专利名称：红小豆铁结合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种红小豆铁结合蛋白及其编码基因与其在培育富铁植物中的应用。
背景技术：
铁是人体进行生理代谢活动所必需的元素之一，缺铁对儿童的智力、体力发育以及免疫、消化吸收等功能均有较大影响。世界范围内约有30％的人口缺铁，其中，以妇女和儿童最为严重。虽然食用添加铁元素的食物以及吃一些补铁药物可以预防和治疗缺铁，但是这种预防和治疗缺铁症的成本过高，难以在发展中国家普及。
铁结合蛋白是存在于植物细胞质体中的一种专门储存铁的蛋白质。Goto et al用农杆菌介导法，将水稻种子储藏蛋白特有启动子GluB-1和大豆铁结合蛋白基因导入水稻，得到的转基因水稻T1代种子的铁含量为非转基因水稻种子的3倍以上(GotoF Yoshihara T，Shigemoto N，Takaiwa F，1999，Ironfortifiation of rice seedby the soybean ferritin gene.Nature Biotechology，17282-286)。将这种铁蛋白转基因水稻在缺铁的老鼠中也进行了试验，结果表明转基因水稻提供的铁源与以其它形式提供的生物有效铁源可达到相同的治疗效果(Murray-Kolb LE，Takaiwa F GotoF et al.2002，Transgenic rice is a source of iron for iron for iron-depletedrats.J Nutr，132(5)957-960)。
植物中有关铁结合蛋白基因的分离和克隆已涉及到大豆、豌豆、豇豆、苜蓿、玉米、油菜、拟南芥、马铃薯和兰花等植物，但这些基因我国不拥有自主知识产权。此外，有关红小豆中铁结合蛋白基因的克隆在国内外尚无报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种红小豆铁结合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的红小豆铁结合蛋白，名称为A-Fer，来源于豇豆属红小豆(Vignaangularis)，它具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有富集铁作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由255个氨基酸残基组成。
本发明所提供的红小豆铁结合蛋白的编码基因(A-Fer)，也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为65℃条件下杂交和洗膜，洗膜液为0.1×SSC、0.1％SDS。
序列表中的SEQ ID №2由1030个碱基组成，其编码序列为自5’端第81-848位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增A-Fer中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用植物表达载体，将本发明的红小豆铁结合蛋白基因导入植物细胞，可获得含铁量提高的转基因细胞系及转基因植株。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用A-Fer构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明A-Fer的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是红小豆、大豆、生菜、拟南芥等双子叶植物。
本发明提供的红小豆铁结合蛋白的编码基因将在培育富铁植物中具有重要的应用价值，为解决目前普遍存在的铁缺乏问题提供了一条经济、有效的途径。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为3’RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为第一次5’RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图3为第二次5’RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为第三次5’RACE扩增产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果图5为红小豆铁结合蛋白基因A-Fer的植物表达载体pCambia1301-UbiN-Fer的部分物理图谱图6为在潮霉素培养基中经二轮筛选得到的旱稻297的成熟胚愈伤组织图7为红小豆铁结合蛋白基因A-Fer转基因水稻的PCR检测结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、红小豆铁结合蛋白基因A-Fer的克隆一、采用3’RACE扩增A-Fer的3’端序列从基因库中搜索到其它植物的铁结合蛋白的氨基酸序列，用DNAssist软件进行序列比对，得到植物铁结合蛋白保守的氨基酸残基序列“AYFDRDN”，根据此氨基酸残基序列设计简并引物，再用DNAssist软件对上述铁结合蛋白基因的核苷酸序列进行序列比对，以降低简并性，最终设计的3’RACE的引物序列为5’-TACTTNGACAGNGACAACG-3’。采用TaKaRa公司的3’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书进行操作，扩增红小豆铁结合蛋白基因(命名为A-Fer)的3’端序列，反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M为Marker，泳道1-4为3’RACE扩增产物)，回收600-700bp之间的目的条带(箭头所指)进行测序，测序结果表明此3’RACE扩增产物具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列，自5’端第1-19位碱基为3’RACE引物序列，自5’端第615-636位碱基为3’端接头引物序列(TaKaRa公司)。NCBI Blastn分析结果表明该序列与植物铁结合蛋白基因同源，其中，与菜豆和大豆的铁蛋白基因部分序列的同源性可达90％以上，表明该扩增片段为红小豆铁结合蛋白基因的3’端序列。
