专利名称：：热稳定性提高的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶及其使用方法
技术领域：
：本发明主要涉及提高在升温条件下生长的植物的光合作用水平。更具体的说，本发明涉及提高光合酶即Rubisco活化酶的热稳定性。
背景技术：
：核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/力口氧酶(Rubisco)是光合作用过程中的一种重要的酶。这种酶在光合作用过程中将C02掺入到植物中。大气氧与C02竟争作为Rubisco的底物，引起光呼吸作用，使Rubisco成为光合作用中的限速步骤。Rubisco活化酶(RCA)是一种催化Rubisco的活化的蛋白质，而Rubisco的活化又通过弓j发光合碳还原和光呼吸碳氧化来调节光合作用。Rubisco活化酶催化核酮糖-l，5-二磷酸(RuBP)从Rubisco的释放。Rubisco上的新未占据部位现在就空着可结合C02和Mg、舌化剂以使光合作用进行。Rubisco光合酶还负责从Rubisco释放糖-磷酸抑制剂，从而恢复Rubisco催化活性。因此，如果Rubisco活化酶受损，Rubisco保持无活性，光合作用减慢。Rubisco活化酶对热不稳定，因此随着温度的升高其活性降低。结果，光合作用过程由于Rubisco活化的缺乏而减慢。Rubisco活化酶在升温条件下会变性，从而使它不能将无活性Rubisco转化成活性形式。拟南芥G4ra&Vfo/w/力含有两种RCA同种型(isoform)-^豆的热不稳定性同种型(RCA1)和长的相对热稳定性同种型(RCA2)，它们由pre-mRNA的交替剪接产生(Werneke等，1989，P/a"fCe〃1:815-825)。在高温气候中生长的作物档j朱会得益于光合作用水平的提高。因此，如果能使光合作用中的限速步骤更耐热，作物植林会更容易地在这些气候中生长。发明概述本发明涉及比天然Rubisco活化酶更具热稳定性的Rubisco活化酶衍生多肽。本发明的Rubisco活化酶衍生多肽在生长在升温条件下的植物中很大程度上(substantially)保持着活性。本发明还涵盖编码本发明多肽的核酸分子。除了本发明的Rubisco活化酶4汙生多肽外，还应认识到本发明还涵盖该多肽的变体，包括但不限于该多肽的任何很大程度上相似的序列、任何片段、类似物、同源物、突变体或修饰多肽。本发明所涵盖的变体在升温条件下至少部分上具有功能活性(即它们能够显示野生型Rubisco活化酶的一种或多种已知功能活性)。本发明还涵盖编码变体多肽的核酸分子。本发明还涵盖包含一种或多种本发明核酸的载体。本发明还涵盖包含本发明的多肽、核酸分子和/或载体的细胞。本发明还涉及包含本发明多肽、核酸分子和/或载体的转基因植物。该转基因植物能以本领域公知的任何方式表达转基因，所述方式包括但不限于组成型表达、发育调节表达、组织特异性表达等。本发明还涵盖从本发明的转基因植物获得的种子。附图简述图1A-1C:野生型RCA(RCA1)和热稳定性变体(183H12、301C7和382D8)的表征。(A)在25。C(白色)、40。C(灰色)和45。C(黑色)下处理后被活化酶活化之后的Rubisco活性。活化酶蛋白在指定温度下温育15分钟后，于25。C下进行测定。(B)Rubisco在25。C(白色)和40。C(灰色)的催化条件下的活化。(C)在指定温度下温育15分钟后于25。C下进行测定的活化酶蛋白的ATP酶活性。图2A-2D:Rubisco活化酶突变林(zlrca)在环境C02下的表征。(A)拟南芥野生型(iC4/iG4)、杂合(iC4/zJ"fl)和纯合(Aca/z^ca)植抹的叶子的免疫印迹分析。印迹用抗重组拟南芥RCA1多克隆抗体进行免疫装饰(immunodecorated)。(B)用荧光图像分析测出的三周龄野生型(上)和Jrca(下)植林的光合作用性能。(C)(B)所述的植抹(每种表现型50林植林)在指定周龄下的叶子面积。(D)八周龄野生型(上)和(下)植抹的照片。图3A-3C:z/rca突变林的分子表征。(A)野生型(AC4)和缺失型(z^ca)等位基因的示意图。各数字表示各RCA外显子。标示了用以扩增7C4及zJm等位基因的1.4kbPCR产物的正向和反向引物，分别为RCAf和RCAr及rcaf和rcar。(B)表达183H12的Tl植林的PCR分析(RCA引物-上小图；rca引物-下小图)。标示了株系编号(上方)和遗传背景(下方)。(C)(B)中所述各株系的叶子的总蛋白质(5jig/泳道)的蛋白质印迹分析。印迹用抗重组RCA1多克隆抗体进行#:测。图4A-4D:表达RCA1和热稳定性变体183H12、301C7和382D8的各zl"a突变林在正常生长条件下(22。C)的功能互补。各数字表示各独立转化事件的抹系标号。(A)三周龄叶子的总蛋白质的免疫印迹分荧光图像分析监测出的上述各植林(8-10林植抹/独立林系)的光合作用性能。(D)暂时(l小时)适度热应激处理对表达RCA1和热稳定性变体的Aca转基因林系的光合作用速度的影响。每种株系四株独立植林的净光合作用是用红外气体分析4义在22。C(白色)和30。C(灰色)下进行监测。图5A-5F:适度热应激(每天30。C处理4小时)对表达RCA1或热稳定性变体1S3H12、301C7和382D8的野生型植林和zlrca突变林的影响。(A)各植抹的照片显示RCA变体介导的差异生长速度。(B)用荧光图像分析系统分析出的每抹系8-10抹独立植抹的叶子面积。平均数后带相同字母者为采用保护最小显著差数法(LSD)没有达到显著性差异(P-0.05)。(C)在30°C下2小时后通过气体交换分析监测出的各选定林系的四抹独立植株的净光合作用。(D)(C)中所述的成熟植林(8周龄)的照片。(E)每抹植林的长角果数量。每个抹系分析了8-10林独立植林。(F)从选定林系(每个抹系5株独立植抹)收获的种子的种子重量/1000颗种子。图6A-6D:26。C热应激对表达RCA1和热稳定性变体183H12的野生型植株和Aca突变抹系的发育和产量的影响。(A)每林植抹的长角果数量。每个林系分析了1(M2林独立植林。(B)在指定温度下生长的各选定林系的长角果的照片，显示了长角果大小和结实率的变化。棒条=0.5cm。(C)(A)中描述的各植林收获的种子的种子重量/1000颗种子。(D)在22°C(白色)或26°C(灰色)下生长的拟南芥各植林收获的种子(每个抹系250颗种子)的发芽率(22。C)。发明详述本发明提供衍自Rubisco活化酶的多肽。本发明还提供编码本发明多肽的核酸分子。本发明还涵盖使用本发明多肽和核酸来提高植物的耐热性的方法，所述方法包括增强Rubisco活化酶的热稳定性。本发明的多肽本发明涉及比天然Rubisco活化酶更具热稳定性的Rubisco活化酶衍生多肽。在优选的实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽是SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一个。本发明的多肽还涵盖由任何本发明Rubisco活化酶衍生核酸编码的那些多肽。除了本发明的Rubisco活化酶衍生多肽外，还应认识到本发明还涵盖该多肽的变体，包括但不限于该多肽的任何很大程度上相似的序列、任何融合多肽、任何片段、类似物、同源物、突变体或修饰多肽。本发明所涵盖的变体在升温条件下至少部分上具有功能活性(即它们能够显示野生型Rubisco活化酶的一种或多种已知功能活性)。这种功能活性包括4旦不限于生物活性，如对Rubisco的活化；抗原性，即结合或者与野生型Rubisco活化酶(包括但不限于SEQIDNO:2)竟争结合抗Rubisco活化酶抗体的能力；免疫原性，即产生能结合野生型Rubisco活化酶多肽的抗体的能力。在优选的实施方案中，变体具有至少一种很大程度上类似于或优于其亲本多肽(即未改变的Rubisco活化酶衍生多肽)的功能活性。正如本文所用的那样，变体的功能活性如果在亲本多肽的一个标准偏差之内，则认为变体"很大程度上类似于"亲本多肽。在一个实施方案中，本发明涵盖这样的多肽，其在升温条件下具有Rubisco活化酶的至少一种功能活性(例如Rubisco活化)，且与SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一个的多肽序列有至少85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。在具体的实施方案中，本发明的这种多肽当其序列与SEQIDNO:2进行最佳比对时，在对应于SEQIDNO:2的残基42、130、131、168、257、274、293和310的位置中有一个以上、两个以上、五个以上或者七个以上位置发生改变。就与参考序列进行最佳比对的氨基酸序列来说，某个氨基酸"对应于"参考序列中的与该残基在比对中配对的那个位置。正如本文所用的那样，在将某序列定义为与参考序列有"至少X%同一性"的情况中，例如"某多肽与SEQIDNO:4有至少95%同一性"，应认识到"X。/。同一性"是指绝对同一性百分数，除非另有指明。术语"绝对同一性百分数"是指这样测出的序列同一性百分数:将完全相同的氨基酸或核酸(nucleicacid)计为1分，将任何置换计为0分，而不管错配氨基酸或核酸的相似性如何。在典型的序列比对中，两个序列的"绝对同一性百分数"以氨基酸或核酸"同一性"的百分数表示。在两个序列的最佳比对操作需要在其中一个序列或同时在两个序列插入空隙的情况中，出于测定同一性百分数的目的，将一个序列中与另一个序列中的空隙配对的氨基酸残基认为是错配。空隙可以是内部空隙，或者是外部空隙，即截短。可例如使用ClustalW程序(版本1.8,1999年6月)以默认参数容易地测定出绝对同一性百分数(Thompson等，1994,iVwcZ&cJc/A及e腦rc/22:4673-4680)。在另一个实施方案中，本发明涵盖包含Rubisco活化酶衍生多肽或其变体的融合多肽。在一个具体的实施方案中，将某个肽(如美国专利申请系列号11/150,054中公开的那些肽)力口到本发明的多肽上，据此该肽指导其所连接的多肽定位到植物质体(plalstid)或植物光合作用器官。在另一个实施方案中，本发明涵盖Rubisco活化酶衍生多肽的片段。本发明涵盖这样的多肽，其在升温条件下具有Rubisco活化酶的至少一种功能活性(例如Rubisco活化)，且是SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一个的长度中的至少25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或380个连续氨基酸。在优选的实施方案中，编码多肽片段的多核苷酸能在严格条件下与编码SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的任一个的核酸杂交。在一个具体的实施方案中，本发明的片段对应于Rubisco活化酶的某功能域，包括但不限于ATP结合域和底物相互作用域(参见例如Li爭，(2005)/历o/C7zem280:24864-24869;Salvucci等，(1994)所oc/7簡.考33:14879-14886和vandeLoo等，(1996)肠cA麵.勿35:8143-8148)。在另一个实施方案中，本发明涵盖多肽类似物。多肽类似物可具有已被修饰的残基，即通过将任何类型的分子共价连接到Rubisco活化酶^[汙生多肽进行修饰。本发明的多肽类似物可例如但不限于通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接等进行修饰。