专利名称：水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基的合成基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，具体地说涉及采用计算机辅助设计基因DNA顺序，DNA的全合成和重组技术以及基因表达调控等基因工程学，使大肠杆菌产生与从水稻叶子中分离得到的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基具有相同氨基酸顺序的多肽。
核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，EC4，1，1，39，缩写Rubisco)广泛存在于光合自养生物中。在高等植物中Rubisco存在于叶绿体质体中，含量一般占可溶性叶蛋白50%以上，是自然界最丰富的一种蛋白[Ellis，R.J.，Trendg in Biol，Sci.(1979)4，241-244]。它是一双功能酶，作为羧化酶，它催化碳固定循环(光合成)中的第一步反应，即核酮糖1，5二磷酸(RUBP)与CO2的反应，据估计地球上的植物每年约固定5x1014千克CO2使之成为有机碳;作为加氧酶，它催化光呼吸过程的第一个反应，光呼吸导致一部分被固定的碳再被释放到空气中去。Rubisco显然是光合作用中的关键性酶，但是它的催化活性不高，不是一种高效的催化剂。因此，“改良”Rubisco，即改善其羧化与加氧的相对活性并提高其催化效率，使之更有效地固定有限的CO2，从而加快植物生产，是众多科学家研究Rubisco的最终目标。
Rubisco具有复杂的亚基结构，除去某些紫色非硫细菌中的Rubisco仅由一种亚基组成外，所有其他来源的Rubisco大多数是由8个大亚基(分子量各为50-55kD)和8个小亚基(分子量各为12-18kD)组成，即这种蛋白质的亚基结构为L8Sa。催化部位在大亚基上，但是没有小亚基结合在大亚基上，酶的活性极其微弱(约为全酶的0.5%)[Piarce，J.，Plant Biol.(1989)8，189]。
水稻是亚洲地区主要的粮食作物，选择水稻Rubisco作为研究对象，探索其结构与功能的关系，提高水稻的光合作用效率，具有现实意义。已有的研究表明，象其它植物一样，水稻Rubisco由8个相同的大亚基(缩写rbcL)和8个相同的小亚基(缩写rbcS)组成，其大亚基(简称RrbcL)由叶绿体基因编码，基因顺序已被测定，从DNA顺序推导的RrbcL具有477个氨基酸残基[参见文献Nishizawa，Yoko and Hirai，Atgushi，Jpn，J，Genet.(1987)62，389-395][
图1]。
分子生物学技术的应用是改变Rubisco光合作用效率的一个有效途径。通过重组DNA技术(特别是基因突变技术)可以系统地进行Rubisco结构与功能关系的研究，从而得到高效率Rubisco的基因。随着DNA合成技术的发展，合成基因由于其操作简便性而越来越显示出它在基因工程上的优势，这包括在合成基因中设置均匀分布的单一的限制性内切酶位点从而使基因突变变得容易，通过在合成基因的两端加上转录或翻译的控制元件，省去了从基因组中克隆和表达目标基因所遇到的改变原基因的麻烦;通过在合成基因中选择适合于给定宿主细胞高表达体系的密码子，使合成基因能高效地表达。[参见文献Ferretti，L.，Karnick，S.S.，Khorana，H.G.，Nassal，M.，and Oprian，D.D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83，599-603.]。
为此，本发明的目的是设计合成一个水稻Rubisco大亚基结构基因，能直接在大肠杆菌中高表达出与天然水稻Rubisco大亚基具有相同氨基酸顺序的多肽，并且在结构基因中设置多而且分布均匀的单一的限制性内切酶位点，以提供一个便于进行基因突变研究的基因工程体系。
