合酶能够同 时展示出麦芽寡糖基海藻糖合成酶（比酶活：153U/mg)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（比酶 活：162U/mg)两种酶的活性，且融合酶的酶学性质与融合之前的两种酶相似（最适pH值均 在5. 5左右，最适温度均为50°C)，以500U/L的添加量在50°C下转化20%的淀粉乳液20小 时所得的海藻糖转化率可达8. 48%，到达相同转化率时间较双酶法相比节约了近4小时。
[0092] 实施例7 :表面展不融合酶的反复利用
[0093] 将发酵既得菌体用生理盐水洗涤3次，pH5. 5PBS缓冲液重悬，体系中加入终浓 度为20%的淀粉乳液，混匀后置于50°C恒温水浴震荡摇床中反应20h，反应结束后，沸水浴 lOmin终止酶的转化反应。室温10000r/min离心lOmin，取上清进行HPLC检测转化体系中 海藻糖含量。剩余反应液继续6500r/min离心lOmin重复以上处理步骤，再次测酶活，转化 率达到6. 37%，重复利用率可以达到75%。
[0094] 由以上结果可以看出，利用可以表面展示海藻糖合酶的毕赤酵母为全细胞催化剂 转化淀粉乳液可以循环利用，每次转化会有酶活损失，但是循环利用率可以达到75 %。
【主权项】
1. 一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 以Arthrobacter sp. L77基因组为模板，Fl和Rl为引物，通过PCR扩增，获得 MTSase基因片段； 所述Fl和Rl的核苷酸序列如下所示： Fl:GAATTCGTGTTGACACCGAAATCGACCTACC ； Rl ：CCTCGGGGGTGAACGTGC ； (2) Arthrobacter sp. L77基因组为模板，F2和R2为引物，通过PCR扩增，获得MTHase 基因片段； 所述Fl和Rl的核苷酸序列如下所示： F2:ATGAGTTCGCCATTCGAGGT ； R2:GCGGCCGCGTCGAGCAGGTGGATGGAGG ； (3) 将步骤（1)制得的MTSase基因片段与步骤（2)制得的MTHase基因片段经重叠PCR 扩增，电泳纯化，制得麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合酶目的基 因； 重叠PCR的上游引物为F2,下游引物为Rl ; (4) 酵母基因组提取试剂盒提取酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, CICC 32919) 基因组DNA为模板，F3和F4为引物，通过PCR扩增，获得产物3Pirlp基因片段； 所述F3和F4的核苷酸序列如下所示： F3 ：GGACTAGTCAGAGAGCCGCTGCTAT ； F4 ：GCTCTAGATTAACAGTTGAGCAAATCGAT ； (5) 将步骤（3)制得的麦芽寡糖基海藻糖合成酶-麦芽寡糖基海藻糖水解酶融合 酶目的基因经限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切后，与同样经限制性内切酶EcoR I 和Not I双酶切的pPIC-Z a A载体连接，制得异源表达载体pPIC-Z a A-MTSase-MTHase ; 将异源表达载体pPIC-Z a A-MTSase-MTHase经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切后， 与经限制性内切酶Spe I、Not I双酶切的Pirlp基因片段连接，制得异源表达载体 pPIC-Z a A-MTSase-MTHase-Pirlp ; (6) 将步骤（5)制得的异源表达载体pPIC-Z a A-MTSase-MTHase-Pirlp线性化后，采用 电转化法转化毕赤酵母GS115,经筛选，获得表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的重组 毕赤酵母。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中，制备MTSase基因片段的 PCR扩增体系如下： Hifi Mix 10yl，10 y M引物Fl 10yl，10 y M引物Rl 10ul，CldH2O 7 yl，Arthrobacter sp. L77 基因组模板 Template I y I ; 优选的，所述步骤（1)中，制备MTSase基因片段的PCR扩增程序如下： 95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，54°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，共 30 个循环；72°C 延伸10min，4°C保存。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中，制备MTHase基因片段的 PCR扩增体系如下： Hifi Mix 10 y 1，10 y M 引 物 F2 10 y 1，10 y M 弓| 物 R2 10 y 1，ddH20 7 y 1， Arthrobacter sp. L77 基因组模板 Template I y I ; 优选的，所述步骤（2)中，制备MTHase基因片段的PCR扩增程序如下： 95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C延伸 2min，共 30 个循环；72°C延 伸 10min，4°C 保存。