计数并鉴别微生物的方法

专利名称：计数并鉴别微生物的方法
技术领域：
本发明涉及一种计数并鉴别微生物的方法。更具体地，本发明涉及一种扩增该微生物的特异成分，然后根据对所扩增的成分产物的测定，在具有很少或无孵育时间的单一步骤中计数膜装置上的微生物的方法。另外，用这个方法可以鉴别所述微生物。
背景技术：
确定液体例如水、食品例如汁、或药品中有无微生物存在的常规方法是将液体过滤通过合适的膜以将液体中所存在的任何微生物都阻挡于膜的表面上。然后将膜放置于加有琼脂或其他合适培养基的生长培养皿例如陪替培养皿中，然后孵育数天以容许被捕获的微生物发展成菌落。
然后取出培养皿肉眼观察，使得可以计数所存在的菌落数目。如果数目足够多，可以进行进一步的测定以准确地确定出存在的是什么生物体。(仅仅存在微生物这一情况本身经常并不说明液体是不安全，且需要进一步的工作来鉴别特殊微生物)。
根据生物体的种类、所规定的它们的孵育时间和生长速度、以及需要进行的附加鉴别试验、以及在工作日期间所取样的时间和在下一个有用的工作日预备好方法的时间，该方法通常需要花费2到14天或更长时间。
最近，用于检测和计数微生物污染的新方法已经帮助将进行测定所需的时间减少到约24个小时甚至更短的时间。例如，ATP生物发光法是产生光能产物的生物化学反应；用该方法，已经能够以在培养基观察检测法中所需生长时间的1/3时间内检测并计数微生物。其他技术利用荧光分子或其他染料从膜上的各种样品中快速地检测微生物。也已经用探针杂交技术在比菌落生长更短的时间内检测并计数膜上的微生物；在这些技术中，将已经在膜上短时间生长的微生物与核酸探针杂交并用检测试剂处理以检测膜表面上所存在的任何微菌落。
US 2003-0003540-A1发展了ATP测定。它将微生物捕获于膜上并在培养基中孵育微生物数小时到1天。首先进行计数测定(通常用生物发光ATP检测法)，然后在第二个测定中将PNA探针用于同一样品以鉴别所发现的微生物。
然而这些测定方法中没有一种能够以与经典的多日观察测定方法相同的准确性和特异性实时(在数小时内)检测、计数和鉴别微生物。本发明提供了在数小时内检测并计数膜表面上的微生物的单一测定方法，并且也可容许在同一过程中进行鉴别。

发明内容
本发明涉及一种利用膜过滤、靶向扩增和检测例如荧光检测或比色检测来检测、计数及鉴别液体中的微生物的方法。本方法关键的特点是采用该扩增步骤可以进行快速检测、计数并鉴别所存在的生物体。扩增针对的是生物体中的一种选定分子例如其DNA或RNA，并将该分子的量增加到能被多种现有的检测技术所检测到的水平，以便确定所存在的靶分子。扩增试剂包括一或多种检测剂，所述检测剂用于表明靶分子存在并能区分出所选定的靶在种或属或甚至门、界水平上的区别。
本发明的一个目的是提供一种计数并鉴别微生物的方法，其包括a)将液体样品过滤通过适用于截留微生物的膜；b)用一或多种含有一或多种检测剂的试剂对膜上的微生物进行扩增步骤；以及c)在存在所选定的检测剂的情况下，确定出是否存在一或多种所截留的微生物，计数所检测到的数目并鉴别该微生物的类型。


图1显示了本发明的一种优选实施方案的示意图。
图2显示了本发明的第二个优选实施方案的示意图。
具体实施方案本发明涉及一种快速检测、计数并鉴别液体或可溶性固体例如粉末、盐、乳膏、片剂等中的微生物的方法。这些液体包括但不限定于水、饮料或奶制品例如牛奶、啤酒、酒、软饮料、果汁、药物、肠外营养、细菌空气计数(bacterial air counts)等。
现有的快速技术可以在比在琼脂或滤膜上生长可见菌落的经典方法远远更短的时间内检测并计数微生物。然而那些检测到的生物体仍是未被鉴别的。本方法满足了对快速检测和计数系统的需要，并可以用种或属分型特异探针、或更高的门或纲水平的特异探针，在扩增反应中对所检测到的微生物进行鉴别。
可想象到的产品是一种膜相关的、靶向扩增反应，例如但不限定于，与例如在可购自麻省的Millipore Corporation of Billerica的MicroStar系统中所用的由亲水区所构成的与疏水网格结合的膜结合的基于聚合酶链反应(PCR)的方法。这里有一些成分由亲水膜覆盖的疏水网格、由核酸、或肽核酸引物、酶、缓冲剂和去污剂所构成的进行靶向扩增的试剂、扩增鸡尾酒中的荧光检测探针、以及进行反应的聚酯薄膜或塑料套袋(也可以采用基于化学发光法或生色法的检测体系)。所需的装置是保持适合于靶向扩增反应温度的温度控制系统，例如PCR反应所需的热循环仪。也需要计数载网膜上表现出阳性信号的亲水孔的检测装置。检测装置可以是如手提式紫外灯一样简单的、或如MicroStar装置一样复杂的装置。
