TAA
[0132] 其氨基酸序列如下：
[0133] sigma32:
[0134] LRFNGSTQFFHRVLFQLAYTLSGNAVTVSQFLQRGLVVFVQPARTDDVLAAFVQTLHRVGQTVCRLLFP VIIFNAVGKVRFILQIEHRSHRLAVGIVVGRQVKGHVLCRHTFHLTYVFAGYAQFTGHHFDFILVKPAQTLLGFTQV EEQFALRFGGRNFDDTPVTQNVFVDLCFDPVNGE⑶QAHTHFRVETAHCFHQADVTFLNQIRLWQAIARIITSNMNN KPQVRQDQRFSCFQIAMVMQLFSQRPLLVSRQHRPRVSCPDVGIQVANWGSTLHFVSH
[0135] GroeL：
[0136] MAAKDVKFGNDARVKMLRGVNVLADAVKVTLGPKGRNWLDKSFGAPTITKDGVSVAREIELEDKFENM GAQMVKEVASKANDAA⑶GTTTATVLAQAIITEGLKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVTAAVEELKALSVPCSDSKAIAQ VGTISANSDETVGKLIAEAMDKVGKEGVITVEDGTGLQDELDVVEGMQFDRGYLSPYFINKPETGAVELESPFILLA DKKISNIREMLPVLEAVAKAGKPLLIIAEDVEGEALATLVVNTMRGIVKVAAVKAPGFGDRRKAMLQDIATLTGGTV ISEEIGMELEKATLEDLGQAKRVVINKDTTTIIDGVGEEAAIQGRVAQIRQQIEEATSDYDREKLQERVAKLAGGVA VIKVGAATEVEMKEKKARVEDALHATRAAVEEGVVAGGGVALIRVASKLADLRGQNEDQNVGIKVALRAMEAPLRQI VLNCGEEPSWANTVKGGDGNYGYNAATEEYGNMIDMGILDPTKVTRSALQYAASVAGLMITTECMVTDLPKNDAAD LGAAGGMGGMGGMGGMM
[0137] GroeS：
[0138] MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFND GYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEA
[0139] DnaK：
[0140] MGKIIGIDLGTTNSCVAMDGTTPRVLENAE⑶RTTPSIIAYTQDGETLVGQPAKRQAVTNPQNTLFAI KRLIGRRFQDEEVQRDVSIMPFKIIAADNGDAWVEVKGQKMAPPQISAEVLKKMKKTAEDYLGEPVTEAVITVPAYF NDAQRQATKDAGRIAGLEVKRIINEPTAAALAYGLDKGTGNRTIAVYDLGGGTFDISIIEIDEVDGEKTFEVLATNG DTHLGGEDFDSRLINYLVEEFKKDQGIDLRNDPLAMQRLKEAAEKAKIELSSAQQTDVNLPYITADATGPKHMNIKV TRAKLESLVEDLVNRSIEPLKVALQDAGLSVSDIDDVILVGGQTRMPMVQKKVAEFFGKEPRKDVNPDEAVAIGAAV QGGVLTCDVKDVLLLDVTPLSLGIETMGGVMTTLIAKNTTIPTKHSQVFSTAEDNQSAVTIHVLQGERKRAADNKSL GQFNLDGINPAPRGMPQIEVTFDIDADGILHVSAKDKNSGKEQKITIKASSGLNEDEIQKMVRDAEANAEADRKFEE LVQTRNQGDHLLHSTRKQVEEAGDKLPADDKTAIESALTALETALKGEDKAAIEAKMQELAQVSQKLMEIAQQQHAQ QQTAGADASANNAKDDDVVDAEFEEVKDKK
[0141] DnaJ：
[0142] MAKQDYYEILGVSKTAEEREIRKAYKRLAMKYHPDRNQGDKEAEAKFKEIKEAYEVLTDSQKRAAYDQY GHAAFEQGGMGGGGFGGGADFSDIFGDVFGDIFGGGRGRQRAARGADLRYNMELTLEEAVRGVTKEIRIPTLEECDV CHGSGAKPGTQPQTCPTCHGSGQVQMRQGFFAVQQTCPHCQGRGTLIKDPCNKCHGHGRVERSKTLSVKIPAGVDTG DRIRLAGEGEAGEHGAPA⑶LYVQVQVKQHPIFEREGNNLYCEVPINFAMAALGGEIEVPTLDGRVKLKVPGETQTG KLFRMRGKGVKSVRGGAQGDLLCRVVVETPVGLNERQKQLLQELQESFGGPTGEHNSPRSKSFFDGVKKFFDDLTR