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中，制备MTSase-MTHase融合 基因片段的重叠PCR扩增体系如下： Hifi Mix IOy 1，IOyM 引物 Fl IOy 1，IOyM 引物 R2 IOy 1，ddH20 7 yl，MTSase 基 因片段和MTHase基因片段I y 1 ; 优选的，所述步骤（3)中，制备MTSase-MTHase融合基因片段的重叠PCR扩增程序如 下： 95°C变性 5min ;95°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 2. 5min，5 个循环；然后，补 加引物Fl和R2 ;95°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸4. 5min，共30个循环；72°C延 伸 10min，4°C 保存。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)中，制备GenBank序列号为 D13740的目的基因Pirlp的PCR扩增体系如下： Hifi Mix 10yl，10yM 引物 F3 10yl，10yM 引物 F4 10yl，ddH20 7 yl，酿酒酵母基 因组模板Template I U 1 ; 优选的，所述步骤（4)中，制备GenBank序列号为D13740的目的基因Pirlp的PCR扩 增程序如下： 95°C预变性5min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，30个循环；72°C最终延 伸 10min，4°C 保存。6. 权利要求1所述方法制得的表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖 水解酶的重组毕赤酵母在制备海藻糖中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤如下： (i) 将表面展示麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的毕赤酵母接种 于含有浓度为40~60 y g/mL博来霉素的YH)培养基中，25~32 °C，200~300r/min的条 件下，培养14~20h，制得重组酵母种子； (ii) 将步骤（i)制得的重组酵母种子接种于BMGY培养基中，25~32°C，200~300r/ min的条件下，培养20~28h，离心，取菌体沉淀，接种于BMMY培养基中，22~28°C、200~ 300r/min条件下诱导表达144h，维持培养基中的甲醇质量浓度为0. 1%，收集菌体； (iii) 将步骤（ii)收集的菌体用生理盐水洗涤后，，使用PBS重悬，与淀粉乳液混匀反 应，制得海藻糖。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（i)和步骤（ii)中，接种量均为为 Iwt % ； 优选的，所述步骤（i)中，每升Yro培养基组分如下： 葡萄糖20g、蛋白胨20g，酵母抽提物20g，水定容至1000mL。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（ii)中，每升BMGY培养基组分如 下：酵母粉1(^，蛋白胨2(^，￥他13.48,0.1111 〇1/1?册.0磷酸缓冲液，甘油101^，加蒸馏水到 10OOmT,； 优选的，所述步骤（ii)中，每升BMMY培养基组分如下：酵母粉10g，蛋白胨20g，YNB 13. 4g，0.lmol/LpH6. 0磷酸缓冲液，加蒸馏水到lOOOmL。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤（iii)中，淀粉乳液质量浓度为 10~30% ;优选的，所述步骤（iii)中，反应转化条件为：40~55°C恒温震荡培养18~ 25h〇
【专利摘要】本发明涉及一种表面展示海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的方法与应用。本发明将来自Arthrobacter？sp.L77菌株的麦芽寡糖海藻糖基合成酶基因、麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因和来自酿酒酵母中共价连接细胞壁的Pirlp蛋白成熟肽基因进行克隆，连接至毕赤酵母分泌表达载体pPIC‐ZαA中，构建表面展示两种酶的重组质粒pPIC‐ZαA‐MTSase‐MTHase‐Pir1p。利用α‐factor信号肽将重组蛋白引导分泌至细胞表面，麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶与Pir1p蛋白融合展示于菌体表面，实现两种酶在毕赤酵母的表面展示，从而实现双酶法生产海藻糖的高效应用。
【IPC分类】C12R1/84, C12N15/62, C12P19/12, C12N15/81, C12N1/19
【公开号】CN105039191
【申请号】CN201510571619
【发明人】王腾飞, 王瑞明, 李梦悦, 陆奉勇
【申请人】齐鲁工业大学, 济南瑞丰生物工程有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年9月9日