本发明是一种能在大肠杆菌中高表达的水稻Rubisco大亚基的合成基因，是按大肠杆菌高表达体系的密码子分配系数，经计算机辅助设计和全合成的水稻Rubisco大亚基结构基因(简称RrbcL G)，能以高产率(180mg/L)表达出单一的RrbcL，经检查这个基因的产物具有与天然RrbcL相同的长度(从SDS-PAGE判断)和相同的免疫性(免疫印迹)，能与水稻Rubisco小亚基(RrbcS)进行装配，并且该基因便于对RrbcL通过突变进行系统的结构与功能研究。
1.基因的设计将477个残基的氨基酸顺序输入计算机后，运转有关程序，按大肠杆菌高表达基因简并密码子的相对使用数据[参见文献Sharp，P.M.，et al.，Nucl.Acids Res.(1986)14，5134.]、设计尽可能多的常用的单一的限制性内切酶位点和合成基因能在大肠杆菌中有效起始表达的要求设计了含1466b.p.的RrbcL结构基因(图1)，它含有编码基因1437b.p.，核糖体结合部位，双重终止密码子，以及两端的粘性末端EcoRI和BamHI。在这个合成基因中，除了两端的EcoRI和BamHI外，我们还设置了45个常用的单一的限制性内切酶位点，它们的分布情况见图2，而相应的RrbcL天然基因中只有12个这种位点。另外，对照RrbcL天然基因，在编码区有284个碱基不一样，这是为了改变266个氨基酸(占477残基的56%)的密码子，使RrbcL G适应于大肠杆菌高表达系统。显然，RrbcL G更能有效地在大肠杆菌中高表达并且更有利于进行基因的定位突变和盒式突变，以便系统地从事水稻Rubisco的结构和功能关系的研究。
2、基因的全合成本发明参照该领域新颖而又简单易行的方法[参见文献Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878;Rossi，J.J.et al.，J.Biol.Chem.，(1982)257，9226-9229]，加以改进并有所创新后完成了RrbcL G的合成。用DNA连接酶经单链法催化连接化学合成的寡核苷酸片段成为单链DNA(ssDNA)大片段，或用DNA聚合酶将3’端部分配对的两条寡核苷酸互补链复制成双链，然后用DNA重组技术将连接成的RrbcL G的单链或双链大片段克隆进一种质粒载体，并且在载体中装配成完整的RrbcL G，得到含此基因的克隆质粒并且转化一种大肠杆菌。
图3表示RrbcL G被划分为RL01、RL02、RL03三个大片段和它们由A、B、C、D……等等32个寡核苷酸片段组成。图4、图5、和图6分别说明RL01、RL02、RL03三大片段的合成路线。在每个片段经DNA顺序分析证明已正确获得后，将它们组装到载体pWR13中(图7)，得到含完整RrbcL G的克隆质粒pC1RrbcL(于1994年11月14日提交中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号CCTCC NOM94069)。
3、全合成RrbcL G的表达为了使全合成的RrbcL G能在大肠杆菌中高表达，本发明选择了由强启动子控制的表达载体质粒pPLc2833，并且在设计基因的DNA顺序时(见前)综合考虑了下述两点要求(1)，按大肠杆菌高表达基因简并密码子分配系数选择密码子，(2)，在基因的5’-端设置与表达质粒和基因本身相匹配的核糖体结合部位(SD顺序、ATG以及相关的核苷酸顺序)。
如图7所示，通过DNA重组将RrbcL G从pC1RrbcL中取出并插入表达载体pPLc2833得到表达质粒pE1RrbcL(于1994年11月14日提交中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号CCTCC NOM94070)，转化大肠杆菌C600(pcI857)。转化子经预培养并诱导表达后，表达产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明(图8)在与天然RrbcL G泳距相同的部位，出现一条随表达时间延长产物数量逐渐增加的蛋白质条带。