以下面的方法使用本产品。将含有微生物的样品过滤通过载网膜并捕获污染微生物。洗涤后，将扩增试剂喷到膜表面上，将膜放置到Mylar薄膜套袋中并封口。将所封口的含有膜和试剂的套袋放置于控制扩增反应环境的装置中。例如对于PCR反应，由热循环仪构成该装置。完成反应后，将样品放置到检测装置中。装置将检测到那些含有荧光检测探针或一些类似探针所生成的阳性信号的孔。阳性信号与靶向的微生物污染物的存在是一致。该测定对微生物可具有种、属或群水平的特异性，包括细菌、酵母和霉菌、病毒以及原虫。例如，测定将靶向于铜绿假单胞菌种的核酸、所有真的假单胞细菌，或广泛地靶向于所有的革兰阴性细菌、或所有细菌。这能实现对测定样品中的不同类型微生物的测定，并确定任何用户所关心的特定微生物的性质。
图1说明了本发明的第一个优选的实施方案。在这个方法的第一个步骤1中，从待诊断的标本中得到液体形式的样品。例如，在环境例如水源采样中，得到河流、井或储水池中的样品。对于食品或药物产品，从库存中取样(通常是库存成品，不过这并不是必需的)。如果是液体形式，可以简便使用或如需要(因为粘度)可以用去离子水将其稀释。如果是固体形式，将其溶解或分散于合适的液体中，常为水或酒精。
在第二个步骤2中，将样品过滤通过膜性滤膜，然后在步骤3中，用含有一或多种所选定的检测剂的扩增试剂处理滤膜。然后将滤膜放置到例如用于PCR反应的热循环仪的扩增装置中一段时间以扩增样品，达到在步骤4中能用机械的或电子的装置或观察地检测或计数的水平。
图2说明了第二个方法，如图1中的实施方案一样，首先取得样品10并过滤样品以将微生物截留于滤膜表面12上。和图1中的实施方案不同的是，该实施方案在扩增步骤16之前增加了孵育步骤14，使得可以从单个被截留的微生物中发展为微菌落，因此增加了用于扩增的生物体的数目。在扩增步骤之后，在步骤18中计数和/或鉴别生物体。
用于装滤膜的优选装置是具有50mm直径和100ml容积的麻省Millipore Corporation of Billerica的MILLIFLEX过滤漏斗。也可以使用在添加的亲水膜上形成疏水网格的其他装置例如购自麻省MilliporeCorporation of Billerica的SteritestTM或Sterifil过滤单元、或膜支架例如玻璃或不锈钢过滤支架或漏斗。这些装置是熟知的并可从各种渠道购得，包括麻省Millipore Corporation of Billerica和Fisher Scientific，Inc，Pittsburgh，Pennsylvania。
优选的膜是购自麻省Millipore Corporation of Billerica的MicroStar滤膜。该滤膜是具有一系列被延伸到滤膜全层的疏水分割物所分隔的亲水隔室的0.45标定孔大小的PVDF滤膜。本发明可用的其他滤膜也将是亲水的并含有多种疏水分割物。
如上面图2的实施方案所讨论的，将过滤后的样品用于孵育步骤14。优选地，通过将滤膜放置于例如各种琼脂或液体培养基的生长培养基中完成孵育步骤。孵育是短时间的，常为约1个小时到约8个小时。孵育使得被捕获于膜的单个微生物分裂成更大数目的用于扩增的微生物，使得检测更快和更容易，这尤其适合于当微生物的靶是难以扩增的时候。
将滤膜用于短时间的扩增步骤，常为1到5个小时。时间的长度依赖于测定所需的准确性、所选定的扩增技术的扩增速度、所选定的检测试剂、检测该试剂的方法(机械的或人眼)、所测定的生物体的类型、所需的测定速度对测定结果的准确性以及其他因素。
用于扩增的适合方法包括基于核酸的体系，例如聚合酶链反应(PCR)扩增，其中用扩增试剂扩增污染细胞中的DNA或RNA序列。经常通过在热循环仪中放入含有被扩增的生物体的底物(在本情况中是滤膜)，以及在循环期间已经用扩增试剂处理以提高温度约30分钟到90分钟时间来进行PCR。从Applied Biosystems，Inc，或Roche Diagnostics购得进行PCR扩增步骤的商业化可获得的试剂盒。从这些相同的公司中可购得热循环仪。
其他可能的扩增技术包括但不限定于购自Biomerieux的基于核酸序列的扩增(NASBA)、购自Becton Dickenson的链置换扩增(SDA)、或购自Biorad的联动线性扩增(LLA)。也见于EP 1407050A2。