[0143] 实施例3分子伴侣共表达对海藻糖合酶产量的影响
[0144] 1、含有海藻糖合酶基因和分子伴侣基因的重组大肠杆菌的构建
[0145]提取实施例2步骤5构建的pCS27-sigma32, pCS27-GroeL-GroeS， pCS27_DnaK_DnaJ，pCS27-sigma32-GroeL_GroeS，pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ， pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ和pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ，并且将这七 种含有分子伴侣的质粒分别和含有海藻糖合酶的质粒共同热激转化到大肠杆菌感受态细 胞，混匀，后续方法同实施例1。
[0146] 2、海藻糖合酶在重组大肠杆菌中高表达
[0147] 将上述转化物涂布于固体平板（含50yg/mL硫酸卡那霉素和100yg/mL氨苄青 霉素），于37°C，培养过夜，至平板上长出菌落。分别挑取上述七种不同平板上的单菌落， 接种于装有4mLLB的试管中（含50yg/mL硫酸卡那霉素和100yg/mL氨节青霉素），于 37°C。200rpm振荡培养过夜，再转接于装有50mLTB培养基（含50yg/mL硫酸卡那霉素和 100yg/mL氨苄青霉素）的250mL三角瓶中，于37°C，220rpm培养至0D6QQ为0. 6?0. 8。添 加IPTG至终浓度为0. 5mM/L，于16°C，180rpm继续培养30h。培养24h后取菌液置于50mL 离心管中，4°C，6000rpm离心lOmin，倒掉上清，收集菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最 佳收获时间。用SDS-PAGE电泳和酶反应后海藻糖产量检测重组蛋白的表达和酶活力。
[0148] 结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后SDS-PAGE电泳检测筛选出比原始 菌海藻糖合酶表达量高的七种重组菌，最高的可溶性蛋白量比实施例1中未共表达分子伴 侣的重组菌提高了 12倍（图3)。酶活力达到1504U，该表达量比实施例1中未共表达分子 伴侣的重组菌提高了 1.2倍。
[0149]3、可溶性蛋白表达量最高的重组大肠杆菌最适诱导表达条件的优化和鉴定
[0150]采用不同IPTG终浓度（0mM/L、0. 2mM/L、0. 4mM/L、0. 6mM/L、0. 8mM/L和 1. 0mM/L)、 不同诱导时间（0^1、1011、2011、3011、4011和5011)和不同诱导浓度（41：、81：、121：和16°〇对 步骤2获得的七种重组菌进行诱导表达。结果表明，最佳诱导表达条件为：诱导表达时间 24h，诱导温度16°C，诱导剂IPTG终浓度为0. 5mM/L，酶活力达到1504U。
[0151]4、海藻糖合酶酶学特性分析
[0152] (1)最适反应pH值的测定：将稀释好的酶液置于不同pH值（1. 0?10. 0)的缓冲 液中，测定海藻糖合酶的酶活。以pH初始7. 0的酶活为100%，其它pH下测得的酶活与之 相比，即得到该pH下的相对酶活。最适反应pH曲线见图5。
[0153] (2)金属离子对酶反应的影响：分别添加15mM/L不同的金属离子（Ca2+、Mn2+、Mg2+ 和Zn2+)到酶反应液中，测定海藻糖合酶酶活。以未添加金属离子的海藻糖合酶酶活为 100%，其它添加金属离子情况下测得的酶活与之相比，即得到该金属离子添加后的相对酶 活。添加金属离子对海藻糖合酶的影响见图6。
[0154] (3)还原剂对酶反应的影响：分别添加4mM/L不同的还原剂（抗败血酸Vc和二硫 苏糖醇DTT)到酶反应液中，测定海藻糖合酶酶活。以未添加还原剂的海藻糖合酶酶活为 100%，其它添加还原剂情况下测得的酶活与之相比，即得到该还原剂添加后的相对酶活。 添加还原剂对海藻糖合酶的影响见图7。
[0155] (4)最适反应温度：将粗酶液置于不同温度（401：、501：、601：和70°〇下反应，测 定海藻糖产量。最适反应温度曲线见图8。
[0156] (5)最适反应时间：将粗酶液置于不同反应时间（4h、6h、8h、10h、12h、14h)反应， 测定海藻糖产量。最适反应时间曲线见图9。
[0157] (6)最适底物浓度：将粗酶液置于不同麦芽糖底物浓度（10%、30%、60% )反应， 测定海藻糖产量。最适反应底物浓度曲线见图10。
