专利名称：稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码蛋白与其在提高植物光合作用效率中的应用。
背景技术：
植物界光合碳同化方式上有C3途径和C4途径的区分。由于光呼吸的存在，C3途径所固定的碳相当一部分被光呼吸消耗掉，生物量的形成减少50％以上。C4光合途径中固定CO2的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)对CO2的亲和力远远超过C3光合途径中的核酮糖二磷酸羧化酶(RuBPase)，而且磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有浓缩CO2的机制，CO2浓度的升高有利于双功能酶RuBPase的羧化活性，抑制其加氧活性，从而有效降低了植物的光呼吸。因此，C4植物具有光合速率高，CO2补偿点低，几乎没有光呼吸等优点，特别是在强光、高温、干旱等条件下，C4植物具有明显的生长、水分及营养利用率高的优势，光合效率比C3植物高出二倍，生物产量也较高。但地球上95％以上的植物，包括许多重要的粮食作物和经济作物如水稻、小麦、菠菜、烟草等都是C3植物，在常规的大气环境下(21％的O2，0.035％的CO2)，其光合效率比C4植物低40％，而在高温、干旱使气孔关闭，CO2浓度降低的情况下，光合效率则更低。只有少数热带和亚热带禾本科植物如玉米、甘蔗、高粱和稗草等是C4植物，具有对付光呼吸的策略。
许多C3植物中C3光合途径和C4光合途径并存，在不同环境条件下或人工诱导下，其C4光合酶活性会大大提高，表明C4光合途径的关键不在于细胞区域化结构，而在于C4光合关键酶，如PEPC，PPDK，NADP-Me等。因此，将C4光合途径关键酶基因导入C3植物中，有可能提高C3植物的光合效率。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)存在于所有能进行光合作用的有机体中，许多高等植物如玉米(Z.mays)、高粱(S.vulgare)、水稻、黄花菊属(Flaveria)等植物的PEPC基因相继克隆成功，并且对其序列特征及结构进行了详尽的解析。
研究证明，高等植物的PEPC是由一小段多基因家族编码的。这一家族中的多个成员已在不同植物如玉米，高粱，冰叶日中花以及Flaveria trinervia等中被确认。ppc基因存在多种同工酶形式C4光合型、C3光合型、CAM型及非绿色型等，甚至在每种植物中的ppc基因至少存在有1-3个类型，在玉米中已发现有5个类型，分别存在于叶和根组织中。C4光合型PEPC基因在玉米和高粱中以单拷贝形式存在，而在Flaceria属植物中则以多拷贝形式存在，其表达主要在叶肉细胞中进行，并且受光调控，具有组织特异性。
C4植物的PEPC多基因家族成员的一级结构基本相似。由于C4形式的PEPC在C4光合作用中起到的重要作用，目前大量的研究主要集中在C4形式的PEPC上。对ppc基因研究较多的是玉米、高粱和Flaveria属等植物，通过序列比对同样发现，存在于不同植物的同一类型的ppc基因具有较高的同源性，2个玉米及1个高粱的C4型ppc基因全序列的同源性为57.9％，转录区同源性为80.3％。表明不同物种间同一类型ppc基因的同源性较高。
第一个尝试转C4ppc基因使用的嵌合基因是将玉米的C4特异的PEPC的cDNA(ppccDNA)融合到Nicotiana phimbaginifolia的叶绿素a/b结合蛋白基因(Cab)的5‘和3’的旁侧序列上构成的，这种嵌合基因导入烟草后，叶中PEPC的活性比非转基因植物提高了2.2倍。同样，在诸如Cab，rbcS启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子等强启动子控制下的C4酶的cDNA的表达，也获得使PEPC、PPDK和NADP-MDH的活性提高了2-5倍的结果。为提高C4酶的表达水平，可以在引入的基因中包括具有增强子作用的序列，通过检测欧芹的查尔酮合成酶基因的5‘端非编码区(UTR)后发现，它的存在可以使C.glutamicum的Ppc基因在35S启动子下的表达水平提高。PEPC活性的最高水平达到非转基因植株的5倍。玉米C4特异基因的启动子，如Ppc，Pdk可以大大提高报告基因在水稻中的表达水平，而且可以像在玉米中那样进行微管特异、叶肉细胞特异和依赖光的方式进行表达。此研究结果表明水稻具有高水平表达C4特异基因所许的调控因子，而且暗示完整玉米基因的导入可以导致水稻叶中C4酶的高表达。1999年，Ku等(Ku MSB，Agarie S，Nomura M，Fukayama H，Tsuchida H，Ono K，Hirose S，Toki S，MiyaoM，Matsuoka M.High-level expression of maize phosphoenolpyruvate carboxylasein transgenic rice plants. Nature Biotech.，1999，17，76-80.)首先将C4植物玉米的C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(包括启动子和终止子序列)通过农杆菌介导导入了C3植物水稻，并实现了有效表达，使水稻叶片中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性稳定提高，85％的转基因植株的PEPC活性比对照高2-30倍，15％比对照高30-110倍，甚至高于玉米2-3倍甚至比玉米高2-3倍，达到叶片可溶蛋白的12％。Ku等(Ku MSB，Agarie S，Nomura M，Fukayama H，Tsuchida H，Ono K，Hirose S，Toki S，Miyao M，Matsuoka M.High-level expression of maizephosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants. Nature Biotech.，1999，17，76-80)获得的超表达玉米PEPC的转基因水稻植株能显著减弱氧气对光合的抑制作用，在同样的大气条件下，光合速率比对照提高了2倍。据报道这种转基因水稻能增产35％。焦德茂等人(焦德茂，匡廷云，李霞等.2003.转PEPC基因水稻具有初级CO2浓缩机制的生理特点.中国科学(C辑)，33，33-39；迟伟，焦德茂，黄雪清等.2001.转PEPC基因水稻的光合生理特性.植物学报，43，657-660.)检测了转Ppc基因水稻植株的生理指标，结果表明，与对照植株相比，光饱和速率提高55％，CO2补偿点下降27％。在南京自然条件下比较，转PEPC基因水稻的光合能力显著增强，单株产量增加了14％-22％，表明通过基因工程的方法提高作物的光合生产力具有广阔前景。
