抗体多样性的动物(例如兔、鸟类、牛、猪等)和抗体重排在生命早期(通常在生命的第一个月里)停止的动物(例如兔、鸟类、绵羊、山羊、牛、猪、马等)。[0162]此外，可以对其施用本发明DNA构建物的动物还包括进一步携带编码外源免疫球蛋白转基因座的转基因(优选的是，人/人源化免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链序列或其部分)的任何上文所述非人动物。转基因基因座可以是种系构型，或者是重排形式。因为转基因编码人/或人源化免疫球蛋白或其部分，所以它导致人源化抗体的产生。如此，例如，使用上文所述方法，使用本发明所述兔bcl-2凋亡抑制剂，在目标非人动物中可以产生增强的人源化抗体生成。[0163]依照本发明，通过向动物的接受者细胞中引入一种或多种上文所述转基因载体(其中之一携带人/人源化Ig基因座)，并自经过遗传修饰的接受者细胞衍生动物，创建了能够生成人/人源化免疫球蛋白的转基因动物。[0164]接受者细胞可以例如来自通过基因转换和/或高突变产生抗体多样性的非人动物，例如鸟类(诸如鸡)、兔、牛等等。在这样的动物中，优先使用3’近端V基因区段来生成免疫球蛋白。将人V基因区段整合入转基因载体上的Ig基因座，或是通过替换动物的3’近端V基因区段或是通过置于3’近端V基因区段的紧密近端，这导致人V区多肽序列的表达占免疫球蛋白的大部分。或者，可以将重排的人V(D)J区段插入转基因载体上免疫球蛋白基因座的J基因座。[0165]可以将包含目的基因(也就是人/人源化Ig基因座和凋亡抑制剂基因)的转基因载体引入接受者细胞，然后通过随机整合或靶向整合而整合入接受者细胞的基因组。[0166]对于随机整合，可以通过标准转基因技术将包含人/人源化Ig基因座的转基因载体引入动物接受者细胞。例如，可以将转基因载体直接注射入受过精的卵母细胞的原核。还可以通过在卵母细胞受精前将精子与转基因载体共温育来引入转基因载体。可以自受过精的卵母细胞发育成转基因动物。引入转基因载体的另一种方法是通过转染胚胎干细胞，随后将经过遗传修饰的胚胎干细胞注射入发育中的胚胎。或者，可以将转基因载体(裸露的或联合了促进剂的)直接注射入发育中的胚胎。最终，自胚胎生成嵌合转基因动物，在转基因动物的至少有些体细胞的基因组中包含整合来的人/人源化Ig转基因。[0167]在一个具体的实施方案中，包含人/人源化Ig基因座的转基因随机整合入衍生自内源免疫球蛋白基因表达受损的动物品系的接受者细胞(诸如受过精的卵母细胞或发育中的胚胎)的基因组。这样的动物品系的使用容许免疫球蛋白分子自人/人源化转基因Ig基因座优先表达。这样的动物的例子包括Alicia和Basilea兔品系，以及无、球蛋白血症鸡品系，以及免疫球蛋白敲除小鼠。或者，可以将具有人/人源化免疫球蛋白转基因或基因座的转基因动物与内源免疫球蛋白表达受损的动物品系进行交配。可以得到对于受损的内源Ig基因座和人/人源化转基因Ig基因座是纯化的后代。[0168]对于靶向整合，可以将转基因载体引入适宜的动物接受者细胞，诸如胚胎干细胞或早已分化的体细胞。然后，可以通过标准方法选择出其中转基因已经通过同源重组整合入动物基因组并替换相应内源Ig基因座的细胞。参阅例如Kuroiwaetal.,NatureGenetics2004，June6。然后可以将选出的细胞与去核的核转移单位细胞融合，例如卵母细胞或胚胎干细胞，即全能的和能够形成功能性新生儿的细胞。可以依照已经建立的常规技术来进行融合。卵母细胞的去核和核转移可以使用注射移液器通过显微手术来进行(参见例如Wakayamaetal.，Nature(1998)394:369)。然后将所得卵细胞在适宜的培养基中进行培养，并转移入同步化接受者用于产生转基因动物。或者，可以将选出的经过遗传修饰的细胞注射入发育中的胚胎，随后发育成嵌合动物。[0169]此外，依照本发明，还可以通过向接受者细胞中引入一种或多种上文所述重组载体(其中之一携带人Ig基因区段，连接至与内源Ig基因区段的侧翼序列同源的5’和3’侧翼序列)，然后选择其中通过同源重组而内源Ig基因区段被人Ig基因区段所替换的细胞，并自选出的经过遗传修饰的接受者细胞衍生出动物来生成能够生成人/人源化免疫球蛋白的转基因动物。`[0170]与转基因载体的靶向插入相似，适于用作这种方法中的接受者细胞的细胞包括胚胎干细胞或早已分化的体细胞。