本发明的多肽类似物可用本领域技术人员公知的技术通过化学修饰加以修饰，所述技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，本发明的多肽的类似物可含有一个以上非典型氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽不是SEQIDNO:2。在本发明的又一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽不是天然野生型多肽。本发明还提供例如通过重组手段产生本发明多肽的方法。本发明的核酸分子本发明还涉及编码Rubisco活化酶衍生多肽的核酸分子。在优选的实施方案中，Rubisco活化酶衍生核酸分子是SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一个。本发明的核酸分子还涵盖编码本发明的任何Rubisco活化酶衍生多肽的那些核酸分子。除了编码Rubisco活化酶衍生多肽的核酸分子外，应认识到本发明的核酸分子还涵盖编码Rubisco活化酶衍生多肽的变体多肽的那些核酸分子，所述变体包括但不限于Rubisco活化酶衍生多肽的任何很大程度上类似的序列、任何融合多肽、任何片段、类似物、同源物、突变体或修饰多肽。本发明所涵盖的核酸分子变体编码这样的多肽，其在升温条件下至少部分上具有功能活性(即它们能够显示野生型Rubisco活化酶的一种或多种已知功能活性)。在一个实施方案中，本发明涵盖这样的核酸分子，其与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21的核酸分子中的任一个有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。在具体的实施方案中，本发明的这种核酸分子编码这样的多肽，其核香酸序列当与SEQIDNO:2进行最佳比对时，在对应于SEQIDNO:2的残基42、130、131、168、257、274、293和310的位置中有一个以上、两个以上、五个以上或者七个以上位置发生改变。为测定两个核酸分子的同一性百分数，将两序列出于最佳比较目的进行比对(例如，可在第一核酸分子的序列中引入空隙，以^更与第二核酸分子进行最佳比对)。然后对相应核苷酸位置处的核苷酸进行比较。当第一序列中的某个位置被与第二序列中的相应位置的核苷酸相同的核苷酸占据时，则两个分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分数是这两个序列所共有的相同位置数的函数(即°/。同一性=相同重叠位置数/总位置数X100%)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。两个序列之间的同一性百分数的测定也可用数学算法来完成。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例，是Karlin和Altschul的算法(Karlin和Altschul，(1990)iVoc.淑/.v4cad87:2264-2268，在Karlin和Altschul，(1993)尸rac.扁.<SW.卯:5873-5877中作了修正)。这种算法被并入到NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等，(1990)JMo/.B/o/.215:403和Altschul爭，(1997)iVwc/e/c^cW/as.25:3389-3402)。用以进行BLAST分析的软件是可公开获得的，例如通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)获得。该算法涉及到首先通过鉴定查询序列(querys叫uence)中的长度W的短字(shortword)来鉴定高分序列对(highscoringsequencepair,HSP)，所述短字当与数据库序列中的相同长度的字比对时匹配或满足某一正阈值(positive-valuedthresholdscore)T。T称为邻近字阈值(Altschul等，同上)。这些初始邻近字命中(heighborhoodwordhit)充当用以启动查找含有它们的更长HSP的搜索的种子。然后将字命中沿每个序列向两个方向延伸至累积比对分数(cumulativealignmentscore)能得到最大程度的增加。累积分数的计算，对于核苷酸序列是使用参数M(—对匹配残基的奖分；总是>O)和N(错配残基的罚分；总是<0)。对于多肽，使用记分矩阵(scoringmatrix)来计算累积分数。字命中在每个方向上的延伸当出现以下情况时中断:累积比对分数偏离其最大实现值(maximumachievedvalue)达数值X;累积分数因一个以上负分残基比对的累积而变为0或0以下；或者达到了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTO程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、截断值100、M=5、N-4和两条链的比较作为默认设定。对于多肽，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62记分矩阵作为默认设定(参见Henikoff&Henikoff,(1989)/mS89:匪5)。也可使用ClustalV比对方法来确定同一性百分数(Higgins和Sharp，(1989)CL4S/OS5:151-153)，该方法存在于LASERGENE生物信息学计算包(bioinformaticscomputingsuite)(DNASTARInc.,Madison,WI)的Megalign程序中。"默认参数"是程序生产商预设定的参数，对于多序列比对来说它们对应于空隙罚分(GAPPENALTY)=10和空隙长度罚分(GAPLENGTHPENALTY)-10，而对于双序列比对来说它们是KTUPLE1、空隙罚分=3、WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。使用ClustalV程序进行了序列的比对后，查看该程序上的"序列距离(sequencedistance)，，表格，可以获得"同一性百分数，，。两个序列之间的同一性百分数可用与上述技术类似的技术，在允许或不允许空隙下进行测定。在计算同一性百分数时，通常只对精确匹配进行计凄t。在另一个实施方案中，本发明涵盖Rubisco活化酶衍生核酸分子的片段。本发明涵盖这样的核酸分子，其在升温条件下具有Rubisco活化酶的至少一种功能活性(例如Rubisco活化)，且是SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一个的长度中的至少100、250、500、750、950、1000或1100个连续核苷酸。在一个具体的实施方案中，本发明的片|殳对应于编码Rubisco活化酶的功能域的核酸分子，所述功能域包括但不限于ATP结合域和底物相互作用域(参见例如Li等，(2005)J历o/Ozem280:24864-24869;Salvucci等，(1994)肠c/z簡勿33:14879-14886和徵deLoo等，(1996)肠c/z麵'勿35:8143-8148)。在另一个实施方案中，本发明涵盖能在严格条件下与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中的任一个杂交的核酸分子。词语"严格条件"是指某核酸会与通常存在于核酸的复杂混合物中的其靶核酸杂交、而基本上不会与其它核酸杂交的条件。严格条件具有序列依赖性，在不同情况下将会不同。较长的核酸尤其要在较高温度下杂交。本领域有关于核酸杂交的详尽指导(例如Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucldcProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993))。通常，高严格条件选定为比特定核酸在确定的离子强度pH下的热熔点(TJ低约5-10°C。低严格条件通常选定为比Tm低约15-30。C。Tm是50%的靶核酸互补探针与靶核酸处于杂交平衡时的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶核酸过量存在，在Tm下有50%的探针处于占据平衡中)。杂交条件通常是这样的条件在pH7.0-8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子浓度、通常为约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，温度对于短探针(例如10-50个核苷酸)为至少约30。C，对于长探针(例如大于50个核苷酸)为至少约60。C。严格条件也可通过添加去稳定剂如曱酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少两倍于背景杂交，优选10倍于背景杂交。词语"特异性杂交"是指当特定的核苷酸序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，某分子在严格杂交条件下只与该序列发生结合、双链化或杂交。在本发明的另一个实施方案中，Rubisco活化酶书t生核酸分子不是SEQIDNO:1。在本发明的又一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生核酸分子不是天然野生型核酸分子。本发明还涵盖包含本发明核酸分子的载体。本发明还涵盖包含本发明载体的细胞或植物。术语"核酸分子，，在本文中是指从5，末端向3'末端阅读的、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基组成的单链或双链聚合物。它包括染色体DNA、自我复制质粒和主要执行结构作用的DNA或RNA。Rubisco活4H酶书于生序列本发明的Rubisco活化酶衍生多肽和核酸分子可通过向野生型(wt)Rubisco活化酶(包括但不限于拟南芥Rubisco活化酶(SEQIDNO:2))中引入一个以上残基置换、添加和/或缺失来产生。通常，产生Rubisco活化酶衍生多肽，以将野生型Rubisco活化酶多肽的适宜特性加强，或者将不适宜的特性减少。在一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽的热稳定性比野生型Rubisco活化酶有提高。在另一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽在升温条件(例如40。C)下的酶活性类似于或高于野生型Rubisco活化酶在正常条件(例如25。C)下的酶活性。在一个实施方案中，用野生型Rubisco活化酶核酸分子(例如SEQIDNO:l)作为模板来产生Rubisco活化酶衍生核酸分子。在一些实施方案中，将编码一个以上这样的氨基酸残基的核酸残基加以改变，使得受编码氨基S吏发生改变，所述氨基酸残基在将核苷酸序列与SEQIDNO:2进行最佳比对时发现对应于SEQIDNO:2的残基42、130、131、168、257、274、293和310。可通过标准的冲支术？