[0158] 从图5?图10可以看出，Ca2+的添加使海藻糖合酶酶活对比对照菌提高了 19%。 但是Mg2+、Mn2+和Zn2+强烈地降低海藻糖合酶的酶活。还原剂Vc和DTT都提高了海藻糖合 酶的酶活，分别对比对照菌提高了 9%和41 %。该重组海藻糖合酶的最适pH为9. 0,最适反 应温度为50°C，最适反应时间为10h，最适底物反应浓度为10%。
【主权项】
1. 一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法，其特征在于，包括如下 步骤： (1) 嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达 将嗜热细菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设 计的引物为：上游引物 22tttreSNcoF :5' -GGGAAACCATGGGTGGACCCCCTCTGGTACAAG-3'，22tt treSSalR:5' -GGGAAAGTCGAC GGCTTTTCCGGCCTTGGC-3' ； PCR反应体系为50yL :嗜热细菌基因组模板DNA 1 yL，上下游引物各2yL，dNTP Mix 3 y L,2XPrimeSTAR GC Buffering 25 y L, DMSOO. 75 y L, ddH20 15. 65 y L, PrimeSTAR 0? 6 y L ;PCR 反应条件为 98°C预变性 lmin，进行 98°C 12s，65°C 10s，72°C 2min54s，共 9 个循 环，然后进行98°C 12s，57°C 30s，72°C 2min54s，共21个循环，最后72°C延伸3min ;切胶回收 PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-tttreS 质粒并实现其在大肠杆菌中的表达； (2) 分子伴侣 sigma32，GroeL，GroeS，DnaK 和 DnaJ 基因的克隆及 pCS27_sigma32， pCS27-GroeL-GroeS， pCS27-DnaK-DnaJ， pCS27-sigma32-GroeL-GroeS， pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ， pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ 和 pCS27-sigma32-GroeL-Gro eS-DnaK-DnaJ重组质粒的构建； (3) 共表达分子伴侣sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ诱导表达海藻糖合酶 分另IJ 将 pET-22b-tttreS 和 pCS27-sigma32、pCS27-GroeL-GroeS、 pCS27-DnaK_DnaJ、pCS27_sigma32-GroeL_GroeS、pCS27_sigma32-DnaK_DnaJ、 pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL-GroeS-DnaK_DnaJ 转化到大肠杆菌 Rosetta(DE3)中，诱导表达海藻糖合酶。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤（3)中，使用的七种分子伴侣为 pCS27-sigma32、pCS27-GroeL-GroeS、pCS27-DnaK-DnaJ、pCS27-sigma32-GroeL-GroeS、 pCS27-sigma32-DnaK_DnaJ、pCS27-GroeL-GroeS-DnaK-DnaJ 和 pCS27-sigma32-GroeL-Gro eS-DnaK-DnaJ，表达条件是：诱导时间10?50h，诱导温度4?16°C，诱导剂IPTG终浓度为 0 ?1. OmM/L。
【专利摘要】本发明公开了一种分子伴侣共表达提高海藻糖合酶基因表达水平的方法。本发明运用分子生物学技术在表达嗜热细菌海藻糖合酶的重组大肠杆菌中转化含有海藻糖合酶基因的pET-22b-tttreS质粒和含有sigma32、GroeL、GroeS、DnaK和DnaJ单独地或随机组合的质粒，使海藻糖合酶和分子伴侣实现共表达。在三种分子伴侣联合使用的作用下，增加了外源蛋白可溶性表达量。本发明将海藻糖合酶和分子伴侣共表达，提高了海藻糖合酶的表达水平。
【IPC分类】C12N15-70, C12N9-10
【公开号】CN104593400
【申请号】CN201510015409
【发明人】袁其朋, 李妍
【申请人】北京化工大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月12日