可以通过任何可行手段将携带人Ig基因区段的重组载体引入这样的接受者细胞，例如转染。然后，可以通过标准方法选择出其中通过同源重组而人Ig基因区段已经替换相应内源Ig基因区段的细胞。这些经遗传修饰的细胞可以充当核转移规程中的核供体细胞，用于克隆转基因动物。或者，可以将选出的经过遗传修饰的胚胎干细胞注射入发育中的胚胎，随后可以发育成嵌合动物。[0171]在一个具体的实施方案中，可以直接的通过将转基因注射入胚胎或者间接的通过将它们注射入孕母或正在产蛋的母鸡，在胚胎期将本发明的转基因构建物引入转基因动物。后果是，由于外源B细胞中的凋亡受到抑制，转基因后代将会在应答抗原免疫时具有提高的人/人源化抗体生成。[0172]通过任何上述方法生成的转基因动物构成了本发明的另一个实施方案。转基因动物在基因组中具有至少一个，即一个或多个人/人源化Ig基因座，由其生成人/人源化抗体的功能性全集。[0173]在一个具体的实施方案中，本发明提供了表达一个或多个人/人源化Ig基因座和凋亡抑制剂基因的转基因兔。本发明的转基因兔能够经历人/人源化Ig基因座的重排和基因转换，及表达人/人源化抗体的功能性全集。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了表达一个或多个人/人源化Ig基因座和凋亡抑制剂基因的转基因鸡。本发明的转基因鸡能够经历人/人源化Ig基因座的重排和基因转换，及表达人/人源化抗体的功能性全集。在另一个具体的实施方案中，本发明提供了表达一个或多个人/人源化V区和兔bcl-2凋亡抑制剂基因的转基因小鼠。人/人源化V区包含至少两个人V基因区段，其侧翼为非人间隔物序列。转基因小鼠能够经历人V元件的重排及表达抗体的功能性全集。[0174]用抗原进行免疫导致所述转基因动物中针对该抗原的人/人源化抗体的生成。[0175]尽管本发明的优选实施方案致力于具有人/人源化Ig基因座的转基因动物，然而应当了解具有灵长类化Ig基因座的转基因动物和灵长类化多克隆抗血清也在本发明的精神之内。与人/人源化多克隆抗血清组合物相似，灵长类化的多克隆抗血清组合物有可能在人类个体中具有降低的免疫原性。[0176]一旦创建能够生成多样化人/人源化免疫球蛋白分子的转基因非人动物(正如下文进一步所述)，可以通过用抗原免疫动物而容易的得到针对抗原的人/人源化免疫球蛋白和人/人源化抗体制备物。多种抗原可用于免疫转基因宿主动物。这样的抗原包括活的、减毒的或死的微生物，例如病毒和单细胞生物体(诸如细菌和真菌)，微生物碎片，或分离自微生物的抗原性分子。[0177]用于免疫动物的优选细菌性抗原包括自金黄色葡萄球菌纯化的抗原诸如荚膜多糖5型和8型、重组型式的毒力因子诸如a-毒素、粘附素结合蛋白、胶原结合蛋白、和纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌性抗原还包括减毒型式的金黄色葡萄球菌(Staphylococccusaureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae),或来自这些细菌细胞的培养物上清液。可用于免疫的其它细菌性抗原包括纯化的脂多糖(LPS)、荚膜抗原、荚膜多糖和/或重组型式的外膜蛋白质、纤连蛋白结合蛋白、内毒素和外毒素，其来自铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌。[0178]用于产生针对真菌的抗体的优选抗原包括减毒型式的真菌或其外膜蛋白质，所述真菌包括但不限于白色假丝酵母(Candidaalbicans)、近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)。[0179]用于免疫以生成针对病毒的抗体的优选抗原包括包膜蛋白和减毒型式的病毒，包括但不限于呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F-蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV和HSV。