要明白在此以扩增步骤完成本检测所使用的是单个细胞，或是从被膜所捕获的单个细胞发展而来的微生物的微菌落，特别是如果进行孵育步骤的时候，即不是直接检测单个生物体，而是通过检测已经从那些相同的单一生物体中所扩增到的靶分子而计数测定样品中的单个生物体的数目。
在滤膜用于扩增步骤一段适合的时间后，取出滤膜并用于计数步骤4。
优选的计数测定是对扩增靶的荧光检测。然后通过加入到扩增试剂中的检测剂例如荧光标记、放射性标记、生色标记等测定靶分子。然后观察读取或通过具有图像处理器的图像装置例如CCD相机以数字方式读取检测剂。商品化的这样一种体系是麻省Millipore Corporation of Billerica的MicroStar系统。无论使用任何一种方法，都能进行对微生物菌落的计数和定位。
在计数测定期间，也可将样品用于对靶生物体的鉴别测定。它们可以被设计为只与单一的种或整个属特异杂交。检测剂含有表明它们存在于样品中的标记例如酶、半抗原、荧光团或放射性同位素。从多种渠道例如Sigma Genosys可购得这些试剂，这些试剂包括分子信标、双标的荧光探针、或描述荧光探针的荧光标记的探针，不过也可以使用化学发光的、比色的或放射性的检测体系。
可以选择这些试剂的一或多种试剂来检测一或多种生物体。一些试剂用于单个生物体例如大肠杆菌或沙门氏菌种、短乳杆菌(L.brevis)等，同时一些试剂是更通用的并简单地检测细菌属的存在或检测所捕获的生物体是否是细菌、酵母或真菌。根据所选定的试剂，可以用x射线胶片、荧光或比色检测法或其他这样的装置来检测试剂的标记的存在，所述试剂的标记已经随着生物体的靶分子例如DNA或RNA的扩增而被扩增，并因此鉴别出每种靶生物体的数目和类型。
权利要求
1.一种用于检测、计数和鉴别微生物的方法，其包括(a)将液体样品过滤通过适用于截留微生物的膜，(b)将膜用于扩增步骤，其中所述扩增步骤含有一或多种检测剂，以及(c)检测一或多种微生物的存在/不存在、所检测到的微生物的数目以及类型。
2.权利要求1的方法，其中所述液体样品是从50到1000毫升，所述膜选自具有由疏水分隔物所分隔的亲水区域的PVDF膜，扩增步骤的时间为约30分钟到约90分钟，并用适用于所选定的检测剂的装置进行检测。
3.权利要求1的方法，其中所述扩增是基于核酸的扩增体系，且所述检测剂选自荧光标记的核酸、肽核酸探针和它们的混合物，并被数字成像系统所读取。
4.权利要求1的方法，其中所述扩增是聚合酶链反应(PCR)形式的基于核酸的扩增体系，且所述检测剂选自荧光标记的核酸、肽核酸探针和它们的混合物，并被数字成像系统所读取。
5.权利要求1的方法，其中所述扩增是基于核酸的扩增体系，所述试剂选自DNA靶和RNA靶，且所述检测剂选自由荧光标记的核酸、肽核酸探针和它们的混合物，并被数字成像系统所读取。
6.权利要求1的方法，其中所述扩增是聚合酶链反应(PCR)形式的基于核酸的扩增体系，所述试剂选自DNA靶和RNA靶，且所述检测剂选自荧光标记的核酸、肽核酸探针和它们的混合物，并被数字成像系统所读取。
7.权利要求1的方法，其中用选自X射线胶片、对膜上的比色反应的观察检测、对荧光标记的观察检测的方法或用数字成像读取所述检测剂。
8.权利要求1的方法，其中所述扩增步骤选自聚合酶链反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和联动线性扩增(LLA)，且在热循环仪或其他温度控制装置中将膜在从约室温25℃到约90℃的温度下孵育约30分钟到约90分钟。
9.权利要求6的方法，其中在扩增之前将膜孵育1到约4个小时。
10.权利要求1的方法，其中检测剂是荧光标记。
11.权利要求1的方法，其中检测剂是放射性标记。
12.权利要求1的方法，其中检测剂是比色标记。
13.权利要求1的方法，其中检测剂是酶标记。
全文摘要
本发明描述了一种检测、计数和鉴别液体样品中的微生物的方法。本测定方法使用一种滤膜，将液体样品过滤通过该滤膜，且液体中的微生物被沉积于该滤膜上。然后用含有一或多种检测剂的试剂对滤膜进行扩增。此后测定滤膜中是否存在生物体。同时或之后对同一样品或滤膜进行检测，以鉴别靶生物体。
文档编号C12P19/00GK1696305SQ20051006967
公开日2005年11月16日 申请日期2005年5月8日 优先权日2004年5月4日
发明者芭芭拉·扬, 安德鲁·塞奇 申请人:米利波尔公司