1入序列变更(sequencealteration)，所述技术如定向分子进化技术，例如DNA改组方法(参见例如Christians等，(1999)Atowe说o^c/z"o/ogy17:259-264;Crameri等，(1998)A^we391:288-291;Crameri等，(1997)A^w"所0&c/7"0/0gy15:436-438;Crameri等，(1996)A^fwe14:315-319;Stemmer,(1994)A/^we370:389-391;Stemmer等，(1994)户rac.iVa"jcac/.91:10747-10751;美国专利5,605,793、6,117,679、6,132,970、5，939,250、5,965,408、6,171,820;国际公开说明书WO95/22625、WO97/0078、WO97/35966、WO98/27230、WO00/42651和WO01/75767);定点诱变(参见例如Kunkel，(1985)TVoc.A^/.JcadSc/.82:488-492;Oliphant等，(1986)G認44:177-183);寡核苷酸定向诱变(参见例如Reidhaar陽01son等，(1988)5We"ce241:53-57);化学诱变(参见例如Eckert等，(1987)Mwtaf.178:1-10);易错PCR(参见例如Caldwell&Joyce,(1992)户CiMe&oA2:28-33)和盒式诱变(参见例如Arkin等，(1992)/Voc.A^/.Xo^.5W"89:7871-7815);(主要参见例如Arnold,(1993)C群.飽ec/mo/.4:450-455;Ling等，(1997)^"a/.5/oc/em.，254(2):157-78;Dale等，(1996)iWo/.57:369-74;Smith,(1985)爿肌iev.19:423-462;Botstein等，(1985)5We聰，229:1193-1201;Carter,(1986)肠c/z置J237:1-7;Kramer等，(1984)Ce〃38:879-887;Wells等，(1985)G認34:315-323;Minshull等，(1999)CWre"f(9p/m.ow/"C72em/ca/5w/ogv3:284-290)。在一个实施方案中，用DNA改组来产生Rubisco活化酶衍生核酸分子。DNA改组可在体外(invitro)、在体内(invivo)、在计算机芯片上(insilico)或它们的组合来实现。在计算机芯片上的重组方法可这的各序列串(s叫uencestring)进行重组。所得的重组序列串任选例如通过同时采用寡核苷酸合成/基因重装配技术(oligonucleotidesynthesisgenereassemblytechnique)进4亍对应于重组序列的核酸的合成，来转变成核酸。这个方法能产生随机的、部分随机的或设计的变更。有关在计算机芯片上的重组的许多细节内容，包括遗传算法、遗传算子等在计算机系统中的使用，以及相应核酸及设计的核酸的组合的产生(例如基于交4^f立点选择(cross-oversitesdection》，还有i殳计的、々支随才几的或随机的重组方法，在本领域中都有描述(参见例如国际公开说明书WO00/42560和WO00/42559)。在另一个实施方案中，采用定向诱变，通过选择野生型Rubisco活化酶中的特定核苷酸序列或位置进行变更，来产生Rubisco活化酶衍生核酸分子。这种定向突变可在核酸中的任何位置引入，可以是保守突变或非保守突变。"非保守氨基酸置换"是其中氨基酸残基被具有不相似的侧链的某氨基酸残基置换的置换作用。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)、具有不带电极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸)、具有P-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。这种定向突变可以不是非保守氨基酸残基置换，而是保守氨基酸残基置换；或者这种定向突变除了可以是非保守氨基酸残基置换外，还可以是保守氨基酸残基置换。"保守氨基酸置换"是其中氨基酸残基被具有相似侧链的某氨基酸残基置换的置换作用。在诱变后，受编码蛋白质可以进行重组表达，并可测定该蛋白质的活性。在一些实施方案中，可作出置换，使得位置42处的氨基酸具有不带电极性侧链或(3-分支侧链，位置130处的氨基酸具有碱性侧链，位置131处的氨基酸具有非极性侧链或P-分支侧链，位置168处的氨基酸具有碱性侧链，位置257处的氨基酸具有非极性侧链或(3-分支侧链，位置274处的氨基酸具有碱性侧链，位置293处的氨基酸具有碱性侧链和/或位置310处的氨基酸具有酸性侧链。氨基酸位置可通过将受编码的Rubisco活化酶衍生多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:2进行最佳比对来确定。在另一个实施方案中，用随机诱变来产生Rubisco活化酶书1"生核酸分子。可在编码序列的整条链或一部分链上随机引入突变(例如通过饱和诱变)。在某些实施方案中，可将编码具有相似结构域、结构基序、活性位点，或者与野生型Rubisco活化酶的一部分比对时有错配或不完美匹配的其它相关多肽的核苷酸序列，用于诱变过程中以产生序列的多样性。应认识到，对于一些上述技术中的每个诱变步骤，可进行任一或所有步骤的多次重复循环，以使序列的多样性最优化。上述各方法可以以任何合宜的顺序进行组合使用。在许多情况下，上述方法产生一批(apoolof)改变的核酸序列或一批包含改变的核酸序列的重组宿主细胞。具有所需特性的改变的核酸序列或表达改变的核酸序列的宿主细胞，可通过用一种或多种本领域公知的测定进行筛选来鉴定。测定可在能选择具有所需物理或化学特性的多肽的条件下进行。核酸序列的变更可通过对克隆中的编码改变的多肽的核酸分子进行测序来确定。另外，Rubisco活化酶衍生核酸分子可在整体上或部分上进行密码子优化。由于任何一个氨基酸(除甲硫氨酸外)都是由多个密码子(表l)所编码，可将核酸分子的序列进行改变而不使所编码的氨基酸发生改变。当一个以上密码子在核酸水平上发生改变以符合或更好地接近特定宿主的密码子用法时，这就是密码子优化。宿主细胞所显示的优选密码子用法的频率，可通过求出该宿主细胞所表达的大量基因中的优选密码子用法的频率的平均值进行计算。这个分析可限定于该宿主细胞所高度表达的基因。美国专利5,824,864例如提供了双子叶植物和单子叶植物所显示的高度表达基因的密码子用法的频率。本领域普通技术人员会认识到，在本领域有提供多种生物的偏好信息的表格和其它参考资料可获得。测定Rubisco活化酶活性的方法
技术领域：
：本发明涉及与野生型Rubisco活化酶相比热稳定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽。本文所用的术语"热稳定性提高的"是指所述Rubisco活化酶衍生多肽与野生型Rubisco活化酶相比在升温条件下活化Rubisco的能力提高。在一个实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽在升温条件下(例如35。C或更高)的酶活性大于野生型Rubisco活化酶在升温条件下的酶活性。在另一个实施方案中，Rubisco活化酶^"生多肽在升温条件下(例如26°C或更高，对于体外测定更优选40。C)的酶活性很大程度上类似于或高于野生型Rubisco活化酶在正常条件下(例如20-25°C,对于体外测定更优选25°C,对于体内测定更优选22°C)的酶活性。本文所用的术语"很大程度上类似于"是指Rubisco活化酶衍生多肽的酶活性在野生型Rubisco活化酶的酶活性的一个标准偏差之内。可用本领域公知的任何方法测定Rubisco活化酶衍生多肽在升温条件下的活性(包括但不限于Rubisco活化和ATP水解)。在一些实施方案中，Rubisco活化酶^f汙生多肽活性在体外进^f亍测定。在一个实施方案中，可测定Rubisco活化酶衍生多肽在包含失活的Rubisco、RuBP、ATP和标记碳的来源(例如[C"]NaHC03)的溶液中温育时其活化Rubisco的能力。可监测标记碳向3-磷酸甘油酸(GPA)中的掺入情况，作为Rubisco活化的标志。在另一个实施方案中，可测定Rubisco活化酶衍生多肽在包含ATP的溶液中温育时其水解ATP的能力。在进行测定之前对Rubisco活化酶衍生多肽进行热处理，然后在升温条件下或在正常条件下进行测定。可以使用纯化的Rubisco活化用成分，也可使用包含Rubisco活化用成分的细胞。在其它的实施方案中，Rubisco活化酶衍生多肽活性在体内进行测定。可使不表达野生型Rubisco活化酶的植物(例如缺失突变林)表达一种或多种Rubisco活化酶衍生多肽，并可分析该植物在升温生长条件下的光合作用速度、生物量、生长速度和种子产量。该植物可完全在升温条件下生长，或者可在升温条件下生长较短时间。在一个实施方案中，光合作用速度是通过分析植物的C02固定进行测量。在另一个实施方案中，生长速度是通过分析植物的叶子面积进行测量。在另一个实施方案中，种子产量是通过测定成熟干燥植物的种子重量进行分析。在另一个实施方案中，种子产量是通过测定种子发芽率进行测定。增强植物的耐热'性的方法Rubisco活化酶能活化植物中的Rubisco。活化的Rubisco参与光合作用，它是光合作用过程中的限速步骤。随着Rubisco活化酶活性的下降，Rubisco保持无活性，光合作用减慢或停止。温度的升高会使Rubisco活化酶不稳定和/或变性，从而使该酶不太能够或不能够将无活性的Rubisco转化成活性形式。本发明涉及与野生型Rubisco活化酶相比热稳定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽。由此，在热稳定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽的参与下，光合作用过程可变得更具耐热氺生。可用本领域公知的任何方法促使植物表达本发明的一种或多种Rubisco活化酶衍生多肽。在一个实施方案中，可构建能表达本发明的一种或多种多肽的转基因植物。该转基因植物可在所有组织中表达本发明的一种或多种多肽(例如全局表达)。或者，本发明的一种或多种多肽可只在一部分(asubsetof)组织中表达(例如组织特异性表达)，肽可在植物中组成型表达，或者在可诱导启动子的控制下表达。在一些实施方案中，才直物的内源Rubisco活化酶的表达和/或活性:故降^氐或消除。重组表达本发明的核酸分子和多肽可用本领域公知的标准的重组DNA和分子克隆才支术《列^口Sambrook,Fritsch和Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,(1989))进行重组表达。另外，可使用重组DNA技术产生适合用于构建转基因植物的核酸构建物。因此，本发明的一个方面涉及包含本发明核酸分子或其变体的载体，优选表达载体。本文所用的术语"载体"是指能够转运已连接到其上的另一核酸的多核苷酸。一种类型的载体是"质粒"，它是指其中可引入另外的DNA区段的环形双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可引入到病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入到的宿主细胞中进行自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型载体)。其它的载体(例如非附加型载体)在引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组进行复制。