[0180]通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系免疫转基因动物，可以生成可用于治疗癌症的治疗用抗体；肿瘤相关抗原包括但不限于Her-2-neu抗原(针对它的抗体可用于治疗乳腺癌)，⑶19、⑶20、⑶22和⑶53抗原(针对它们的抗体可用于治疗B细胞淋巴瘤)，前列腺特异性膜抗原(PMSA)(针对它的抗体可用于治疗前列腺癌)，及17-1A分子(针对它的抗体可用于治疗结肠癌)。[0181]可以以任何便利的方式对转基因宿主动物使用抗原，而且可以依照预定的方案来进行施用。[0182]免疫后，可以将来自经免疫转基因动物的血清或乳汁分级以纯化药用级的对抗原特异的多克隆抗体。在转基因鸟类的情况中，还可以通过对卵黄进行分级来制备抗体。可以通过层析(亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等)、使用盐诸如硫酸铵、有机溶剂诸如乙醇、或聚合物诸如聚乙二醇的选择性沉淀来得到浓缩的、纯化的免疫球蛋白级分。[0183]可以将经过分级的人/人源化抗体在适于静脉内施用于人的无毒、无热原介质例如无菌缓冲盐水中溶解或稀释。[0184]用于施用的抗体制备物的一般特征为免疫球蛋白浓度为0.l-100mg/ml，更通常的是l-10mg/ml。抗体制备物可以包含各种同种型的免疫球蛋白。或者，抗体制备物可以只包含一种同种型或一些选定同种型的抗体。[0185]为了生成人/人源化单克隆抗体，自经过免疫的转基因动物分离脾细胞，所述转基因动物中表达该动物内源免疫球蛋白的B细胞已经消减。或是将分离的脾细胞用于与转化细胞系的细胞融合以生成杂交瘤，或是通过标准分子生物学技术来克隆编码抗体的cDNA并在转染细胞中表达。用于生成单克隆抗体的规程是本领域已经建立的。参见例如欧洲专利申请0583980Al(“MethodForGeneratingMonoclonalAntibodiesFromRabbits”即用于自兔生产单克隆抗体的方法)、美国专利4，977，081(“StableRabbit-MouseHybridomasAndSecretionProductsThereof”即稳定的兔-小鼠杂交瘤及其分泌产物)、W097/16537(“StableChickenB-cellLineAndMethodofUseThereof”即稳定的鸡B细胞系及其使用方法)和EP0491057BI(“HybridomaWhichProducesAvianSpecificImmunoglobulinG”即生成禽类特异性免疫球蛋白G的杂交瘤)，将其公开内容收入本文作为参考。自克隆的cDNA分子体外生成单克隆抗体记载于Andris-Widhopfetal.,“Methodsforthegenerationofchickenmonoclonalantibodyfragmentsbyphagedisplay，，,JImmunolMethods242:159(2000)及BurtonDR,“Phagedisplay”，Immunotechnologyl:87(1995)，将其公开内容收入本文作为参考。[0186]在大多数情况中，抗体制备物含有未经修饰的免疫球蛋白，即自动物制备的、没有受到例如化学试剂或酶的别的修饰的人/人源化抗体。或者，可以对免疫球蛋白级分进行处理，诸如酶促消化(例如用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶、糖苷酶、核酸酶等)、加热等，和/或进一步进行分级。[0187]本发明的实施方案致力于包含兔bcl-2凋亡抑制剂的转基因，使用B细胞特异性启动子使它在B细胞中特异性表达。另一个实施方案致力于包含Ig基因座-自身切割肽-凋亡抑制剂转基因的转基因，其中凋亡抑制剂基因的表达与Ig基因座的表达偶联在一起。上文描述的和本领域知道的各种凋亡抑制剂基因，包括兔bcl-2凋亡抑制剂，可用于此实施方案。[0188]本发明的更多实施方案致力于使用上文所述转基因构建物来增强B细胞存活的方法。在使用兔bcl-2转基因构建物时，可以将转基因引入进一步包含编码免疫球蛋白基因座的转基因的转基因动物，由此特异性增强B细胞的存活。在使用Ig基因座-自身切割肽-凋亡抑制剂转基因时，外源B细胞选择性的存活并生产性的生成转基因所编码的基因。选择性是通过将外源免疫球蛋白表达与凋亡抑制剂表达偶联在一起而实现的。