一种高L-天冬氨酸α羧化酶活性的工程菌及其在生产β-丙氨酸中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高L-天冬氨酸a羧化酶活性的工程菌及其在生产0 -丙氨酸中 的应用。
【背景技术】
[0002] 0 -丙氨酸（0-alanine),即3-氨基丙酸（3-aminopropanoic)，是自然界中唯一 存在的0型非蛋白氨基酸，丙氨酸是一种重要的生化原料，可以用于合成泛酸、肌肽、 帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料和食品领域有着十分广泛的应用。
[0003]目前0_丙氨酸的合成方法主要有化学法和生物法。
[0004] 化学法合成0丙氨酸主要有丙烯腈法、丙烯酸法及琥珀酰亚胺降解法。丙烯腈 法使用丙烯腈和氨水氨化反应生成3 -氨基丙腈，再在酸性或碱性条件下水解即得，该方 法原料易得、成本较低，但有副反应，且水解过程中生成大量无机盐，产物较难纯化。丙烯 酸法使用丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水氨化反应，在较高的温度和压力条件下得到 丙氨酸，合成工艺简单、收率高，但却需要高温高压。琥珀酰亚胺法是指将琥珀酰亚胺在 碱性氯酸钠溶液中发生降解得到0 -丙氨酸，该法的工艺条件要求苛刻，原料成本较高且 易发生其它副反应，不适合工业化。总之，化学合成法的原料、中间体有毒，同时反应条件比 较苛刻，要求高温高压，对环境污染严重。
[0005] 生物法合成P-丙氨酸，国内相关报道的主要有两种，一种是使用藤黄八叠球菌 将丙烯酸转化为0-丙氨酸(转化率为54%)，另一种是使用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主， 表达来源于大肠杆菌的L-天冬氨酸a羧化酶，最终产丙氨酸2. 94g/L，远远达不到工 业化的水平。
【发明内容】
[0006] 本发明通过筛选不同来源的L-天冬氨酸a羧化酶，构建了基因工程菌，通过酶活 比较，提供了一种高L-天冬氨酸a羧化酶活性的工程菌及其在生产丙氨酸中的应用。
[0007] 本发明提供的工程菌，其构建方法依次包括如下步骤：（1)将目的蛋白的编码基 因插入载体pET-30a(+)的多克隆位点，得到的重组质粒pET30-panDB ;所述目的蛋白如序 列表的序列6所示；（2)将步骤（1)得到的重组质粒pET30-panDB导入大肠杆菌BL21 (DE3)， 得到所述工程菌。
[0008] 所述目的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所 /_J、i〇
[0009] 所述重组质粒pET30-panDB具体可为在载体PET30的NdeI和KpnI酶切位点之 间插入所述目的蛋白的编码基因得到的重组质粒。
[0010] 本发明还保护所述工程菌在生产丙氨酸中的应用。所述应用具体可为以L-天 冬氨酸为底物生产丙氨酸。
[0011] 本发明还保护一种重组质粒，是将目的蛋白的编码基因插入载体pET-30a(+)的 多克隆位点，得到的重组质粒pET30-panDB ;所述目的蛋白如序列表的序列6所示。所述目 的蛋白的编码基因具体可如序列表的序列5所示或如序列表的序列4所示。本发明还保护 所述重组质粒在生产0-丙氨酸中的应用。
[0012] 本发明还保护一种生产丙氨酸的方法，包括如下步骤：以L-天冬氨酸为底物， 采用所述工程菌进行生物转化，得到丙氨酸。所述生物转化的条件可为37°C、450rpm。 所述生物转化的时间具体可为1-15小时。所述的方法中，所述工程菌通过如下方法扩大 培养：①挑取工程菌的单菌落，接种于l〇mL含50yg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37°C、 200rpm振荡培养12小时；②取步骤①得到的整个培养体系，接种于100mL含50iig/ml卡 那霉素的LB液体培养基，30°C、200rpm振荡培养12h，离心收集菌体。
[0013] 本发明中通过筛选不同来源的L-天冬氨酸a羧化酶，提供了一株高产丙氨 酸基因工程菌，该菌株可以稳定的高表达L-天冬氨酸a羧化酶，将L-天冬氨酸转化成 3 -丙氨酸，酶活达2. 09U/mL，转化15h后0 -丙氨酸的产量为178g/L，转化率达99%。
[0014] 采用本发明提供的方法制备P_丙氨酸，无需添加诱导剂，整个过程无需高温、高 压，同时具有条件温和、操作简单、对环境友好等优点，已达工业化应用水平。
【附图说明】
[0015] 图1为标准品溶液的HPLC图谱。
[0016] 图2为工程菌甲、工程菌乙、工程菌丙和工程菌丁进行步骤3得到的上清液的酶 活。
[0017] 图3为生物转化过程中转化体系中生成的0-丙氨酸浓度。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0019]载体pET_30a(+):Novagen公司。大肠杆菌BL21 (DE3) :Novagen公司。L-天冬氨 酸标准品：生工生物工程(上海）股份有限公司，产品编号AB0091CAS (56-84-8)。0 -丙氨 酸标准品：生工生物工程(上海）股份有限公司，产品编号A6168CAS (107-95-9)。
[0020] 实施例1、重组质粒和工程菌的构建