4、RrbcL G表达产物的纯化与鉴定RrbcL G表达产物在大肠杆菌中以不溶物形式(即所谓的包涵体)存在，经过实施例4的操作可得到纯度为95%以上的RrbcL纯品(图9)120mg/L。N-端氨基酸顺序分析表明，纯化产品的N-端顺序与天然RrbcL的相同;免疫印迹试验表明纯化产品与天然Rubisco抗体有特异反应。
5、RrbcL G表达产物纯化后与合成的RrbcS的装配大亚基只有与小亚基结合并装配成Rubisco整分子，才能表现出活性。本发明采用实施5的方法，将大小亚基一起以较稀的浓度溶于变性剂溶液中，然后逐步透析除去变性剂，离心澄清透析液并超滤浓缩，装配产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析及免疫印迹试验表明，在与天然水稻Rubisco相同位置处有一能与天然Rubisco抗体特异反应的条带。
6、RrbcL突变体结构基因的构建和表达为了利用RrbcL G进行RrbcL突变，原则上先找出要突变的氨基酸密码子(一个或几个)在图1中的部位，然后找到待突变氨基酸密码子附近的二端限制性内切酶，决定要置换的限制性内切酶片段，并合成含有新密码子的限制性内切酶片段后，用类似上述方法进行DNA重组构建突变体质粒，并进行突变体质粒的基因表达。
这里介绍RrbcL V377N突变体先在质粒pC1RrbcL上进行将第377位缬氨酸密码子GTT变换成天冬酰胺密码子AAC的限制性内切酶片段的置换，即用新合成的限制性内切酶片段，BsaHI-NgoMI，取代pC1RrbcL中原来的BsaHI-NgoMI片段的DNA重组，得到含突变体V377N结构基因的质粒pC1RrbcL-V377N，然后用实施例3相同的方法将突变体V377N结构基因从突变体质粒pC1RrbcL-V377N转入表达载体pPLc2833得到突变体表达质粒pE1RrbcL-V377N，并转化大肠杆菌C600(pcI857)后进行基因表达和表达产物的分离纯化、分析鉴定等等。用相似的步骤对RrbcL G进行基因突变可以构建许多突变体基因，然后基因表达可得到许多RrbcL的突变体，通过与小亚基的装配而获得Rubisco全酶。研究这些酶的结构与功能的关系，从中可发现一些性能优良的Rubisco衍生物或新品种。
下面所给出的定义是为了更清楚地说明它们在本发明中使用的含义。
基因是指在生物合成一个蛋白质所需的完整DNA部分，一个基因包括结构基因，结构基因上游的转录启动区，它启动和调节结构基因的表达，和3’端多聚腺苷酸顺序。
结构基因是基因的一个部分，包括编码蛋白质和多肽的部分，有时包括其中一部分插入的DNA片段。结构基因通常可以在细胞中发现或通常不在其被引入的细胞位置上，在后一种情况下，它被称之为异源基因。异源基因可以全部或部分地来自该领域已知的任何来源。结构基因在编码区或翻译区有一个或多个修饰，它们能影响表达产物的生物活性或化学结构、表达率或表达控制方式。这些修饰包括(但不局限于)突变、插入、缺失和一个或多个核苷酸的置换。
合成基因是指一个结构基因的DNA顺序中编码区的全部或大部分是化学合成的，如这里所列举的，寡核苷酸片段是采用该领域熟知的过程化学合成，经退火和酶催化连接而形成基因片段，然后用酶催化进一步装配这些基因片段成完整的基因。与这里所描述的合成基因的功能和结构相当的基因可采用该领域中所用的定位突变或其它有关的方法来制备。
简并密码子的使用是指一个特定的宿主细胞使用密码子编制一个给定的氨基酸时所表现的选择，在特定密码子的选择上有一定的优先。特定的密码子在基因中的使用频率是以基因中该密码子出现的次数被编码基因中相同的氨基酸的所有密码(即所有简并密码子)出现的次数除来测定的。与此相似，宿主细胞，如本发明所用的大肠杆菌，密码子使用的频率可以通过在宿主细胞中表达的大量基因中密码子使用的平均频率而计算。这种分析局限于宿主细胞高表达的基因时则较好。为直观起见，这种频率往往表示成简并密码子的相对使用，即以密码子的使用频率乘以该密码子相应氨基酸的简并密码子数。
