一种酸性中温糖化酶gaⅱ及其基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种酸性中温糖化酶及其基因和应用。具体的，本发明提供了一种来源于Talaromyces?emersonii?CBS204.75的新的酸性中温糖化酶GAⅡ，其具有如SEQ?ID?NO.1或2所示的氨基酸序列，提供了编码上述糖化酶的基因，其具有如SEQ?ID?NO.3或4所示的核苷酸序列，以及包含该基因的重组载体、重组菌株和重组酶及其应用。本发明的糖化酶最pH4.0，在pH范围为3-6间都很稳定，是典型的酸性糖化酶；最适作用温度50℃，37℃-55℃之间能保持50%以上的活性。适合于在酒类和燃料酒精的生产、葡萄糖、果糖浆、有机酸、味精等食品工业的等多个行业中使用。
【专利说明】—种酸性中温糖化酶GA II及其基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地，涉及一种酸性中温糖化酶GA II及其基因和应用。
【背景技术】
[0002]糖化酶，即葡萄糖淀粉酶(glucoamylase, E.C.3.2.1.3),是淀粉水解过程中的重要酶。糖化酶是一种外切型糖苷酶，主要作用是从非还原端水解淀粉、糊精、糖原等碳链上的α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并使水解下来的葡萄糖发生构型变化，得到终产物β-D-葡萄糖。另外糖化酶也能微弱水解α_1，3糖苷键。糖化酶是世界上生产量最大、应用范围最广的酶制剂。不仅用于酒类和燃料酒精的生产，还广泛用于葡萄糖、果糖衆、有机酸、味精等食品工业的多个领域(Polakovic and Bryjak, 2004, BiochemEng J18:57 - 64)。
[0003]糖化酶广泛的存在于动物、植物和微生物中。其中微生物是糖化酶的重要来源(Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit Rev Biotechnol29:225 - 255)。工业中应用的糖化酶主要是从霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)等丝状真菌和酵母属(Saccharmyces)中获得的。随着基因工程技术的广泛应用，很多糖化酶基因已被克隆并进行了异源表达(Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit RevBiotechnol29:225 - 255)。报道的糖化酶多属于糖苷水解酶15家族(HenrissatB et al.1991, Biochem J)。一般由催化域(catalytic domain, CD)、淀粉结合域(starch-binding domain, SBD)以及连接 CD 与 SBD 的 O-糖基化连接域(0-glycosylatedlinker domain)组成。
[0004]不同微生物所产生的糖化酶的pH适性、耐热性、催化特性等也不相同。目前对糖化酶性质的测定主要集中在最适温度和最适PH值的研究上，工业上应用的糖化酶多是应用它的热稳定性。大多数真菌糖化酶的最适反应pH值为4.5-5.0,在酸性条件下稳定。
[0005]本发明的糖化酶在酸性条件下具有较高酶活力，并且在酸性和中温条件下很稳定，适合在很多工业上的应用。进一步筛选新型糖化酶或克隆表达新型糖化酶基因，通过定点突变技术提高糖化酶的作用温度，会使淀粉糖化过程像淀粉液化那样在短时间内完成，从而降低能源消耗及生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景，具有重要的商业价值。
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种糖化酶。
[0007]本发明的再一目的是提供上述编码上述糖化酶的基因。
[0008]本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶编码基因的重组载体。
[0009]本发明的再一目的是提供包含上述糖化酶基因的重组菌株。
[0010]本发明的再一目的是提供一种制备新型糖化酶的方法。[0011 ] 本发明的再一目的是提供上述新型糖化酶的应用。
[0012]本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种耐酸、耐热的性质优良的新酶。本发明从Talaromyces emersonii CBS204.75得到一个新的耐酸、作用PH广的糖化酶。它所产生的糖化酶适合于在酒类和燃料酒精的生产、葡萄糖、果糖浆、有机酸、味精等食品工业的等多个行业中使用。
[0013]本发明从上述菌株中获得了一种耐热糖化酶GA II，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示:
[0014]1MLVKPLLSQV ALLAVSLGAS AESLVTRASD LNAFIASESD IALRGVLANIGPNGKAVPGA
[0015]6IDAGIWASPS KTNPDYffYTff TRDAALTFKY LIDRFVD⑶S SLQGLIQDYISAQAKLQTVQ
[0016]121NPS⑶LSSGA GLAEPKFYIN ETAFLGQffGR PQRDGPALRA TALIAYSQffLIDNGYSDVAL
[0017]18ISHVffPIASND LAYVAQYffNQ TGYDLffEEVD GSSFFTIAVS HRALVEGAALAKRLNQTVGD