稻田中的优势杂草稗草(Echinochloa crusgalli)为典型的C4光合类型植物，它的地上、地下部分生长优势远超于水稻，研究结果表明，稗草类植物既能很好地适应水中环境，又能适应极度干旱、高温条件。与其它旱作的C4作物玉米、高粱和谷子相比，具有光合速率高、PEPCase含量高等特点。因此它是一种开展转PEPCase基因以改造C3作物光合效率的最优秀的野生资源供体。到目前为止，报道较多的是将玉米、高粱等C4农作物的ppc、pdk等基因转入如烟草、水稻和小麦等C3植物，但对野生植物资源的光合基因获得成功利用的少见报道。有关对稗草资源的开发利用及光合功能基因的克隆研究在国际上仍属空白。
水稻在其进化过程中保留了适于在水田中生长并且同时需要相对较高的温度和充足的阳光照射。而高温和高光强的生长环境正是C4植物生长所必须。因此水稻的生长很容易受到水田C4杂草的影响，稗草正是在此条件下与水稻形成了强烈的抗衡，因此提高水稻等农作物的光合作用效率具有重要的实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一个来源于稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码蛋白。
本发明所提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，名称为Eppc，来源于稗属稗草(Echinochloa crusgalli)，它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由2886个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-2886位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
本发明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因所编码的蛋白(PEPC)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由961个氨基酸残基组成。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种提高植物光合作用效率的方法。
本发明所提供的提高植物光合作用效率的方法，是将所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入外植体，得到光合作用效率提高的植物。
所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可通过含有所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1300等，其中，pCAMBIA1301为优选的出发载体。
使用Eppc构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如泛生素基因Ubiquitn启动子(pUbi)、在叶组织特异性表达的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因启动子rbcS、玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异启动子、花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
以pCAMBIA1301为出发载体，构建的含有泛生素基因Ubiquitin1启动子(pUb1)、和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体为pUbi-Eppc。
以pCAMBIA1301为出发载体，构建的含有在叶组织特异性表达的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因rbcS启动子和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体为pRbcS-Eppc。
以pCAMBIA1301为出发载体，构建的含有玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特异启动子和稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体为pZMp-Eppc。
携带有本发明Eppe的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、烟草、大豆、拟南芥等C3植物。