二、采用5’RACE扩增A-Fer的5’端序列采用TaKaRa公司5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书进行操作，扩增A-Fer的5’端序列，由于用此5’RACE试剂盒每次扩增的片断较短，因此本实施例共进行了三次5’RACE扩增，具体过程如下1、第一次5’RACE扩增根据步骤一扩增出的红小豆铁蛋白基因的3’端序列，设计反转录引物和两对反向PCR引物，引物序列如下反转录引物5-P-15’-(P)CTGCCACACTGT-3’(5’端磷酸化)5-A1(1)5’-TGTGGAAAAGGGGGATGC-3’5-S1(1)5’-TCTTCCACCACGAGTGTTCTG-3’5-A2(1)5’-AGAAGTTGGTGAATGAG-3’5-S2(1)5’-TTGGAAAGCTACGTTGTC-3’采用巢式PCR法进行扩增，除扩增引物和退火温度不同外，反应体系及反应条件均参照5’RACE试剂盒说明书，第一轮扩增引物为5-A1(1)和5-S1(1)，第二轮扩增引物为5-A2(1)和5-S2(1)，退火温度均为58℃。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示(泳道M为Marker，泳道1为第一轮PCR产物原液，泳道2为第一轮PCR产物的10倍稀释液，泳道3为第一轮PCR产物的100倍稀释液)，回收约200bp的目的条带(箭头所指)，进行测序，测序结果表明此5’RACE扩增产物具有序列表中SEQ ID №4的核苷酸序列，自5’端第1-17位碱基为引物5-A2(1)序列，自5’端第33-45位碱基为反转录引物5-P-1引物序列，自5’端第175-193位碱基为引物5-S2(1)序列，自5’端第46-163位碱基为长度为118bp的新扩增区域。NCBI Blastn分析结果表明该序列为植物铁结合蛋白基因的部分序列。
2、第二次5’RACE扩增根据步骤一扩增出的红小豆铁结合蛋白基因的3’端序列和第一次5’RACE扩增片段序列，设计第二次5’RACE反转录引物和两对反向PCR引物，引物序列如下反转录引物5-P-25’-(P)CAAATCCCTTG-3’PCR扩增引物5-A1(2)5’-ACCACTCCTTGTTTGCATAC-3’5-S1(2)5’-TCGCAATCATCAGCGTAATAC-3’5-A2(2)5’-TGACAGGGACAACGTAGCTTTC-3’5-S2(2)5’-ACGAAACCTGTGGAGCAG-3’采用巢式PCR法进行扩增，除扩增引物和退火温度不同外，反应体系及反应条件均参照5’RACE试剂盒说明书，第一轮扩增引物为5-A1(2)和5-S1(2)，第二轮扩增引物为5-A2(2)和5-S2(2)，退火温度均为56℃。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为Marker，泳道1为第一轮PCR产物原液，泳道2为第一轮PCR产物的10倍稀释液，泳道3为第一轮PCR产物的100倍稀释液)，回收200-300bp之间的目的条带(箭头所指)，进行测序，测序结果表明此5’RACE扩增产物具有序列表中SEQ ID №5的核苷酸序列，自5’端第1-21位碱基为引物5-A2(2)序列，自5’端第22-33位碱基为反转录引物5-P-2序列，自5’端第206-225位碱基为引物5-S2(2)序列，自5’端第34-203位碱基为长度为171bp的新扩增区域。NCBI Blastn分析结果表明该序列为植物铁结合蛋白基因的部分序列。
3、第三次5’RACE扩增根据步骤一扩增出的红小豆铁蛋白基因的3’端序列和两次5’RACE扩增片段的序列，设计第三次5’RACE反转录引物和两对反向PCR引物，引物序列如下反转录引物5-P-(2)5’-(P)CAAATCCCTTG-3’PCR扩增引物5-A1(3)5’-ACCACTCCTTGTTTGCATAC-3’5-S1(3)5’-CAGTGAGAGGCGCAGTTGAGG-3’5-A2(3)5’-TGACAGGGACAACGTAGCTTTC-3’5-S2(3)5’-TCTGCTTTCCCCTTTCTTATTC-3’采用巢式PCR法进行扩增，除扩增引物和退火温度不同外，反应体系及反应条件均参照5’RACE试剂盒说明书，第一轮扩增引物为5-A1(3)和5-S1(3)，第二轮扩增引物为5-A2(3)和5-S2(3)，退火温度均为60℃。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M为Marker，泳道1为第一轮PCR产物的100倍稀释液，泳道2为第一轮PCR产物的10倍稀释液，泳道3为第一轮PCR产物原液)，回收200-300bp之间的目的条带(箭头所指)，进行测序，测序结果表明此5’RACE扩增产物具有序列表中SEQ ID №6的核苷酸序列，自5’端第1-21位碱基为引物5-A2(3)序列，自5’端第22-32位碱基为反转录引物5-P-2序列，自5’端第33-159位碱基为长度为127bp的新扩增区域。NCBI Blastn分析结果表明该序列为植物铁结合蛋白基因的部分序列。
将3’RACE和5’RACE扩增的序列拼接起来，得到红小豆铁蛋白基因A-Fer的cDNA序列，具有序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列，由1030个碱基组成，其编码序列为自5’端第81-848位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。进行序列的同源性比对，比对结果如表1所示，表明该红小豆铁结合蛋白基因所编码的蛋白质序列与其他植物铁结合蛋白基因具有较高的同源性，其中，与菜豆和大豆的铁结合蛋白基因的CDS编码的蛋白质序列的同源性可达90％以上。