[0018]241YSSVASQILC FQQSFffTGSY IDSNINLVHD VNRTGKDANS ILASIHVFDPEAACDDSTFQ
[0019]301PCSSYALANH KAVVDSFRNL YSVNDGIKKG SAVAIGRYLC TLAAAEQLYDALYQffQKQGS
[0020]361LNITSISLDF FRDFDSSVNT GTYPSSSDTY ASLTKAIKTY ADGFVSIVQKYTPDNGALSE
[0021]421QFSKVNGSQT SAIDLTffSYA AFLTAASRRN GTMGPSffGAS QANSVPSSffATTTLKGTYKA
[0022]48IAMVTSffPTGL VSKNSSSSAT GTATGSASAS TTSKSAANPG AAGAMMASGYGGNQLTFAFL
[0023]541SILFLYLIF*`[0024]其中，该酶蛋白全长549个氨基酸和一个终止密码子，N端21个氨基酸为信号肽序列 “MLVKPLLSQVALLAVSLGASA”。
[0025]因此，成熟的糖化酶GA II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2:
[0026]1ESLVTRASDL NAFIASESDI ALRGVLANIG PNGKAVPGAD AGlVVASPSKTNPDYffYTffT
[0027]61RDAALTFKYL IDRFVD⑶SS LQGLIQDYIS AQAKLQTVQNPS⑶LSSGAG LAEPKFYINE
[0028]I2ITAFLGQffGRP QRDGPALRAT ALIAYSQffLI DNGYSDVALSHVffPIASNDL AYVAQYffNQT
[0029]18IGYDLffEEVDG SSFFTIAVSH RALVEGAALA KRLNQTVGDYSSVASQILCF QQSFffTGSYI
[0030]241DSNINLVHDV NRTGKDANSI LASIHVFDPE AACDDSTFQPCSSYALANHK AVVDSFRNLY
[0031]301SVNDGIKKGS AVAIGRYLCT LAAAEQLYDA LYQffQKQGSLNITSISLDFF RDFDSSVNTG
[0032]361TYPSSSDTYA SLTKAIKTYA DGFVSIVQKY TPDNGALSEQFSKVNGSQTS AIDLTffSYAA
[0033]421FLTAASRRNG TMGPSffGASQ ANSVPSSffAT TTLKGTYKAAMVTSffPTGLV SKNSSSSATG
[0034]481TATGSASAST TSKSAANPGA AGAMMASGYG GNQLTFAFLSILFLYLIF*
[0035]成熟蛋白由528个氨基酸和一个终止密码子组成，理论分子量为56.4kDa，该酶属于糖基水解酶第15家族。将推导出的糖化酶氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现是一种新的糖化酶。
[0036]本发明提供了编码上述耐热糖化酶的基因。
[0037]该酶基因全长1858bp，序列如SEQ ID N0.3所示:
[0038]1ATGTTGGTCA AGCCATTGTT GTCTCAGGTC GCCCTGCTGG CGGTCTCCTTGGGTGCCTCG
[0039]61GCAGAGTCGT TGGTGACACG AGCTTCCGAT CTGAATGCCT TCATTGCGTCAGAATCAGAT
[0040]121ATCGCTCTGC GTGGCGTCTT GGCCAATATT GGCCCTAACGGAAAAGCCGT TCCGGGAGCA
[0041]181GATGCGGGCA TTGTGGTTGC CAGCCCATCC AAGACGAATCCTGACTGTGA GTAGATGTCG
[0042]241TAGATCCCAC TATTGCCATG CCAGATCTAG GACGCTAATCTAATCGCGCT CTTTCAAGAC
【权利要求】
1.一种糖化酶GA II，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1或2所示。
2.一种糖化酶基因ga II，其特征在于，编码权利要求1所述的糖化酶。
3.如权利要求2所述的糖化酶基因gaII，其特征在于，其基因序列如SEQ ID N0.3,4或5所示。
4.包含权利要求2所述糖化酶基因gaII的重组表达载体。
5.包含权利要求2所述糖化酶基因gaII的重组表达载体pPIC9-ga II。
6.包含权利要求2所述糖化酶基因gaII的重组菌株。
7.包含权利要求2所述糖化酶基因gaII的重组菌株GS115/ga II。
8.一种制备糖化酶GA II的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2)培养重组菌株，诱导重组糖化酶的表达； 3)回收并纯化所表达的糖化酶GAII。
9.根据权利要求2所述糖化酶基因gaII在工业化生产糖化酶中的应用。
10.根据权利要求1所述的种糖化酶`GAII的应用。
【文档编号】C12N9/34GK103667213SQ201310739004
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】姚斌, 罗会颖, 华慧芳, 石鹏君, 黄火清, 王亚茹, 柏映国, 杨培龙, 孟昆 申请人:中国农业科学院饲料研究所