一般来说，适用于重组DNA技术的表达载体往往为质粒(载体)的形式。但是，本发明有意包括其它形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒)。本发明的重组表达载体包含其形式适合于其在宿主细胞中的表达的本发明核酸分子。这意味着该重组表达载体包括一个以上根据待用来进行表达的宿主细胞而选择的调节序列，所述调节序列与待表达的多核苷酸发生可操作性结合(operablyassociated)。在重组表达载体当中，"可操作性结合"是指目的核苷酸序列以能使它得以表达的方式与调节序列连接(所述表达例如在体外转录/翻译系统中，或者当载体被引入到宿主细胞中时在宿主细胞中)。术语"调节序列"意指包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。这种调节序歹'J在本领域中有描述(例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology,(1990)AcademicPress,SanDiego,CA)。调节序列包括那些指导核苷酸序列在多种类型的宿主细胞中进行组成型表达的调节序列和那些指导核苷酸序列只在某些宿主细胞中进行表达的的调节序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员会认识到，表达载体的设计须取决于诸如以下因素；待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平、生物体中需要进行表达的部位等。可将本发明的表达载体引入到宿主细胞中，从而产生本文所述的核酸分子所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白和肽。在一些实施方案中，可将充当启动子或增强子元件的分离核酸引入到本发明多核苷酸的非异源形式(non-heterologousform)的适当位置(通常是上游)，以向上或向下调节本发明多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或置换对内源启动子进行体内改变(参见美国专利5,565,350;国际专利申请号PCT/US93/03868),或者可将分离的启动子以正确的方向和离本发明多核苷酸的关联基因(cognategene)正确的距离引入到植物细胞中，以控制基因的表达。可使基因表达在适合于植物生长的条件下得到调整，以改变本发明多肽在植物细胞中的总浓度和/或改变其组成。因此，本发明提供用以制备可操作性连接到(operablylinkedto)本发明多核苷酸的天然、内源(即非异源)形式的异源启动子和/或增强子的组合物和方法。如果需要进行多肽表达，通常需要在多核苷酸编码区的3'末端包括聚腺苷酸化区域。该聚腺苷酸化区域可衍自天然基因，衍自多种其它植物基因或者衍自T-DNA。待加入的3，末端序列可衍自例如胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或者衍自另一植物基因，或者较不优选地衍自任何其它真核生物基因。本发明的重组表达载体可设计成能在原核细胞(例如肠杆菌科(五她ra6a"m'ace—，如埃希氏菌属(E^c/zen'c/n'a);芽孑包杆菌科CSac/〃aceae);根瘤菌科(//z/zo6oceae)，如根瘤菌属(i/zZzc^'wm)和才艮瘤杆菌属(7/2/zoZ^cfe。；螺菌科(S;/n7/acefle),如发光细菌(photobacterium);发酵单月包菌属(Zymomo"os);妙、雷氏菌属(Serra&);气单月包菌属04eramo"w);弧菌属(P76ho);脱硫弧菌属(/)^"//0*^/0);螺菌属(S^n7/wm);乳杆菌科(Z^cto^d〃aceae);假单胞菌科(尸化W(iomowac/aceae),^口j叚单月包才干菌属(i^ew(iowowos)和醋#干菌属(Jceto^c&r);固氮菌科04zoto6o"eraceae)和硝化杆菌-牛(Mfrakzc&raceae))或真核细胞(例如昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中表达本发明多肽(有关合适的宿主细胞的讨^仑参见Goeddel，同上)。或者，可例如^f吏用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译重組表达载体。蛋白质在原核生物中的表达，往往是用包含指导融合蛋白或非融合蛋白的表达的组成型或可诱导型启动子的载体，在大肠杆菌中进行。融合载体将多个氨基酸加到在其中编码的蛋白质中，通常是加到重组蛋白质的氨基末端。这种融合载体通常起到至少以下三个目的l)增加重组蛋白质的表达；2)增加重組蛋白质的溶解性；和/或3)通过充当亲和纯化中的配体帮助重组蛋白质的纯化。通常，在融合表达载体中，将蛋白水解切割位点引入到融合部分(flisionmoiety)和重组蛋白质的接点(junction)，以使在融合蛋白的纯化之后重组蛋白能与融合部分分离开来。这种酶和它们的关联(cognate)识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith和Johnson,(1988)67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白融合到靶重组蛋白。在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用以在酿酒酵母(6".ce^WW"e)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)￡MB(9/6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)Ce//30:933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)(認54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorp.,SanDiego,CA)和pPicZ(InvitrogenCorp.,SanDiego,CA)。或者，表达载体是杆状病毒表达载体。可供在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)Mo/.CW/編,3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,(l卿)W油gy170:31-39)。在又一个实施方案中，使用植物表达载体，包括但不限于烟草花叶病毒和马铃薯病毒表达载体，将本发明的核酸分子在植物细胞中表达。其它用于原核细胞和真核细胞的合适的表达系统是本领域公知的(参见例如Sambrook等，(1990)MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版,ColdSpring'HarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY中的第16和17章)。有多种启动子可用于本发明的实施。可根据所需的结果来选^^启动子。可将核酸与组成型的、组织特异性的、可诱导型的或其它的启动子进行组合，以在宿主生物中表达。"组织特异性启动子"可指导本发明核酸在特定组织、器官或细胞类型中的表达。组织特异性启动子可以是可诱导型的。类似地，组织特异性启动子可只在该组织中的一定时框(timeframe)或发育阶^a内启动转录。其它的组织特异性启动子可在特定组织的整个生命周期内都有活性。本领域普通技术人员会认识到，组织特异性启动子可驱动被有效连接的序列在靶组织以外的组织中的表达。因此，本文所用的组织特异性启动子是这样的启动子，它优先在耙组织或细胞类型中驱动表达，但也可在其它的组织中导致一定的表达。有多种组织特异性启动子可用于本发明。任何器官都可用适当的启动子靶向，这些器官如出芽(shootvegetative)器官/结构(例如叶子、茎干和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉嚢和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实。例如，指导核酸分子在叶子中的表达的启动子和/或光合作用器官特异性启动子(如Khoudi等，(1997)197:343中所公开的朋CS启动子)可用于增强光合作用。另外，可通过将这样的肽加入到本发明的多肽来获得组织特异性表达，所述肽能指导被连接的多肽定位到光合作用器官(例如美国专利申请系列号11/150,054中公开的那些器官)。"组成型启动子"定义为能指导基因在所有组织中的表达，在大多数环境条件和发育或细胞分化状态下有活性的启动子。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区域、衍自根瘤土壤才干菌(^gr。6(3"en'wwmma/ade"力的T-DNA的l，-或2，隱启动子和本4贞i或普通技术人员公知的来自各种植物基因的其它转录起始区域。这种基因包括例如来自拟南芥的^CT"(Huang等，(1996)P/aWMo/.脂.33:125-139)、来自拟南芥的Cad(GenBank登录号U43147,Zhong等，(1996)Mo/.251:196-203)、来自油茱(5ra^z'ca"a/w力的編码硬脂酰-酰基载体蛋白去饱和酶的基因(Genbank登录号X74782，Solo麵be等，(1994)尸/a"f尸—'o/.104:1167-1176)、来自玉米的GPcl(GenBank登录号X15596，Martinez等,(1989)JMo/.編.208:551-565)和来自玉米的Gpc2(GenBank登录号U45855，Manjunath爭，(1997)/VaWMo/.Ao/.33:97-112)。任何强组成型启动子如CaMV35S启动子都可用于本发明多肽在整林植物中的表达。术语"可诱导型启动子"是指处在精确的环境或发育控制下的启动子。可影响可诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括绝氧条件、高温、光线的存在或者化学品/激素的施喷。用于植物宿主细胞的合适的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子和其它相关组成型启动子的核心启动子(国际7>开"^兌明书WO99/43838和美国专利6,072,050);核心CaMV35S启动子(Odell等，(1985)7Vaft^313:810-812);水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，(1990)尸/a"fCe//2:163-171);遍在蛋白启动子(Christensen等，(1989)尸/a"fAfo/.脂.12:619-632和Christensen等，(1992)P/a"rMo/.腺.18:675-689);pEMU(Last等，(1991)TTz，.勿/.81:581-588);MAS(Velten等，(1984)五MS(9J.3:2723-2730);ALS启动子(美国专利5,659，026)及其它(例如美国专利5，608，149、5，608,144、5，604，121、5,569，597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611)。