将本发明稗草的Eppc对水稻进行转化以首先提高其光合速率，进而使其更好的适应高温和高光强的生活环境。在C4植物群体中，从起源和进化的角度看，稗草与其它C4型作物(玉米、高粱、谷子等)相比，属于与水稻亲缘关系较近的同一族植物，有可能其有关光合酶基因的调控机制与水稻有关光合酶基因的调控机制相接近，有利于基因转移后在水稻中的高活性表达。本发明的来源于稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc可显著提高植物的光合作用效率，将在提高农作物，特别是C3农作物(如水稻)的产量中发挥重要的作用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为Eppc的植物表达载体pUbi-Eppc的构建流程1a为质粒载体pUC-Pubi的物理图谱图1b为载体pCAMBIA1301的物理图谱图2为Eppc的植物表达载体pUbi-Eppc的酶切鉴定结果图3为Eppc的植物表达载体pRbcS-Eppc的构建流程3a为载体pRGN的物理图谱图4为Eppc的植物表达载体pRbcS-Eppc的酶切鉴定结果图5为Eppc的植物表达载体pZMp-Eppc的构建流程5a为载体PUCm-T-ZMp的物理图谱图6为Eppc的植物表达载体pZMp-Eppc的酶切鉴定结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生工合成。
实施例1、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的克隆1、稗草总RNA的提取及eDNA的合成取光照4h后的稗草植株的绿叶，使用Trizol试剂盒(Gibeco公司)并参照试剂盒说明书提取总RNA，具体方法为剪取1g新鲜的稗草叶片，置液氮中迅速研磨成冻干粉，收入1.5mL离心管中并加入1mL Trizol试剂，充分混匀，室温放置5min后4℃、12000g离心10min，将上清转至另一离心管中，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，摇震15sec，室温放置5min，4℃、12000g离心15min，将上清转入另一离心管中，加入0.5mL异丙醇，室温放置10min，4℃、12000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1mL，洗涤沉淀，4℃、7500g离心5min，最后将沉淀干燥后，溶解于经DEPC处理的灭菌水中，得到稗草叶片的总RNA。以此稗草叶片的总RNA为模板，用ImProm-IITMReverseTranscriptase试剂盒(promega公司)反转录合成cDNA，反应体系为RNA 1μg，oligo(dT)150.5μg，用经DEPC处理的灭菌水补足至5μL。70℃，5min，再4℃，5min后迅速冰浴。然后分别加入ImProm-IITM5×Reaction Buffer 4μL，MgCl2(25mM)2.4μL，dNTP mix(10mM)1μL，rRNasin Ribonuclease Inhibitor 20u，ImProm-IITMReverse Transcriptase 1μL，用经DEPC处理的灭菌水补足反应体系至20μL，充分混匀。反应条件为25℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 15min，4℃保存，得到稗草的cDNA。
2、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的克隆对甘蔗、玉米、小麦、水稻等数种C3和C4禾本科植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA序列进行同源性比对，比对结果表明ppc的5’端和3’端序列均比较保守。因此，根据已报道的甘蔗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的cDNA全长序列，设计一对引物，引物序列为P15’-ACTTCTAGAATGGCGTCCGAGCGGCACC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Xba I识别位点)P25’-GTAGGTACCCTAGCCGGTGTTCTGCA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Kpn I识别位点)以步骤1得到的稗草cDNA为模板，在引物P1和引物P2的引导下，进行PCR扩增。50μL PCR反应体系为2×GC缓冲液(TaKaRa公司)25μL，dNTPmix 16μL，P1 1μL(5μM)，P2 1μL(5μM)，LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)2.5U，模板DNA约1μg，用经DEPC处理的灭菌水补足至50μL。PCR反应条件为先94℃ 5min；然后94℃ 30s，70℃ 30s，70℃ 3min，共30个循环，最后70℃ 10min。反应结束后，将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，切下约3000bp的目的条带，用PCR产物纯化试剂盒(北京博大泰克公司)回收DNA。将回收的DNA用T4DNA连接酶(Promega公司)与载体pUCm-T(上海生工)连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，取200μL菌液与4μL IPTG及40μL X-gal(20mg/mL)在LB平板进行蓝白斑筛选，长出单菌落后，挑取若干白斑菌落提质粒，对所提的质粒DNA用限制性内切酶Xba I和Kpn I进行酶切鉴定，可产生约2900bp和2700bp条带的为阳性克隆，将阳性克隆送至上海生物工程公司进行序列测定，测序结果表明PCR扩增产物长度为2906bp，其开放阅读框(ORF)为自5’端第1-2886位碱基，具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，编码具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质，将该序列命名为Eppc，将含有Eppc的重组质粒载体命名为PUCm-Eppc。