表1红小豆铁结合蛋白基因CDS编码的蛋白质序列同源性比对结果
实施例2、转红小豆铁结合蛋白基因A-Fer水稻的获得、分子检测及铁含量测定一、A-Fer转基因水稻的获得及其PCR检测1、红小豆铁蛋白基因植物表达载体的构建根据红小豆铁蛋白基因的CDS序列设计引物，引物两端引入酶切位点CDS-P-ATG5’-TCCCCCGGGATGGCCCTTGCTCCATCTAAAG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶SmaI识别位点及保护碱基)CDS-P-TGA5’-GACTAGTTCAAGCAGCATGTCCATC-3’(带下划线碱基为限制性内切酶SpeI识别位点及保护碱基)以红小豆的基因组DNA为模板，在引物CDS-P-ATG和引物CDS-P-TGA的引导下，PCR扩增红小豆铁蛋白基因的CDS序列，再将该序列克隆入植物表达载体pCambia1301-UbiN(GenBank号AF234296)多克隆位点的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到红小豆铁蛋白基因A-Fer的植物表达载体，命名为pCambia1301-UbiN-A-Fer，该载体部分物理图谱如图5所示。
2、红小豆铁蛋白基因植物表达载体转化水稻将步骤1构建的红小豆铁蛋白基因A-Fer的植物表达载体pCambia1301-UbiN-A-Fer用基因枪法转化旱稻297成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，获得的抗性愈伤组织如图6所示，再经预分化、分化得到抗性植株。
3、抗性植株的PCR检测提取步骤2抗性植株的基因组DNA，以此为模板，在引物15’-TCAACTGCGCCTCTCACTG-3’和引物25’-TTGCGATCTGCCACACTG-3’抗性植株的PCR检测，PCR反应条件为先94℃ 3min；再94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 90sec，共30个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7所示(泳道M为Marker，泳道1-12为不同转基因株系的PCR扩增产物)，转基因阳性植株可扩增出约500bp的条带，表明获得了红小豆铁结合蛋白基因A-Fer的转基因水稻。
二、A-Fer转基因植株的铁含量测定取步骤一获得的不同株系的红小豆铁结合蛋白基因A-Fer的转基因水稻的叶片进行铁含量测定(以野生型植株为对照)，测定结果如表2所示，转基因植株的铁含量明显高于对照，与野生型植株相比，转基因植株的铁含量最高可增加2倍。
表2转铁蛋白基因水稻叶片中铁含量的测定结果
序列表<160>6<210>1<211>255<212>PRT<213>豇豆属红小豆(Vigna angularis)<400>1Met Ala Leu Ala Pro Ser Lys Val Ser Pro Phe Ser Gly Phe Ser Leu1 5 10 15Ser Asp Cys Val Gly Gly Ala Ala Arg Asn Pro Thr Cys Ser Val Ser20 25 30Leu Ser Phe Leu Asn Lys Lys Gly Glu Ser Arg Asn Leu Gly Val Ser35 40 45Ala Ser Thr Ala Pro Leu Thr Gly Val Ile Phe Glu Pro Phe Glu Glu50 55 60Val Lys Lys Glu Glu Leu Ala Val Pro Thr Ala Pro Gln Val Ser Leu65 70 75 80Ala Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Asp Cys Glu Pro Ala Ile Asn Glu Gln85 90 95Ile Asn Val Glu Tyr Asn Ala Ser Tyr Val Tyr His Ser Leu Phe Ala100 105 110Tyr Phe Asp Arg Asp Asn Val Ala Leu Lys Gly Phe Ala Lys Phe Phe115 120 125Lys Glu Ser Ser Glu Glu Glu Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys130 135 140Tyr Gln Asn Thr Arg Gly Gly Arg Val Val Leu His Ser Ile Lys Asn145 150 155 160Val Pro Ser Glu Phe Glu His Val Glu Lys Gly Asp Ala Leu His Ala165 170 175