本发明的另一个方面涉及已引入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"在本文中可互用。应认识到，该术语不仅指特定的受试者细胞，也指该细胞的子代或潜在子代。因为由于突变或环境影响的缘故在后续各代中可能出现某些变化，这种子代细胞实际上可能与亲本细胞不相同，不过它们仍包括在本文所用的该术语的范围内。因此，本发明提供具有包含本发明核酸分子或其变体的表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何真核细胞(例如大肠杆菌、苏云金芽孑包#干菌(5acz7/w^wn'wg/em/"或真才亥细月包(例如昆虫细月包、酵母或才直物细胞)。本发明还提供表达本发明的核酸分子从而制备所编码的多肽的方法，所述方法包括i)在能使所编码的多肽得以生产的条件下培养包含本发明核酸分子的细胞；和ii)分离所表达的多肽。载体DNA可通过常规的转化或转染技术引入到原核细胞或真核细胞中。本文所用的术语"转化"和"转染"意指多种本领域公认的用以将外来核酸分子引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钩或氯化4丐共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、根瘤土壤杆菌(^gro6a"en'wmfwne々cz'era)和真空、渗入。在本领域有合适的转化或转染宿主细胞的方法(例如Sambrook等，同上)。转基因植物的产生可采用任何本领域公知的方法，用本发明的核酸分子转化植物或植物细胞。可将核酸分子引入到植物DNA(例如基因组DNA或叶绿体DNA)中，或者保持不插入到植物DNA中(例如通过使用任何染色体)。合适的将核酸分子引入到植物细胞中的方法包括微注射(Crossway等，(1986)S/o&c/m^w^4:320-334);电穿孔(Riggs等，(1986)iVoc.^cac/.83:5602-5606;D'Halluin等，(1992)P/amCe〃4:1495-1505);土壤杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840;Osjoda等，(1996)Atowrej5/o&c/z"o/ogy14:745-750;Horsch等，(1984)We"ce233:496-498;Fraley等，(1983)尸rac.A^/.爿cad80:4803和7hms/er隱尸/a他，Potrykus,(编辑),Springer-Verlag，Berlin1995);直接基因转移(Paszkowski等，(1984)五M5C^3:2717-2722);弹道颗粒力口速(ballisticparticleacceleration)(美国专利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782;Tomes等，(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,PlantCell,Tissue和OrganCulture:FundamentalMethods,Gamborg和Phillips(编辑)，Springer曙Verlag，Berlin和McCabe等，(1988)所ofec/mo/ogy6:923-926);病毒介导的转化(美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5，316,931);花粉转化(DeWet等，(1985)TheExperimentalManipulationofOvuleTissues,Chapman等(编辑),Longman,NewYork,第197-209页)；Lec1转化(美国专利申请系列号09/435,054;国际公开说明书WO00/28058);颈须介导转化(whisker-mediatedtransformation)(Kaeppler等，(1990)P/a"fCW//印o^y9:415-418;Kaeppler等，(1992)T7zeor^p/.84:560-566);and叶绿体转化技术(Bogorad，(2000)7e油肠加/zwo/。gy18:257-263;Ramesh等，(2004)MeAo^Mo/B/o/.274:301-7;Hou等，(2003)Traragew'ci仏12:111-4;Kindle等,(1991)iVoc.扁.Jcac/.SW.88:1721-5;Bateman和Purton,(2000)Mo/Gew263:404-10;Sidorov等，(1999)尸/a"fJ19:209-216)。用于产生转基因植物和植物细胞的转化方案的选择，可根据作为转化目标的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变。特别适合于特定植物类型的转化方案的实例，包括适于以下植物的转化方案马铃薯(Tu等，(1998)P/cmfMo〖ecw/arS/o/ogy37:829-838;Chong等，(2000)7>aragem'cie"(3rc/29:71-78);大豆(Christou等，(1988)尸/a"f尸;z，/0/.87:671-674;McCabe等，(1988)Aorec/mo/ogv6:923-926;Finer和McMullen,(1991)/"Ce〃Dev.5/o/.27P:175-182;Singh等，(1998)T7zeory4p//.96:319-324);玉米(Klein等，(1988)Prac.扁.爿c"dSd.85:4305-4309;Klein等，(1988)胸ec/zwo/ogy6:559-563;Klein等，(1988)P/a"/户/2;w'0/.91:440-444;Fromm等，(1990)所o&c/mo/ogy8:833-839;Tomes等，(1995)"DirectDNATransferintoIntactPlantCellsviaMicroprojectileBombardment,"PlantCell,Tissue和'OrganCulture:FundamentalMethods,Gamborg(编辑),(Springer-Verlag,Berlin));谷类(Hooykaas-VanSlogteren等，(1984)Atowe311:763-764;美国专利5,736,369)。在一些实施方案中，使用一个以上的构建物进行转化来产生转基因植物和植物细胞。可将多个构建物引入在顺式或反式位置。在优选的实施方案中，每个构建物都具有启动子和其它调节序列。转基因植物可按任何本领域公知的方式表达转基因，所述方式包括但不限于组成型表达、发育调节表达和组织特异性表达。在一个具体的实施方案中，使用能指导核酸分子在叶子和/或光合作用器官中的表达的启动子(如Khoudi等，197:343中公开的/^GS启动子)来表达本发明的核酸分子和/或多肽。可将通过任何上述转化技术得到的转化植物细胞进行培养，以再生出具有转化基因型从而具有所需的表现型的整抹植物。这种再生技术依赖于对组织培养生长培养基中的某些植物激素的操纵，而所述操纵通常依赖于已与所需的核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体进行的植物再生在本领域中已有描述(例如Evans等,ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,第124-176页，MacM腿anPublishingCompany,NewYork,1983;andBinding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,第21-73页，CRCPress,BocaRaton,1985)。也可从植物愈伤組织、外才直体、器官或它们的部分(part)获得再生。这种再生技术在本领域中也有描述(例如Klee等，(1987)j朋.iev.0/户/aW尸/y^38:467-486)。术语"植物"包括整抹植物、出芽(shootvegetative)器官/结构(例如叶子、茎干和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花粉嚢和胚珠)、种子(包括胚芽、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、藻丝(trichome)等)和它们的子代。可用于本发明方法的植物的类别包括适于转化技术的高等和低等植物的各类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、棵子植物、蕨类植物和多细胞藻类。本发明也包括多个倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、双倍体、单倍体和半合体植物。本发明的核酸分子可用来将所需的性状赋予到基本上任何植物。因此，本发明可用于各种各样的植物，包括以下各属植物的各个种Agrafe、葱属(力/z'謂)、凤梨属(^4"朋oy)、腰果属04加caW簡)、芽属(z4//謂)、落花生属(Jracto)、天门冬属(y^p"ragus)、y4/za画"A(3、颠痴属(」/ro/")、燕麦属(jve"a)、簕竹属(Saw6wa)、甜菜属CBeto)、芸苔属(Sra肌'ca)、雀麦属(万ra扁力、Bro丽a/z'a、山茶属(C細e肠)、大麻属(Qzww^)、番木瓜属(C腊'ca)、长角豆属(Ora加/a)、鹰嘴豆属(C7cer)、舉属(C7zewopoc/i!'ww)、C7z/ccWwm、斥甘橘属(C"7-w力、西瓜属(GYrw〃w力、多束才杈属(Ca/w/cwm)、红花属(CaW/ztwms)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Co^ea)、薏苡属(Co/x)、甜瓜属(Cwcwm'力、南瓜属(CwcwrWto)、狗牙根属(C，o^")、鸭茅属(Z^c(y/z》、曼陀罗属(A3fwra)、胡萝卜属(Z)"mc—、石竹属(D/朋^7ws)、毛地黄属(D妙a/z》、薯蕷属(D/ojcw—、油棕属(五/ag&)、穆属(J57/ww."e)、大戟属(五wp/z。r&")、羊茅属(Fesfwca)、熔属CF/cus)、草莓属(Fragw7.a)、老鹳草属(Geram'wm)、大豆属(G7ydwe)、禾本科(GV薩z'"ae)、棉属(C7ow炉'画)、向曰葵属(//Wcw^z—、(T7efenx^〃&)、橡股树属(7/ev—、木槿属(历6/sc—、大麦属(/7onie画)、天仙子属(i^oscya附ws)、甘薯属(ipcwoea)、萬苣属(Z^cfwca)、山黧、豆属(丄"^yn^)、兵豆属(丄era)、百合属(丄///"^)、亚麻属(丄z'"wn)、黑麦草属(丄o〃ww)、百月:K才艮属、习习扇豆属(丄wp/"w"、番痴属(Z^copem'cow)、澳洲坚果属(Maca(i聽fc2)、八仙花属(M3CTO//^〃a)、苹果属(Afo/us)、忙果属(Mawgz/era)、木募属(JVfam'/20f)、M<q/orawa、首諧属(Afed/cago)、艺蕉、属(Mwsa)、7jOf山属(iVi3rc/Mus)、7Vemes/a、火因草属(M'co"a加)、驴豆属(Owo67c/z/力、木犀冲览属(0/ea)、((9/,eae)、稻属、泰属(尸a"/c訓)、泰属(尸a"/cwm)、(尸G"/e讓)、狼尾草属(Pawm's"wm)、《良尾草属(Pewmie&w)、碧冬痴属(Pefwm'a)、天竺葵属(尸e/argowz.ww)、旁f梨属(Pe;^ea)、(/Varo/ofeae)、菜豆属(P/zoseo/ws)、才弟牧草属(户/z/ewm)、云杉属(尸z'cea)、早熟禾属(尸oa)、松属(A'm^)、P/stoc/n."