在内源B细胞中，凋亡抑制剂不表达，因此凋亡不受抑制。所述选择性表达导致期望转基因所表达的免疫球蛋白胜过转基因动物内源生成的免疫球蛋白而优先生成。这种转基因构建物中可以使用本文所记载的或本领域众所周知的多种凋亡抑制剂、自身切割肽或免疫球蛋白基因。在一个优选的实施方案中，转基因的Ig基因座是人/人源化免疫球蛋白/免疫球蛋白链转基因座。[0189]本发明还提供了新的凋亡抑制剂，兔bcl-2，它可用于增强细胞存活。[0190]在本发明的一个方面，表达兔bcl-2凋亡抑制剂的非人转基因动物优选是经历上文所讨论的短期淋巴细胞生成性B细胞发育的动物，包括但不限于像兔、鸡、绵羊和牛等的动物。因为这些动物体型较大，所以在使用上文所述方法时它们的抗体生成和产量也较大。在本发明的另一个方面，表达Ig基因座-自身切割肽-凋亡抑制剂的非人转基因动物是任何动物，包括啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)、兔、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅等)、牛、猪、绵羊、山羊、马、驴和其它牲畜。在又一个方面，本发明方法中所使用的转基因动物可以是基因转换动物或者是能通过生命早期停止的基因重排而经历抗体多样化的动物。在一个优选的实施方案中，非人转基因动物是兔。[0191]如此，使用上文所述方法产生的转基因构建物、包含转基因构建物的载体、和转基因动物都是本发明的实施方案。[0192]以下实施例进一步例示了本发明，绝非限制。实施例[0193]实施例1:用人bcl-2构建凋亡抑制剂表达载体[0194]对兔基因组BAC文库的筛选导致两个含兔轻链Kl基因区段的BAC(179L1和19602;基因库编号分别为AY495827和AY495828)的鉴定。[0195]为了构建B细胞特异性凋亡抑制剂表达载体，在大肠杆菌中通过同源重组修饰了BACAY495827(ET克隆:E.ChiangLeeetal.,Genomics73:56-65(2001);DaiguanYuetal.,PNAS97:5978-5983(2000);Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27:1555-1557(1999);Zhangetal.,NatureBiotechnologyl8:1314-1317(2000))并删除了核苷酸1-107795和142832-205141。合成了在来自AY495828(第114284-114570位)的kI启动子控制下且进一步与兔(6-球蛋白PolyA序列连接的合成人bcl-2基因。在下游，通过交叠延伸PCR引入侧翼为FRT位点的庆大霉素选择盒。用与经过修饰的AY495827BAC有50bp同源性的引物扩增bcl-2-庆大霉素盒(SEQIDNO:1)。通过ET克隆将BACAY495827上核苷酸134571-136019的序列交换成bcl-2-庆大霉素盒(SEQIDNO:1)。用庆大霉素选出阳性克隆，通过限制酶消化进行分析，并通过测序进行验证。随后，通过FLP重组消除庆大霉素选择盒。将所得构建物用于生成转基因动物。[0196]实施例2:用小鼠bcl-2构建凋亡抑制剂表达载体[0197]对兔基因组BAC文库的筛选导致两个含兔轻链Kl基因区段的BAC(179L1和19602;基因库编号分别为AY495827和AY495828)的鉴定。[0198]为了构建B细胞特异性凋亡抑制剂表达载体，在大肠杆菌中通过同源重组修饰了BACAY495827(ET克隆:E.ChiangLeeetal.,Genomics73:56-65(2001);DaiguanYuetal.,PNAS97:5978-5983(2000);Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27:1555-1557(1999);Zhangetal.,NatureBiotechnology18:1314-1317(2000))并删除了核苷酸1-107795和142832-205141。合成了在来自AY495828(第114284-114570位)的kI启动子控制下且进一步与兔(6-球蛋白PolyA序列连接的合成小鼠bcl-2基因。