Met Glu Leu Ala Leu Ser Leu Glu Lys Leu Val Asn Glu Lys Leu Arg180 185 190Ser Val His Ser Val Ala Asp Arg Asn Asn Asp Pro Gln Leu Ala Asp195 200 205Phe Ile Glu Ser Glu Phe Leu Ser Glu Gln Val Glu Ala Ile Lys Lys210 215 220Ile Ser Glu Tyr Val Ala Gln Leu Arg Arg Val Gly Lys Gly His Gly225 230 235 240Val Trp His Phe Asp Gln Ser Leu Leu His Asp Gly His Ala Ala245 250 255<210>2<211>1030<212>DNA<213>豇豆属红小豆(Vigna angularis)<400>2ttgtctcttc tacttccctc tccatttcct ttccctgttt ctcagccttt ttcgattacc 60cttttggaga ttttgatctc atggcccttg ctccatctaa agtttctccc ttttctgggt120tctccctctc agactgtgtt gggggtgccg cgagaaaccc aacttgttct gtttctttga180gttttctgaa taagaaaggg gaaagcagaa accttggggt ttctgcctca actgcgcctc240tcactggggt gatctttgaa ccctttgagg aggttaagaa ggaagagctc gctgttccca300ctgctccaca ggtttcgttg gctcgtcagt attacgctga tgattgcgaa cctgcgatta360acgagcagat taatgtggaa tacaatgctt cctatgtgta ccactccttg tttgcatact420ttgacaggga caacgtagct ctcaagggat ttgccaagtt cttcaaggaa tctagtgaag480aagaaagaga gcatgctgaa aagcttatga aatatcagaa cactcgtggt ggaagagttg540ttcttcactc catcaagaat gtaccctcag aatttgagca tgtggaaaag ggggatgcat600tacatgcaat ggaattagct ttgtctttgg agaagttggt gaatgagaaa cttcggagtg660tgcacagtgt ggcagatcgc aacaatgacc ctcaattggc tgacttcata gaaagcgagt720ttctgtctga acaggttgaa gcaattaaga agatatcaga gtatgtggct caactgagga780gggtcggaaa gggtcacggt gtgtggcact ttgatcaaag tcttcttcat gatggacatg840ctgcttgaat agtctttata gttctcgttt ccatttgttc ttccatcgcc ttctgagctg900
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<210>5<211>223<212>DNA<213>豇豆属红小豆(Vigna angularis)<400>5tgacagggac aacgtagctt tcaagggatt tgctcagact gtgttggggg tgccgcgaga 60aacccaactt gttctgtttc tttgagtttt ctgaataaga aaggggaaag cagaaacctt120ggggtttctg cctcaactgc gcctctcact ggggtgatct ttgaaccctt tgaggaggtt180aagaaggaag agctcgctgt tcccactgct ccacaggttt cgt 223<210>6<211>241<212>DNA<213>豇豆属红小豆(Vigna angularis)<400>6tgacagggac aacgtagctt tcaagggatt tgttgtctct tctacttccc tctccatttc 60ctttccctgt ttctcagcct ttttcgatta cccttttgga gattttgatc tcatggccct120cgctccttct aaagtttctc ccttttctgg gttctccctc tcagactgtg ttgggggtgc180cgcgagaaac ccaacttgtt ctgtttcttt gagttttctg aataagaaag gggaaagcag240a24权利要求
1.红小豆铁结合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有富集铁作用的蛋白质。
2.权利要求1所述红小豆铁结合蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述基因具有序列表中SEQ ID№2的DNA序列。
5.含有权利要求2或3或4所述基因的表达载体。
6.含有权利要求2或3或4所述基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求2或3或4所述基因的宿主菌。
8.一种培育富铁植物的方法，是利用植物表达载体将权利要求2或3或4所述的红小豆铁结合蛋白基因导入植物细胞，获得含铁量提高的转基因细胞系及转基因植株。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述被转化的植物宿主为红小豆、水稻、玉米、小麦、大豆或生菜。
全文摘要
本发明公开了一种红小豆铁结合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种红小豆铁结合蛋白及其编码基因与其在培育富铁植物中的应用。该蛋白具有下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有富集铁作用的蛋白质。其编码基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明的基因将在培育富铁植物中具有重要的应用价值，为解决目前普遍存在的铁缺乏问题提供了一条经济、有效的途径。
文档编号C12N15/29GK1687418SQ20051006834
公开日2005年10月26日 申请日期2005年5月8日 优先权日2005年5月8日
发明者付永彩, 刘燕, 孙传清, 朱作峰, 徐杰 申请人:中国农业大学