在NCBI网站上用BLAST搜索软件对该基因的核苷酸序列进行同源性检索，结果在GenBank、EMBL、DDBJ和PDB数据库中均显示该序列为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因序列，用Clustal W软件对筛选出的部分C3、C4植物进行核苷酸序列的多重比对分析，其中同源率较高的植物依次是谷子(Setariaitalica)、高粱(Sorgham bicolor)、玉米(Zea mays)和水稻(Oryza stativa)，相应同源区段的同源率分别为94.8％、93.2％、93.0％和89.7％。证明所克隆的DNA片段为稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化基因的全长cDNA。再筛选几种典型的C3、C4植物的不同形式的PEPCase蛋白序列运用ClustalW软件进行氨基酸序列的多重比对分析，结果与玉米、高粱的根型，谷子和水稻的C3型PEPCase同源性极高，可分别达到96.5％、96.4％、96.4％和94.3％，与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C4型PEPCase的同源性分别为82.2％、79.1％、77.1％、76.6％。
实施例2、稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因Eppc的功能验证一、含有Eppc的植物表达载体的构建1、植物表达载体pUbi-Eppc的构建含有Eppc的植物表达载体pUbi-Eppc的构建流程如图1所示，具体方法如下先用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切含Ubiquitin1启动子和NOS终止子的质粒载体pUC-Pubi(其物理图谱如图1a所示)，对酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约为2.0kb的目的条带，将回收片段与经相同酶双酶切载体pCAMBIA1301(其物理图谱如图1b所示，购自澳大利亚CAMBIA公司)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选后获得中间载体，命名为pCAMBIA1301-pUbiFPF1；再用限制性内切酶Xba I和Kpn I对载体pCAMBIA1301-pUbiFPF1进行双酶切，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约为12，000kb的含NOS终止子的大片段，将该片段命名为pCAMBIA1301-NOS-Ter，用相同酶对实施例1构建的载体PUCm-Eppc进行双酶切，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约为2.9kb的目的基因Eppc片段，然后将2.9Kb的Eppc片段与pCAMBIA1301-NOS-Ter连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经筛选后获得中间载体，命名为pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter，最后用限制性内切酶Xba I单酶切pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter和pUC-Pubi，去磷酸化后进行连接，将Ubiquitin1启动子连入pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter中的Eppc前端，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对其进行蓝白筛选，挑选阳性单克隆提质粒并进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示(泳道1为1kb DNA Ladder，泳道2为所提质粒，泳道3为经Sal I和Kpn I双酶切的质粒，泳道4为经Xba I和Kpn I双酶切的质粒，泳道5为经Hind III和Kpn I双酶切的质粒)，经Hind III和SalI双酶切可得到大小约16，000kb条带的为正向连接的阳性克隆，将该阳性克隆质粒命名为pUbi-Eppc。
2、植物表达载体pRbcS-Eppc的构建含有Eppc的植物表达载体pRbcS-Eppc的构建流程如图3所示，具体方法如下先用限制性内切酶PstI对载体pCAMBI1301进行酶切，片断回收后去磷酸化处理，将去磷酸化的酶切片段与经相同酶酶切且经去磷酸化处理的含RuBPCase基因小亚基启动子的载体pRGN(其物理图谱如图3a所示)连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，经筛选后获得中间载体，命名为pCB-PRbcS，然后用限制性内切酶HindIII和Xba I双酶切质粒载体pCB-PRbcS，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约为2.7kb的RuBPCase基因小亚基启动子片段，然后将该启动子片段与步骤1构建的经Hind III和Xba I双酶切的载体pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对其进行蓝白筛选，挑选阳性单克隆提质粒并进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道1为经Xba I和Kpn I双酶切的质粒，泳道2为经Xba I和Hind III双酶切的质粒，泳道3为经Hind III和EcoR I双酶切的质粒，泳道4为经Hind III和EcoR V双酶切的质粒，泳道5为DL15，000 DNAMarker，泳道6为所提质粒)，经HInd III和EcoRV双酶切可得到大小约2.4kb条带的为正向连接的阳性克隆，将该阳性克隆质粒命名为pRbcS-Eppc。