[0021] 序列表的序列1所示的双链DNA分子即大肠杆菌BL21(DE3)中L-天冬氨 酸a-羧化酶的编码基因。序列表的序列2所示的双链DNA分子即谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacteriumglutamicum)中L-天冬氨酸a-羧化酶的编码基因。序列表的序列 3所不的双链DNA分子即结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)中L-天冬氨酸 a-羧化酶的编码基因。序列表的序列4所示的双链DNA分子即枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)中L-天冬氨酸a-羧化酶的编码基因。
[0022] 一、工程菌甲的构建
[0023] 1、重组质粒pET30_panDE的构建
[0024] (1)合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
[0025] (2)以步骤（1)合成的双链DNA分子为模板，用Ec-pand-for和Ec-pand-rev组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0026] Ec-pand-for：5, -GGCTTCCATATGATTCGCACGATGCTGC-3'；
[0027] Ec-pand-rev：5, -TTACGGGGTACCTCAAGCAACCTGTACCGGAA-3'。
[0028] (3)用限制性内切酶NdeI和KpnI双酶切步骤（2)的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0029] (4)用限制性内切酶NdeI和KpnI双酶切载体pET_30a(+)，回收约5300bp的载 体骨架。
[0030] (5)将步骤（3)的酶切产物和步骤（4)的载体骨架连接，得到重组质粒 pET30-panDE。根据测序结果对重组质粒pET30-panDE进行结构描述如下：在载体 pET-30a(+)的NdeI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列1自5'末端第4至381 所示的双链DNA分子。
[0031] 2、工程菌甲的构建
[0032]将重组质粒pET30-panDE导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到的重组菌即为工程菌甲， 又称工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET30-panDE。
[0033] 二、工程菌乙的构建
[0034] 1、重组质粒pET30_panDG的构建
[0035] (1)合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0036](2)以步骤（1)合成的双链DNA分子为模板，用cg-pand-for和cg-pand-rev组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0037]cg-pand-for：5, -GGCTTCCATATGCTGCGTACCATCCTG-3'；
[0038] cg-pand-rev：5, -TTACGGCTCGAGTCAAATACTACGGCTCGTCAGC-3'。
[0039] (3)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切步骤（2)的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0040] (4)用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切载体pET_30a(+)，回收约5300bp的载 体骨架。
[0041] (5)将步骤（3)的酶切产物和步骤（4)的载体骨架连接，得到重组质粒 pET30-panD。。根据测序结果对重组质粒pET30-panDC进行结构描述如下：在载体 pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2自5'末端第4至411 所示的双链DNA分子。
[0042] 2、工程菌乙的构建
[0043]将重组质粒pET30-panDC导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到的重组菌即为工程菌乙， 又称工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET30-panDc。
[0044] 三、工程菌丙的构建
[0045] 1、重组质粒pET30_panDM的构建
[0046] (1)合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
[0047] (2)以步骤（1)合成的双链DNA分子为模板，用mt-pand-for和mt-pand-rev组成 的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0048]mt-pand-for：5, -GGCTTCCATATGTTACGGACGATGCTG-3'；
[0049] mt-pand-rev：5,-TTACGGGGTACCCTATCCCACACCGAGCCG-3'。
[0050] (3)用限制性内切酶NdeI和KpnI双酶切步骤（2)的PCR扩增产物，回收酶切产 物。
[0051](4)用限制性内切酶NdeI和Kpn I双酶切载体pET-30a(+)，回收约5300bp的载 体骨架。
[0052] (5)将步骤（3)的酶