、5宛豆属(尸&w附)、杨属(尸opw/w"、黄杉属(户^W(ic^wga)、梨属(尸3^us)、李属(/Vwmw)、Psewto&wg"、番石.插属(尸w'(ifwm)、才乐属(gwm7w力、毛茛属(ia咖ncw/—、萝卜属(ia;/za"w51)、茶薦子属(雄as)、荒麻属(7/"."M力、杜鹃属(i^。fifo(ie"(ira")、蔷薇属("os")、甘蔗属(Sacc/zaraw)、美人襟属(Sa/;^'g/os;^)、黑麦属(&ca/e)、千里光属0Se"edo)、狗尾草属(5"eton'a)、北美红杉属OSe《wc^)、白芥属0S/"a;^)、痴属(6b/a"訓)、高粱属(5brg/7訓)、钝叶草属(5Vewo鄉/^簡)、r/zeo6rom^、胡卢巴属(7h'go"e〃a)、车轴草属(7h/o/!'wm)、胡卢巴属(7Wgo"e//a)、小麦属(7W&wm)、4失杉属(7^wga)、郁金香属(r"/^")、野豌豆属(7/c/a)、葡萄属(W&)、虹豆属(Wg"a)和玉蜀黍属(Zea)。在具体的实施方案中，转基因植物是玉米、西红柿、马铃薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、莴苣、卡诺拉油菜、高粱或烟草植物。可使转基因植物生长并用同一转化植株或不同的植抹授粉。可生长出两代或多代植物，以确保所需核酸分子、多肽的表达和/或表现型特征得到稳定保持和承袭。本领域普通技术人员会认识到，本发明核酸分子在被稳定并入到转基因植物中并被确认可操作(opemble)后，可通过有性杂交将它引入到其它植物中。可使用多种标准的育种技术中的任何一种，这取决于代杂交的种类。转基因植物中的表达的测定可使用任何本领域公知的方法，来测定本发明核酸分子或由其编码的多肽在植物中的表达水平。例如，本发明核酸分子所编码的多肽在植物中的表达水平可用分子技术进行测定，所述技术包括但不限于免疫测定、免疫沉淀法、凝胶电泳和定量凝胶电泳。另外，本发明核酸分子所编码的多肽在植物中的表达水平，可通过在升温条件下与表达野生型Rubisco活化酶的植物相比植物表现型(包括但不限于光合作用速度、生长许多和种子产量)的改变程度来测定。此外，可将从转基因植物及其组织分离的提取物或多肽用于体外测定中。本文所引述的所有出版的论文、书籍、参考手册和文摘的内容通过引用整体结合到本文中，以更加完全地描述本发明所属领域的技术发展水平。由于可不偏离本发明的范围和精神对上述主题作出各种变化，因此规定所有以上描述中所包含的和/或所附权利要求书中所限定的主题都应被解释为旨在描述和说明本发明。根据以上教导内容可以对本发明作出各种修改和变化。实施例实施例1:分离Rubisco活化酶衍生多肽用SEQIDNO:1的野生型Rubisco活化酶作为模板，从单基因改组(singlegeneshuffling)(参见例如Crameri等，(1998)A^匿.391(6664):288-91;Chang等，(1999)5/o&c/2"o/.17(8):793-7;Ness等，(1999)淑腺ec/wo/.17(9):893-6;Christians等，(1999)淑所o&c/7"o/.17(3):259-64和USPatentNos.6,605,430、6,117,679;and5,605，793)和合成改组(syntheticshuffling)(参见例如USPatentNo.6,436,675和国际公开说明书WO00/42561、WO01/23401、WO00/42560;andWO00/42559)产生Rubisco活化酶文库。简单的说，用Trizof试剂按厂商的方案(Invitrogen)从拟南芥的绿叶分离RNA。用TITANIUMone-stepRT-PCRKit(BDBiosciences-Clontech)将RCAcDNA(GenBankaccessionnumberNM179990)PCR克隆到TOPC^载体(Invitrogen)中。对于单基因改组，在第一轮，将成熟RCA短形式(编码区V59-K438)在无引物PCR反应中进行PCR扩增(Qiagenra《DNA聚合酶或StratageneMutazymeDNA聚合酶)，片段化和重装配，然后用含有A^oI位点(5，)和^wzHI位点、6x-His编码区和终止密码子(3，)的侧翼引物拯救被改组的基因。将变体的文库克隆到用iVcol和5awffl消化的大肠杆菌表达载体(pET16b,Novagen)。为扩大第一轮的遗传库(poolofgenetic),用小麦、水稻、棉花、菠菜和黄瓜的多样性进行合成改組(参见Ness等，(2002)Aotec/mo/.20:1251-1255)。按之前Crameri等，(1998)iVamre15:288-291的描述用第一轮变体作为亲本进行第二轮的基因改组。热稳定性提高的Rubisco活化酶衍生多肽通过以下筛选方法分离。第一级Rubisco活化测定。将表达Rubisco活化酶衍生多肽的大肠杆菌的培养物在4。C、3，500rpm下离心沉淀15分钟后，在96孔V形底PCR板中-80。C下储藏。这样制备大肠杆菌细胞裂解产物将培养物在室温下解冻5分钟，向每孔加入75^1超声緩冲液(100mMTricineKOHpH8.0、20mM抗坏血酸、3mMMg陽ATP、10mMMgCl2、10%v/v甘油、10mMJ3me、x3.33蛋白酶抑制剂、1|ul/mlbenzonase、lmg/ml溶菌酶)，将板在4。C下振摇60分钟，直到细胞沉淀被裂解。将板用MISONIX微板超声波仪进行超声处理1分钟，然后冷却1分钟。这个过程重复四次。将培养物在4。C、4，000rpm下离心20分钟。将含有可溶性蛋白质的上清液用于Rubisco活化测定。将22|il的大肠杆菌上清液转移到96孑LU形底闪烁板(scintillation-plate),在室温下温育15分钟(并在测定中用作"正常条件，，的裂解产物)。裂解产物的热处理是通过将35pl的大肠杆菌上清液转移到96孔V形底PCR板并在40。C下温育15分钟来进行。然后将热处理过的上清液转移到96孔U形底闪烁板(并在测定中用作"热处理条件"的裂解产物)。两板在进行性能测定前在4°C下温育5分钟。这样测定Rubisco活化情况将含有Rubisco活化酶或Rubisco活化酶衍生多肽的细胞裂解产物与纯化的失活的拟南芥Rubisco(15jug)在反应緩冲液(100mMTricineKOHpH8.0、10mMMgCl2、10mM[14C]NaHC03、Mg-ATP、4mMRuBP、lmMPEP、40(ig/ml丙酮酸激酶)中室温下温育15分钟(参见Shen等，(1991)JSZo/.C/2em.266:8963-8968)。加入1NHCl终止表达Rubisco活化酶衍生多肽的细胞裂解产物对Rubisco的活化作用，通过液体闪烁光谱测定法测定14co2的掺入情况。上述测定中所用的Rubisco从拟南芥叶子纯化得到。将叶子均质化并在液氮中冷冻，然后重新悬浮于提取緩冲液(100mMHepes-KOHpH8.0、lmMEDTApH8.0、3mMDDT、0.5mMPMSF、10mMMgCl2、10mMNaHCO3)中。将悬浮液在4。C、12，000rpm下离心20分钟，收集上清液。将上清液在连续搅拌下保持在冰上，同时加入硫酸铵至最终浓度为35。/。饱和，在4。C、12,000rpm下离心20分钟。将上清液再搅拌30分钟，同时加入^5克酸铵至最终浓度为55%饱和，然后在4。C、12,000rpm下离心20分钟。将所得沉淀溶于提取緩冲液中，再用18%聚乙二醇进行沉淀并离心。再将所得沉淀重新悬浮于提取緩冲液(约1ml/原始40ml上清液)中，在4。C、13,000rpm下离心30分钟。纯化的Rubisco在上清液中，加入甘油至最终浓度为10%。通过以下方案使纯化的Rubisco失活(参见Wang等，(1992)P/a"/^"z'o/.100:1858-1862)。向纯化的Rubisco加入10mMDTT，在45。C下温育10分钟。将所得混合物取1ml加到用平衡緩冲液(50mMTricine-KOHpH8.0和0.5mMEDTApH8,0)平衡的20mlSephadexG-50柱。加入1ml/份的平衡緩冲液，将失活的Rubisco从柱上洗脱下来。收集洗脱下来的失活Rubisco，在室温下温育1小时，然后在4mMRuBp的存在下在冰上温育1小时。第二级活性克隆的细胞裂解产物活化Rubisco的HTP温度概况(temperatureprofile)。第一级筛选中鉴定出的目的克隆在笫二级筛选中作进一步的表征。将每个活性克隆的细胞裂解产物如上所述再作试验，例外的是测定前先在四个不同的温度(16。C、25。C、40。C和45。C)下进行温度处理。选出与野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:2)相比具有相对提高的热稳定性概况的克隆进行第三级筛选。第三级纯化的Rubisco活化酶变体活化Rubisco的温度扭无况。为测定前面两级筛选所鉴定出的衍生多肽的比活性，将亲和纯化的多肽在不同温度下进行预温育，然后分析它们在25°C下活化Rubisco的能力。由于Rubisco活化酶以时间依赖性方式催化失活的Rubisco,对每个反应以三分钟时间间隔监测15分钟。Rubisco活化酶:Rubisco的比例设定为1:40，类似于植物叶子中的比例。野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:2)和Rubisco活化酶衍生多肽的热稳定性在表2中显示。热稳定性百分数代表40°C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占25°C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分数。实施例2:Rubisco活化酶衍生多肽的体外表征将实施例6.1中分离的Rubisco活化酶衍生多肽在三个不同的测定中进行体外试验，以测定它们在25。C和40°C下的比活性及热稳定性(t.s.)。在所有情况中都将用野生型Rubisco活化酶在25°C下获得的结果设定为100%。失活Rubisco的活化。将纯化的Rubisco活化酶衍生多肽按实施例1第一级测定所述进行测定，例外的是在进行Rubisco活化性能测定前先将衍生多肽在40。C或45。C下温育15、30、45或60分钟。结果在表3的第2-4列显示。表3的第2列代表在将失活Rubisco与Rubisco活化酶在25°C下温育后获得的活化Rubisco的量。没有使用到升温条件。表3的第3列代表15分钟的40。C热处理后被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占25。C下被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分数。表3的第4列代表45分钟的40°C热处理后被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占没有进行热处理(在25°C下)时被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分^:。Rubisco活化酶衍生多肽301C7和382D8的Rubisco活化作用在40°C和45°C处理下显示出高的热稳、定性(图IA)。