3、植物表达载体pZMp-Eppc的构建含有Eppc的植物表达载体pZMp-Eppc的构建流程如图5所示，具体方法如下先用限制性内切酶Hind III和Xba I对含有玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的启动子的载体PUCm-T-ZMp(其物理图谱如图5a所示)进行酶切，对酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，回收大小约为1.3kb的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的启动子序列片段，然后将该启动子片段与步骤1构建的经相同酶双酶切的载体pCAMBIA1301-Ecppc-NOS-Ter连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，对其进行蓝白斑筛选，挑选阳性单克隆提质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图6所示(泳道1为DL15，000DNA Marker，泳道2为所提质粒，泳道3为经Xba I和Kpn I双酶切的质粒，泳道4为经Hind III和Xba I双酶切的质粒，泳道5为经Hind III和Kpn I双酶切的质粒，泳道6为1kb DNA Ladder)。
二、Eppc转基因植株的获得及其光合作用的功能验证植物材料中花8号水稻和旱稻65分别将步骤一构建的Eppc的植物表达载体pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc、pZMp-Eppc用农杆菌介导法转化水稻，得到219株转稗草Eppc的T0代植株(由愈伤组织分化得到的转基因植株)。对其中30株转基因植株进行光合性能鉴定，结果如表1和表2所示，光合速率高于对照30％的植株占23.33％(共计7株)，光合速率最高的植株高于对照(未转基因植株)45％。表明转Eppc能够显著提高C3作物的光合速率、蒸腾速率和水分利用效率。同时，对转入玉米PEPC基因的水稻，共测定5个单株(株号ZH65，ZH65-1，ZH65-2，ZM-2，ZM-3)，其中只有1株(ZH65)的光合速率略高于对照，其余均低于对照。
表1转入Ubiquitin和Rubisco启动子控制转稗草Eppc基因的水稻净光合速率
表2转稗草Eppc基因的水稻净光合速率Pn、气孔导度Gs、胞间CO2浓度Ci、蒸腾速率E及水分利用效率WUE(Pn/Trmmol)各频率区平均植变化趋势
注1.蒸腾速率E的单位μmol·m-2·S-1；2.气孔导度Gs的单位为mmol·m-2·S-1；3.净光合速率Pn的单位为μmol·m-2·S-14.胞间CO2浓度Ci的单位为ppm(mg/L)。
序列表<160>2<210>1<211>2886<212>DNA<213>稗属稗草(Echinochloa crusgalli)<400>1atggcgtccg agcggcacca gtcgatcgac gcgcagctgc ggctgctggc gccgggcaag60gtctccgagg acgacaagct cgtcgagtac gacgccctcc tcgtcgaccg cttcctcgac120atcctacagg acctgcacgg cccgcacctc cgcgaattcg tgcaggagtg ctacgagctg180tcggcggagt acgagaacga ccgcgacgag gcgcggctcg gcgagctcgg gagcaagctc240accagcctgc ccccggggga gtccatcgtc gtcgccagct ccttctcgca catgctcaac300ctcgccaacc tcgccgagga agtgcagatc gcgcaccgcc gccggatcaa gctcaagcgc360ggggacttcg ccgacgaggc ctcggcgccc accgagtccg acatcgagga gacgctcaag420cgcctcgtct cgcagctcgg caagtcgcgc gaggaggtct tcgacgcgct caagaatcag480accgtcgacc tcgtcttcac ggcgcaccct acgcagtccg tcaggaggtc cctgctccag540aagcacggca ggatccggaa ttgcctgagg cagctgtatg ccaaggacat cactgctgat600gacaagcagg agcttgatga ggctcttcag agggagattc aggctgcttt cagaactgat660gaaatccgca gaacccctcc cactcctcaa gatgaaatgc gtgctggaat gagttacttc720catgaaacta tatggaaggg tgtaccaaaa ttcttgcgtc gtattgacac tgctctgaaa780aatattggga tcaatgagcg tctcccttac aatgcccctc ttattcagtt ctcttcctgg840atgggtggtg atcgtgatgg aaatccaaga gttacaccgg aggttacacg ggatgtgtgc900ttgttggcga gaatgatggc tgctaacctg tacttctctc agatagaaga tctaatgttt960gagctctcta tgtggcgctg cagtgatgaa cttcggatcc gtgcagatga tttacatcgg1020tctacaaaaa gggctgcaga gcactatata gaattctgga agcaagttcc tccaaatgaa1080ccttatcgtg tcatacttgg tgatgtcagg gataaattgt attatacacg agaacgttct1140cgtcatttgt tgacaactgg aatttctgag attcctgagg atgcaacttt tacgaatgtt1200gaacagtttc tggaacctct tgagctctgt tatagatcat tatgtgcctg tggtgacaaa1260cctatagctg acggaagtct ccttgatttc ttgcgtcaag tatcaacttt cgggcttgct1320