在下游，通过交叠延伸PCR引入侧翼为FRT位点的庆大霉素选择盒。用与经过修饰的AY495827BAC有50bp同源性的引物扩增bcl-2-庆大霉素盒(SEQIDNO:1)。通过ET克隆将BACAY495827上核苷酸134571-136019的序列交换成bcl_2_庆大霉素盒。用庆大霉素选出阳性克隆，通过限制酶消化进行分析，并通过测序进行验证。随后，通过FLP重组消除庆大霉素选择盒。将所得构建物用于生成转基因动物。[0199]实施例3:编码由膜形式的IgM和IgG、2A自身切割肽和凋亡抑制剂组成的融合蛋白的人/人源化重链基因座的构建[0200]使用对恒定、可变和连接基因区段或3’增强子区特异性的探针自基因组DNA文库分离包含兔免疫球蛋白重链基因座序列的BAC和F粘粒(fosmid)克隆。对分离的BAC和F粘粒Fosl5B测序(基因库编号为AY386695、AY386696、AY386697、AY386698)。通过ET克隆在大肠杆菌中通过同源重组将AY386695的J和Cμ区及ΑΥ386696的CY区交换成相应的人对应物(Ε.ChiangLeeetal.,Genomics73:56-65(2001);DaiguanYuetal.,PNAS97:5978-5983(2000);Muyrersetal.,NucleicAcidsResearch27:1555-1557(1999);Zhangetal.,NatureBiotechnology18:1314-1317(2000))?[0201]通过体外连接和Cre介导的重组来重组四个BAC，用以用人的J、Cy和Cy编码序列重建兔Ig基因座。[0202]为了将bcl-2的表达与IgM和IgG的表达连接在一起，将bcl_2的编码序列与IgM和IgG的M2膜外显子的编码序列及编码F2A自身切割肽的序列融合。[0203]为了插入编码IgG-M2-F2A-bcl_2融合蛋白的序列，生成了如下构建物。用于同源重组的序列基于BACAY386696的序列。合成了(自5’至3’)包含KpnI位点、与CYM2的50个核苷酸相同的序列、编码F2A的序列、编码人bcl-2的序列、FRT5位点和EcoRI位点的DNA片段。使用质粒pSClOlrpsL-neo(Genebridges)作为模板扩增rpsL.Neocounter选择盒。上游引物包含EcoRI位点和FRT5位点，下游引物包含与CYM2下游的50个核苷酸相同的序列和XhoI位点。将合成的片段和PCR扩增产物连接到用KpnI和XhoI切开的pcDNA3.1(+)载体中。用XhoI和KpnI释放所连接的盒(SEQIDNO:2)并用于大肠杆菌中的同源重组。在将盒转化到包含B`ACAY386696和质粒pSC101-BAD-gba-tetra的大肠杆菌菌株DHlOB中后，诱导重组酶Reda/β的表达。随后，选择卡那霉素抗性克隆，并通过限制酶消化和部分序列分析进行分析。最后，通过Flp介导的重组自BAC中删除RpsLNeo抗性基因。[0204]通过插入编码IgM-M2_F2A-bcl-2融合蛋白的序列，进一步修饰所得BAC克隆。用于同源重组的序列基于BACAY386696的序列。使用质粒pSC101rpsL-neo(Genebridges)作为模板扩增rpsL.Neo基因。引物包含与IgG_M2及侧翼序列，FRT位点和FRT2位点相同的序列(SEQIDN0:3)。通过ET克隆将扩增产物插入BACAY386696。随后，用编码IgM-M2-F2A-bcl-2融合蛋白的DNA片段(SEQIDNO:4)置换选择盒。合成了自5’至3’包含EcoRI位点、FRT位点、编码IgM-M2的序列、编码F2A和bcl_2的序列、FRT2位点和EcoRI位点的该DNA片段(SEQIDN0:4)。用EcoRI释放合成的片段并用于通过Flp介导的FRT/FRT位点与FRT2/FRT2位点之间的重组用IgM-M2-F2A-bcl_2交换rpsL.Neo基因。通过限制性分析鉴定阳性克隆并通过部分测序进行进一步分析。[0205]将所得BAC与包含不同V区的BAC组合。BAC可以通过连接或重组来组合。将所得构建物用于生成转基因动物。[0206]实施例4:表达人源化重链免疫球蛋白的转基因小鼠和兔的产生[0207]通过将DNA注射到受过精的卵母细胞的原核中，随后将胚胎转移到代孕母亲中，产生了包含人源化重链和轻链免疫球蛋白基因座和凋亡抑制剂基因的转基因兔和小鼠。