382D8在45。C处理后的活性比在相同温度下处理的RCA1高80%，比在25。C下温育的RCA1的活性只低10%。在催化条件下的Rubisco活化。将纯化的Rubisco活化酶衍生多肽按实施例1第一级测定所述进行测定，例外的是测定是在升温条件(即40。C)下进行(Crafts-Brandner和Salvucci，(2000)/WJS97:13430-13435)。结果在表3的5-6列显示。表3的第5列代表在将失活Rubisco与Rubisco活化酶在25。C下温育后获得的活化Rubisco的量。没有使用到升温条件。表3的第6列代表在40。C进行测定时被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量占在25°C下进行测定时被Rubisco活化酶活化的Rubisco的量的百分数。野生型RCA在40°C下保持0.5的Rubisco活化状态，而Rubisco活化酶衍生多肽183H12、301C7和382D8在相同条件下能够保持0.62-0.72的活化状态(图1B)。相对于在25。C下的反应，热稳定性变体在40°C下保持78-98%的Rubisco活化状态，而野生型的酶保持70%。在25。C或40°C下都显示最高比活性的蛋白质是在第一4仑分离的最好变体183H12。ATP酶活性。由于Rubisco活化酶是需要ATP来松开Rubisco与糖-磷酸的结合的ATP酶(多肽中含有AAA+结构域)，因此测试了温度对Rubisco活化酶的ATP水解作用的影响。监测活化酶复合物的内在活性而不管其与Rubisco的相互作用的ATP酶测定，常被用于Rubisco活化酶表征。按Salvucci((1992)所oc/ze肌所o;^^.298:688-696)的描述进行了ATP酶测定。结果在表3的7-8列显示。表3的第7列代表将Rubisco活化酶与ATP在25°C下温育后所存在的水解ATP的量。没有使用到升温条件。表3的第8列代表在与经过40°C热处理的Rubisco活化酶温育后所存在的水解ATP酶的量，表示为占与不经热处理的Rubisco活化酶温育后所存在的水解ATP酶的量的百分数。图1C显示，Rubisco活化酶衍生多肽301C7和382D8在35°C和40°C下稳定性与RCAl相比提高了超过10倍，而183H12在25。C和40。C下分别显示20%和30°/"是高。实施例3:Rubisco活化酶缺失突变体的互补为了在对缺失而言纯合的背景(z^^/Aca)(参见Li等，(2001)尸/a"f/.27:235-242)中表达改组的变体，开发了以下互补级联(complementationcascade):l)采用单叶96孔DNA提取方法(Xin等，(2003)所orec/zw々wes34:820-826)，通过HTP-PCR,以针对野生型和缺失等位基因的特异性引物，针对缺失对杂合植林进行选择；2)用目的基因进行转化；3)进行抗生素抗性的T0选择，并进行纯合性的PCR分析；4)将所得的纯合植株进行自花授粉，以获得T1转基因抹系。对野生型、杂合和纯合植抹(遗传背景分别为7C4/AC4、iC4/z/rca^zlrca/Aca)的免疫印迹分析揭示，基因产物(长形式和短形式)在野生型和杂合植林中表达的水平相似(图2A)。在对缺失而言纯合的植抹中不存在短同种型和长同种型，这证实突变把RCA1和RCA2的表达消除了。Aca植林与野生型相比，在环境C02下生长时显示较低的光合作用性能(Fq，/Fm，值)(分别为0.185±0.038和0.332±0.033)(图2B),在土壤上生长3周后叶子面积显著较低(分别为2.93±0.49和395.4±8.75mm"(图2C)。两月龄zlrca纯合植抹与野生型植林相比生长严重矮小，且发生萎黄病(图2D)。基于对缺失片段的序列分析和作图，设计了两套引物RCA引物(正向引物5，-CAGACAATGTTGGCCTC-3，(SEQIDNO:23)和反向引物5，-ACGAGTAACGATGGTAGG-3，(SEQIDNO:24))，它们对野生型等位基因特异，产生1.5kb产物；和rca引物(正向引物5，-GTCTATACCTTGAGC-3，(SEQIDNO:25)和反向引物5，-TCAGTCATACTCGG-3，(SEQIDNO:26)),它们在缺失型等位基因产生1.5kb产物，在野生型等位基因产生4.9kb产物(图3A)。为了用rca引物扩增1.5kb产物但不扩增4.9kb产物，将PCR扩增循环设定为1.5分钟。将这两套引物用于表征T1植林的遗传背景。由于转化宿主对内源"a基因座的缺失而言是杂合的，表达Rubisco活化酶转基因的Tl植林是野生型(AC4/RC4)、杂合体CRC4/Aca)和纯合体(z^ca"rca)的混合体。用PCR筛选(图3B)和免疫印迹分析(图3C)已鉴定出在不同遗产背景中表达改组变体183H12的转基因抹系。在含有至少一个野生型等位基因的遗传背景中表达i83H12的植4朱(#13;wt,#12;对缺失而言是杂合的)，同时具有酶蛋白质的短形式和长形式。在抹系#2(对缺失而言是纯合的)中只检测出短形式，因为转基因被设计成只表达酶蛋白质的短形式。实施例4:Rubisco活化酶衍生多肽的植物内(7np/朋to)表征为测定提高的Rubisco活化酶在正常温度和升温下的作用，使用了拟南芥Rubisco活化酶缺失突变林(zfrca)(参见实施例3)。用野生型Rubisco活化酶(SEQIDNO:l)、第一轮Rubisco活化酶衍生多肽183H12(SEQIDNO:7)和两种第二轮382D8(SEQIDNO:15)和301C7(SEQIDNO:19)对z/rca进行功能互补。为了在转基因拟南芥植抹C^ca)中表达野生型Rubisco活化酶和Rubisco活化酶书亍生多肽，将编码叶绿体转运肽和rc"7或^f汙生多肽的编码区的转基因与双增强子结构域(doubleenhancerdomain)(Day&Maiti，(1999)rraragemb3:61-70)、UBQ3终止子和卡那霉素抗性基因"/rtl—起，克隆到含有Mirabilis花椰菜花叶病毒(MirabilisMosaicCaulimovirus,MMV)启动子的pMAXY4384中。采用floraldipping方法(Clough等，(1998)i^""16:735-743)，用根瘤土壤杆菌GV3101菌林转化杂合的DeleteageneRCA突变抹。为证实表达，将蛋白质从液N2和1ml的提取緩沖液(IOOmMTricine-KOHpH8,EDTApH8，10mM2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂cocktailSetV)中的植物組织(2-3g鲜重)中提取。将粗提取物4妄连在3000g下离心5分钟和12,000g下离心20分钟进行澄清。取IO微克的可溶性蛋白质提取物在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离后，转移到硝酸纤维素膜上(按照Invitrogen所提供的说明书)。用重组拟南芥RCAl产生的多克隆抗体对印迹进行免疫装饰，用Ap缀合底物试剂盒(Bio-Rad)检测蛋白质。如图4A所示，野生型植抹(iC4/RC4)表达活化酶的短形式和长同种型，而用转基因进行互补的转基因抹系只表达43kDa短同种型。在22°C培养条件下(植林在16小时光照(225iLimol光子m—2s")/8小时黑暗循环中生长)，转基因抹系显示出与野生型未转化植4朱相似的生长速度(图4B)。用叶绿素荧光成像系统(Fluorlmager,QubitSystems)按先前的描述(Baker等，(2001)52:615-621)分析光合作用性能(光合系统II运行效率Fq，/Fm，)和生长速度。表达RCA1或者Rubisco活化酶衍生多肽183H12、301C7或382D8的转基因缺失林系(分别为々c"RCAl、z/rc"183H12、Jrca301C7和z/rca382D8)的Fq，/Fm，值与野生型未转化植株相似，表明短形式的表达足以在正常生长条件下对々ca进行功能互补(图4C)。在这些条件下，通过便携式红外气体分析仪(LI6400,Li-Cor)在150pmol光子m—2s"和350(abarC02下测量的zlrcGRCAl-l的光合作用活性与Acal83H12-3、Jrc"301C7-3和z^ca382D8-l相似(图4D)。将z/rcaRCAl-l暂时暴露于30。C1小时导致其光合作用下降12%。相反，zJrcal83H12-3、zlrc^301C7-3和z^ca382D8-l林系在30。C下1小时后显示光合作用增加16、22和16%。由于将拟南芥植林暴露于30。C会造成热激蛋白的少量诱导(通常在32。C及以上被诱导)和对气孔开度的些微影响(Salvucci等，(2001)尸/""fP/^/0/.127:1053-1064)，用表达野生型或热稳定性Rubisco活化酶的拟南芥植林进行在长时间热处理下的生长。将四周龄转基因林系暴露于中度热应激两周时间。生长条件为16小时光照(225(imol光子m-、")和8小时黑暗。在光循环中，档^朱在22。C下生长6小时，然后快速升温到30°C(每分钟2。C)生长4小时，然后再返回22。C生长至光循环结束。在黑暗循环中，植抹保持在22。C下。按先前的描述(Barth等，(2003)/fw^/—.91:36-42)进行生长、生物量和产量的表征。各植林显示正常的表现型和叶子颜色，但大小各异(图5A)。相比于野生型未转化植林和表达Rubisco活化酶衍生多肽的zJrca株系，々caRCAl(抹系1、8和9)矮小(图5B)。表达具有最高体外比活性的183H12-3的转基因拟南芥是最大的植林。表达301C7和382D8的抹系比drcaRCAl林系大，但没有达到183H12林系的叶子面积水平。尽管仅表达野生型基因的短形式(RCAl)的Aca林系比野生型未转化林系(同时表达长形式和短形式)小，但大多数表达Rubisco活化酶衍生多肽的转基因抹系显示出比野生型未转化植抹更大的叶子面积(图5B)，且所有表达Rubisco活化酶衍生多肽的林系都比表达RCA1的z)rca转化林显著更大(/M).01)。暴露于两周的中度热应激的四周龄植林也显示出植物发育速度上的差异。在处理期结束时，分别有74、44和33。/。的z!rcal83H12、Aca301C7和Ac"382D8具有成熟花序，花朵张开，而100%的未转化野生型植林和88%的AcaRCAl抹系具有形成中的不成熟花序，花朵不张开(数据未显示)。另外，12。/。的z/w"RCAl抹系处于营养阶段，没有可见的花序。在正常生长条件下，拟南芥植物在四周后开花。因此，显示正常发育的zJrcal83H12、Ac"301C7和Aca382D8林系占相对较高的百分比，这很可能是因为RCA的热稳定性提高所致，该热稳定性使得对中度热应激条件下的光合作用和生长的抑制减至最低。对每种变体的最佳株系进一步分析其在中度热应激循环(30。C下2小时后)中的光合作用活性。转基因抹系显示出与叶子面积相关的C02固定模式。Acal83H12-3、zJ簡301C7-3和d腦382D8-l林系C02固定速度分别比zlrcaRCAl-l林系高30、25和23%。这些结果证明Rubisco活化酶在实验条件下是光合作用的限制性因素。暴露于中度热应激8周时间的各个成熟植林(IO周龄)其外观相似。相比于ArcaRCAl-l,在Arcal83H12-3、Arca301C7-3和厶rca382D8-l抹系中检测到对植抹高度的稍微正向的影响(分别为116、121和119%)(图5D)。