cttgtgaaac tcgacatcag gcaggaatct gatcggcaca ctgacgtcct tgattcaata1380accacacatc ctggaattgg atcctatgct gagtggtcgg aggagaaacg ccaggattgg1440ctgttgtctg aactgagggg caagcgtcca ttgtttggtt ctgatcttcc tctgactgaa1500gagactgctg atgttttggg cacatttcat gtcctcgcag agctcccaac agattgcttt1560ggcgcgtata tcatctcgat ggcaactgcc ccgtctgatg tgcttgctgt cgagcttttg1620cagcgtgagt gccatgtaaa acagccactg agagttgttc cactctttga gaaacttgca1680gatcttgaag cagccccagc agccgtagca cgactctttt ctattgactg gtacatgaat1740aggattaatg gcaagcagga ggtgatgatt ggatactcag actctggtaa agacgctgga1800cgtctctctg caacatggca aatgtataaa gcacaagagg agctgatcaa ggtggcaaag1860cattatggag taaagttgac aatgtttcac ggaaggggtg gaactgttgg cagaggaggt1920ggtcccactc atctggccat attatctcag ccaccagaca ctatacatgg atcacttcgt1980gtaacagtac aaggtgaggt tattgagcac tcctttggag aggagctctt gtgctttagg2040actttgcaac gctacactgc agctaccctt gagcatggca tgcatcctcc aatttcccca2100aagccagaat ggcgtgctct gatggatgaa atggctattg tggcaaccaa agaatatcga2160tcaattgtct tccaagaacc acgctttgtc gaatacttcg ggtcggccac acctgagact2220gaatatggta ggatgaatat tgatagtcgt ccatcgaaga ggaggcctag tgggggaata2280gaatcgctcc gtgcaattcc atggatcttt gcttggacac agacaaggtt ccatccccct2340gtttggctgg gatttggtgc agcgttcaag catatcatgc agaaggacat caggaacacc2400catactctga aagaaatgta caatgagtgg ccattctcca gggtaactct tgacttgctt2460gagatggttt tcgccaaggg agacccggga atcgcagctg tatacgacaa attgctagtt2520gctgatgatc tgcaatcctt cggagagcag ctgaggaaga actatgagga gacaaaagag2580ctactccttc aggttgctgg tcacaaggac gtccttgaag gcgatcctta cctgaagcag2640cgtctgcgcc tgcgtgagtc gtacatcacc accctgaacg tatgccaggc gtacaccctg2700aagcggattc gcgaccccag cttccaggtg agcccgcagc cggccctgtc caaggagttc2760gttgacgaga gccagcctgc ggagctggtg cgactgaacc ctgagagcga gtacgcgccg2820ggcctggaga acacgctgat cctgaccatg aagggcattg ccgccggcat gcagaacacc2880ggctag 2886<210>2<211>961<212>PRT<213>稗属稗草(Echiochloa crusgalli)
<400>2Met Ala Ser Glu Arg His Gln Ser Ile Asp Ala Gln Leu Arg Leu Leu1 5 10 15Ala Pro Gly Lys Val Ser Glu Asp Asp Lys Leu Val Glu Tyr Asp Ala20 25 30Leu Leu Val Asp Arg Phe Leu Asp Ile Leu Gln Asp Leu His Gly Pro35 40 45His Leu Arg Glu Phe Val Gln Glu Cys Tyr Glu Leu Ser Ala Glu Tyr50 55 60Glu Asn Asp Arg Asp Glu Ala Arg Leu Gly Glu Leu Gly Ser Lys Leu65 70 75 80Thr Ser Leu Pro Pro Gly Glu Ser Ile Val Val Ala Ser Ser Phe Ser85 90 95His Met Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gln Ile Ala His100 105 110Arg Arg Arg Ile Lys Leu Lys Arg Gly Asp Phe Ala Asp Glu Ala Ser115 120 125Ala Pro Thr Glu Ser