通过PCR鉴定了转基因建立者动物。通过ELISA测量了人/人源化免疫球蛋白M和G的表达。人源化IgG的表达是10-20mg/ml。[0208]实施例5:表达人源化重链免疫球蛋白的转基因鸡的产生[0209]通过睾丸介导的基因转移产生了转基因鸡。将DNA构建物(50μg)与250μI脂转染试剂(superfect)在500μ10.9%NaCl中混合,并注射到公鸡的睾丸中。3_4周后,通过PCR分析鉴定带转基因精子的公鸡，并与母鸡交配。通过PCR鉴定转基因后代。人源化IgG的表达是10_20mg/ml。[0210]明确收入整篇公开文本中所引用的所有参考文献及其引用的参考文献作为参考。[0211]尽管通过参照某些实施方案例示了本发明，但是它并不限制于此。本领域技术人员了解，易于采取各种各样的改动而且它们的实施不会显著改变本发明实施的方式。所有此类改动明确落在本申请所要求的发明的范围之内。【权利要求】1.一种转基因表达构建物，其包含编码融合蛋白的转基因，其中所述融合蛋白包含如下次序的多肽序列:a)免疫球蛋白或免疫球蛋白链；b)自身切割肽；c)凋亡抑制剂；和任选的d)a)与b)之间的蛋白酶切割位点。2.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述蛋白酶切割位点选自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶的位点。3.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述蛋白酶切割位点是弗林蛋白酶切割位点。4.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述免疫球蛋白或免疫球蛋白链是人的/人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链。5.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述自身切割肽衍生自病毒的2A/2B或2A样/2B肽。6.权利要求5的转基因表达构建物,其中所述病毒选自小RNA病毒科、马A型鼻炎病毒(ERAV)科、小RNA病毒样昆虫病毒科和C型轮状病毒科。7.权利要求6的转基因表达构建物，其中所述病毒选自口蹄病病毒(FMDV)、马A型鼻炎病毒(ERAV)和Thoseaasigna病毒(TaV)。8.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述凋亡抑制剂选自bcl-2、胱天蛋白酶-9-DN突变体、杆状病毒p35、胱天蛋白酶-9S、crmA、z-VAD-fmk、z-DEVD-fmk、B-D-fmk、z-YVAD-fmk、Bcl-XL、Mcl-l、XIAP、TIAP、KIAP、NAIP、cIAPl、cIAP2、APIl、API2、API3、API4、111八？1、11^^2、]\0拟、]\0冊、]\011(:、11^、11^-2、1'^^、存活蛋白、1“111、3?011011、8冊。￡、]\^1八？、SODD和FLIP及其变体。`9.权利要求1的转基因表达构建物，其中所述凋亡抑制剂是哺乳动物的bcl-2。10.权利要求9的转基因表达构建物，其中所述哺乳动物bcl-2选自人的bcl-2、小鼠的bcl-2和兔的bcl-2。11.一种分离的宿主细胞，其是经过权利要求1的转基因表达构建物的转化的宿主细胞。12.—种多肽，其包含SEQIDN0:5的兔bcl-2多肽。13.DNA片段，自5’至3’包含KpnI位点、与CYM2的50个核苷酸相同的序列、编码F2A的序列、编码人bcl-2的序列、FRT5位点和EcoRI位点，或者自5’至3’包含EcoRI位点、FRT位点、编码IgM-M2的序列、编码F2A和bcl_2的序列、FRT2位点和EcoRI位点。【文档编号】C12N5/10GK103710371SQ201310739364【公开日】2014年4月9日申请日期:2006年8月2日优先权日:2005年8月3日【发明者】罗兰.比洛,约瑟夫.普拉策申请人:人类多克隆治疗股份有限公司