在每抹植株的长角果数量上观察到巨大的差异，Arcal83H12-3、Arca301C7-3和Arca382D8-l分别为130.8±48.2、84.3±19.6和100.8土26.9,与此对比，ArcaRCAl-l和野生型分别为40.2±16.3和47.5土15.8(图5E)。为证实表达提高的RCA的转化体中长角果形成的相对提高并不是以牺牲单颗种子大小为代价获得，比较了1000颗种子沐1:的重量。如图5F所示，Arcal83H12-3和Arca382D8-l产生的种子比ArcaRCAl-l稍大(分别大18和32%)，而Arca301C7-3和野生型植抹的种子重量与△rcaRCAl-1相似。为进一步分析提高的RCA对中度温度应激下的生长的影响，使在25。C下(体外)表达最具活性的克隆的T3抹系183H12在26。C和比前面的实验更高的光强度和湿度下连续生长。生长的条件是26°C和85%湿度下16小时光照(300pmol光子m'2s")和8小时黑暗。野生型和zfrcaRCAl抹系在26。C下生长比起在正常生长条件下生长，产生的总生物量稍有下降，显示植抹发育速度较慢，而Acal83H12的各植株的生物量和发育过程不变(未显示)。与此对比，26。C下生长的z^c"植抹产生的每林长角果数量受到它们所表达的Rubisco活化酶衍生多肽的巨大影响(图6A)。Acal83H12抹系比z^c"RCAl林系每林多出50-100颗长角果，比野生型植林多出40-80颗长角果。另外，Jrcal83H12的长角果比野生型植林和AcaRCAl林系的大，且产生更多的种子(图6B)。26。C下生长的zlrcal83H12的长角果显示出其表现型与正常生长条件下生长的野生型相似，但产生的种子较少。观察到在正常生长条件下，表达RCA1和183H12的drca林系其种子重量比野生型植株稍有下降(图6C;白色棒条)。但是，观察到在连续暴露于26。C下，z(rol83H12的各抹系的种子重量比野生型植林或zJrcaRCAl的各林系大50%-150%。将26°C下生长的每个4^系的种子重量与22°C下生长的相同4朱系的种子重量进行比4交发现，z]rcal83H12-2、Ac"183H12-3和zlrral83H12-20抹系比^caRCAl林系或野生型明显不受更高生长温度的影响。由于暴露于26°C导致产生小的长角果，所含种子数量较少，种子重量也小，故用发芽试验分析种子发育能力。收集在正常生长条件和在26°C下生长的野生型、AcaRCAl-l和zlrcal83H12-3植抹的种子，然后在22°C下发芽。在22°C下生长的^r"RCAl-l和zlrc"183m2-3亲本林系的种子显示相同的发芽率(86%),这比野生型植林(94。/。)稍低(图6C)。从26。C下生长的zlrcaRCAl-l亲本收集的种子观察到发芽被完全抑制(4%)，而野生型种子被显著抑制(26%)。相反，从26°C下生长的zlrcal83H12-3亲本收集的种子显示70%的相对较高的发芽率。另外，还分析了档4朱在以下生长条件下的光合作用速度、生长速度和种子产量。正常条件:植株在22。C下按16小时光照(225)imol光子m-2s")和8小时黑暗方案生长。升温条件:植林在正常生长条件下生长两周，然后转移到生长箱中按16小时光照(225jiimol光子m々s")和8小时黑暗方案生长。在光照循环中，温度设定至22°C保持6小时，然后快速升温至30。C(每分钟2。C)，保持4小时。热处理后，温度设定回22。C。连续升温条件:植抹在正常生长条件下生长两周，然后转移到生长室中按16小时高光照(300(imol光子nf2s")和8小时黑暗方案生长。在光照/黑暗循环中，温度设定为26。C，适当设定为80%。以下总结对上述各条件下的Rubisco活化酶衍生多肽活性的植物内测定的结果。生长速度。使用叶绿素荧光成像系统(Fluorlmager，QubitSystemInc.)测量叶子面积。将未转化野生型植林在不同生长条件下观察到的叶子面积设定为100%。表4中的数据证明，表达三种Rubisco活化酶衍生多肽的任何一种的植抹与野生型植抹或表达转基因的野生型Rubisco活化酶的植林相比，在升温条件下生长速度提高。光合作用速度。用便携式红外气体分析仪(LI6400，Li-Cor)分析各植林的C02固定情况15分钟。光源设定为225|imol光子m々s"，通过内置的C02注入系统供应到叶子的C02水平为SSO^nolm-Ss-L表5中的数据证明，表达三种Rubisco活化酶衍生多肽的任何一种的植林与野生型植林或表达转基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比，在升温条件下光合作用速度提高(参见第3列)。种子产量。从成熟的千燥植林测定种子重量(mg)。种子发芽率通过在补充以卡那霉素的MS板上发芽的植抹的数量进行测定。表5中的数据证明，表达三种Rubisco活化酶衍生多肽的任何一种的植林与野生型植林或表达转基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比，在升温条件下种子产量提高(参见第4列)。表达三种Rubisco活化酶衍生多肽的任何一种的植抹在连续升温条件下也出现种子产量的提高(参见表6)。表达Rubisco活化酶衍生多肽183H12(SEQIDNO:7)的植抹与野生型植林或表达转基因的野生型Rubisco活化酶的植抹相比，在连续升温条件下种子发芽率提高(参见表7)。表l:密码子表<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表2:氨基酸置换对Rubisco活化酶活性和热稳定性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>M0。C下的活化Rubisco的数量占25°C下的活化Rubisco的数量的百分数。表3:Rubisco活化酶衍生多肽的相对活性(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表4:正常和升温条件下的叶子面积<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*拟南芥未转化野生型的叶子面积设定为100%。表5:正常和升温条件下光合作用速度和种子产量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>:在30°C下2小时后监测净光合作用。#升温条件下生长的植林的1000颗种子重量占正常条件下生长的植抹的1000颗种子重量的百分凄t表6:正常和连续升温条件下的种子产量<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表7:从正常和连续升温条件下生长的植抹收获的种子的发芽率<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>权利要求1.一种分离的核酸分子，所述核酸分子包含SEQIDNO3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一个或其互补序列。2.—种分离的核酸分子，所述核酸分子选自a.包含这样的核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一个或其互补序列的核苷酸序列有至少95%同一性；b.编码这样的多肽的核酸分子，所述多肽包含SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一个的氨基酸序列；c.在严格条件下与这样的核酸探针杂交的核酸分子，所述核酸探针由SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一个或其互补序列的核苦S交序列组成。3.权利要求1或2的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码与SEQIDNO:2的多肽相比热稳定性」提高的多肽。4.一种载体，所述载体包含权利要求1或2的核酸分子。5.权利要求4的载体，所述载体是表达栽体。6.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4的载体。7.—种分离的多肽，所述多肽包含SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一个。8.—种分离的多肽，所述多肽选自a.与SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一个的氨基酸序列有至少95%同一性的多肽；b.由这样的核酸分子编码的多肽，所述核酸分子包含与SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的4壬何一个或其互补序列有至少95%同一性的核普酸序列；c.由这样的核酸分子编码的多肽，所述核酸分子在严格条件下与由SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一个或其互补序列的核苷酸序列组成的核酸揮3十杂交。9.权利要求7或8的分离的多肽，其中所述多肽与SEQIDNO:2的多肽相比热稳定性提高。10.—种转基因植物，所述转基因植物包含的转基因表达a.SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一个的多肽；或b.SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21中的任何一个的核酸分子。11.权利要求10的转基因植物，其中所述植物选自玉米、西红柿、马铃薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、莴苣、卡诺拉油菜、高粱或烟草植物。12.权利要求11的转基因植物，其中所述转基因植物与非转基因植物相比耐热性提高。13.—种转基因植物，所述转基因植物包含的转基因表达c.权利要求8的多肽，或d.权利要求2的核酸分子。14.权利要求13的转基因植物，其中所述植物选自玉米、西红柿、马铃薯、水稻、大豆、棉花、向日葵、苜蓿、莴苣、卡诺拉油菜、高粱或烟草植物。15.权利要求13的转基因植物，其中所述转基西植物与非转基因才直物相比耐热性提高。16.—种提高植物的耐热性的方法，所述方法包括在该植物中表达SEQIDNO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22中的任何一个的多肽。17.权利要求16的方法，其中所述多肽在该植物的一个或一个以上质体中表达。18.权利要求16的方法，其中所述多肽的表达导致在升温条件下光合作用速度提高。19.权利要求13的转基因植物，其中所述植物的内源核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶的表达或活性被向下调节。20.权利要求13的转基因植物，其中所述植物的内源核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶的表达或活性被消除。全文摘要本发明提供与拟南芥核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶多肽有关的热稳定性多肽。还提供了编码本发明多肽的核酸。本发明还涵盖使用本发明的多肽和核酸来提高植物对热应激的抗性的方法。文档编号C12N15/82GK101292027SQ200680039176公开日2008年10月22日申请日期2006年8月22日优先权日2005年8月24日发明者G·朱,I·库雷克,L·刘申请人:先锋高级育种国际公司