Asp Ile Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu Val Ser130 135 140Gln Leu Gly Lys Ser Arg Glu Glu Val Phe Asp Ala Leu Lys Asn Gln145 150 155 160Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gln Ser Val Arg Arg165 170 175Ser Leu Leu Gln Lys His Gly Arg Ile Arg Asn Cys Leu Arg Gln Leu180 185 190Tyr Ala Lys Asp Ile Thr Ala Asp Asp Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ala195 200 205Leu Gln Arg Glu Ile Gln Ala Ala Phe Arg Thr Asp Glu Ile Arg Arg210 215 220Thr Pro Pro Thr Pro Gln Asp Glu Met Arg Ala Gly Met Ser Tyr Phe225 230 235 240
His Glu Thr Ile Trp Lys Gly Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Ile Asp245 250 255Thr Ala Leu Lys Asn Ile Gly Ile Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Ala260 265 270Pro Leu Ile Gln Phe Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn275 280 285Pro Arg Val Thr Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg290 295 300Met Met Ala Ala Asn Leu Tyr Phe Ser Gln Ile Glu Asp Leu Met Phe305 310 315 320Glu Leu Ser Met Trp Arg Cys Ser Asp Glu Leu Arg Ile Arg Ala Asp325 330 335Asp Leu His Arg Ser Thr Lys Arg Ala Ala Glu His TyrIle Glu Phe340 345 350Trp Lys Gln Val Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg ValIle Leu Gly Asp355 360 365Val Arg Asp Lys Leu Tyr Tyr Thr Arg Glu Arg Ser Arg His Leu Leu370 375 380Thr Thr Gly Ile Ser Glu Ile Pro Glu Asp Ala Thr Phe Thr Asn Val385 390 395 400Glu Gln Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr Arg Ser Leu Cys Ala405 410 415Cys Gly Asp Lys Pro Ile Ala Asp Gly Ser Leu Leu Asp Phe Leu Arg420 425 430Gln Val Ser Thr Phe Gly Leu Ala Leu Val Lys Leu Asp Ile Arg Gln435 440 445Glu Ser Asp Arg His Thr Asp Val Leu Asp Ser Ile Thr Thr His Pro450 455 460Gly Ile Gly Ser Tyr Ala Glu Trp Ser Glu Glu Lys Arg Gln Asp Trp465 470 475 480Leu Leu Ser Glu Leu Arg Gly Lys Arg Pro Leu Phe Gly Ser Asp Leu485 490 495
Pro Leu Thr Glu Glu Thr Ala Asp Val Leu Gly Thr Phe His Val Leu500 505 510Ala Glu Leu Pro Thr Asp Cys Phe Gly Ala Tyr Ile Ile Ser Met Ala515 520 525Thr Ala Pro Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gln Arg Glu Cys530 535 540His Val Lys Gln Pro Leu Arg Val Val Pro Leu Phe Glu Lys Leu Ala545 550 555 560Asp Leu Glu Ala Ala Pro Ala Ala Val Ala Arg Leu Phe Ser Ile Gly565 570 575Trp Tyr Met Asn Arg Ile Asn Gly Lys Gln Glu Val Met Ile Gly Tyr580 585 590Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Thr Trp Gln Met595 600 605Tyr Lys Ala Gln Glu Glu Leu Ile Lys Val Ala Lys His Tyr Gly Val610 615 620Lys Leu Thr Met Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val Gly Arg Gly Gly625 630 635 640Gly Pro Thr His Leu Ala Ile Leu Ser Gln Pro Pro Asp Thr Ile His645 650 655Gly Ser Leu Arg Val Thr Val Gln Gly Glu Val Ile Glu His Ser Phe660 665 670Gly Glu Glu Leu Leu Cys Phe Arg Thr Leu Gln Arg Tyr Thr Ala Ala675 680 685Thr Leu Glu His Gly Met His Pro Pro Ile Ser Pro Lys Pro Glu Trp690 695 700Arg Ala Leu Met Asp Glu Met Ala Ile Val Ala Thr Lys Glu Tyr Arg705 710 715 720Ser Ile Val Phe Gln Glu Pro Arg Phe Val Glu Tyr Phe Gly Ser Ala725 730 735Thr Pro Glu Thr Glu Tyr Gly Arg Met Asn Ile Asp Ser Arg Pro Ser740 745 750
Lys Arg Arg Pro Ser Gly Gly Ile Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp755 760 765Ile Phe Ala Trp Thr Gln Thr Arg Phe His Pro Pro Val Trp Leu Gly770 775 780Phe Gly Ala Ala Phe Lys His Ile Met Gln Lys Asp Ile Arg Asn Thr785 790 795 800His Thr Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Ser Arg Val Thr805 810 815Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly Ile Ala820 825 830Ala Val Tyr Asp Lys Leu Leu Val Ala Asp Asp Leu Gln Ser Phe Gly835 840 845Glu Gln Leu Arg Lys Asn Tyr Glu Glu Thr Lys Glu Leu Leu Leu Gln850 855 860Val Ala Gly His Lys Asp Val Leu Glu Gly Asp Pro Tyr Leu Lys Gln865 870 875 880Arg Leu Arg Leu Arg Glu Ser Tyr Ile Thr Thr Leu Asn Val Cys Gln885 890 895Ala Tyr Thr Leu Lys Arg Ile Arg Asp Pro Ser Phe Gln Val Ser Pro900 905 910Gln Pro Ala Leu Ser Lys Glu Phe Val Asp Glu Ser Gln Pro Ala Glu915 920 925Leu Val Arg Leu Asn Pro Glu Ser Glu Tyr Ala Pro Gly Leu Glu Asn930 935 940Thr Leu lle Leu Thr Met Lys Gly Ile Ala Ala Gly Met Gln Asn Thr945 950 955 960Gly
权利要求
1.稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
3.稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白质。
4.含有权利要求1或2所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
5.一种提高植物光合作用效率的方法，是将权利要求1或2所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入外植体，得到光合作用效率提高的植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可通过含有所述稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体导入植物外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于用于构建所述植物表达载体的出发载体为pCAMBIA1301。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pUbi-Eppc。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pRbcS-Eppc
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述植物表达载体为pZMp-Eppc。
全文摘要
本发明公开了一个稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码蛋白与应用，本发明提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列，该基因编码的蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物光合作用效率的蛋白质。本发明的稗草的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因可显著提高植物的光合作用效率，将在提高农作物的产量中发挥重要的作用。
文档编号C12N9/00GK1865443SQ20051007062
公开日2006年11月22日 申请日期2005年5月17日 优先权日2005年5月17日
发明者赵明, 张桂芳, 丁在松 申请人:中国农业科学院作物科学研究所