当为提高宿主细胞中的表达而合成一个基因时，把该基因设计成其简并密码子的使用符合宿主细胞高表达基因的简并密码子的相对使用，这样可使所合成的基因在宿主细胞中获得高表达。本发明采用Sharp，P.M.等发表的大肠杆菌高表达基因的简并密码子相对使用数据[参见文献Sharp，P.M.，et al.，Nucl.Acids Res.(1986)14，5134.](表1)。
克隆是指一群细胞中的每一个都衍生自同一个祖先细胞。克隆最重要的用处是将DNA片段，包括整个基因或一部份，通过载体(质粒、噬菌体和柯斯质粒)在宿主细胞中扩增。本发明合成的RrbcL G按此领域的常规方法重组进质粒后转化大肠杆菌而得到扩增。
转化是指稳定地将携带功能基因的一个DNA片段引入一个以前不含有该基因的生物体内。上述RrbcL G通过重组进质粒后转化引入以前不含有该基因的大肠杆菌中。
基因表达是指结构基因转录和翻译(或转译)而产生所编码的蛋白质或多肽。本发明合成的RrbcL G在大肠杆菌中能产生与RrbcL天然基因在叶绿体中的产物相同的多肽，并且比天然基因在大肠杆菌中有更高的表达效率。
亚基装配是指亚基单位以一定的比例和特定的结合方式联合形成一完整的单位或构造。很多的酶都是由多个多肽亚基组成的，它们以特异的结合方式聚集生成有催化活力的一个整体。亚基的装配，在体内是由一种叫分子伴侣(Molecular Chaperone)的蛋白质来完成的，在体外则往往是通过变性～复性过程来进行的，必要时也需要有分子伴侣的帮助。本发明水稻Rubisco大亚基和小亚基的装配是在体外进行的。
本发明有下列优点1.不仅设计了RrbcL的编码基因的核苷酸顺序，而且也设计了与其5’端顺序和表达载体相匹配的核糖体结合位点SD顺序和起始密码子ATG及有关核苷酸顺序，这样可使本发明的RrbcL基因在合成后转入表达载体即可有效地进行表达。
2.按表达的宿主细胞高表达基因密码子使用体系设计相应的结构基因，从根本上克服了天然基因在密码子选择上的缺陷。我们在RrbcL基因的密码子选择上消除了原天然基因中42个在大肠杆菌高表达体系中分配频率极低的密码子[表1]，为在大肠杆菌中实现高表达奠定了基础。
3.在RrbcL G中，通过计算机辅助设计了尽可能多方便常用的限制性内切酶位点。不包括两端粘性末端，RrbcL G中设置了45个常用的单一的限制性内切酶位点，还有多个常用的在其中有二～三个位点限制性内切酶部位，这些位点在合成的基因片段中出现时也是单一的。这样，二个相邻位点之间平均间隔约为30b.p.，因此可以很方便地利用RrbcL G进行基因的定点突变或盒式突变研究。
4.本发明RrbcL G的合成步骤简单，采用了两种新颖实用的方法并进行了推广和改进。如RL02大片段的合成，将连接得到的DNA长单链复制成双链后再克隆入宿主细胞，避免了单链克隆未知的复杂性，保证了合成片段克隆的准确性。
5.通过将合成的RrbcL和RrbcS溶解于强变性剂溶液后，稀释到另一种较弱的变性剂溶液中，再逐步透析除去变性剂的方法，观察到Rubisco分子的形成。虽然装配效率很低，但这是高等植物Rubisco体外装配的首次获得，值得进一步的研究，为体外研究高等植物Rubisco的结构与功能的关系开辟道路。
以下的实施例可用作本发明的具体方案，它们不限制本发明的范围。
材料与方法除下述材料与方法之外的参见文献[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res，(1990)18，871-878.]。
Sep-pak C18反相柱来自Waters公司;
低熔点琼脂糖凝胶和考马斯亮兰R-250来自GIBCO BRL公司;
限制性内切酶，多核苷酸磷酸化激酶，T4 DNA连接酶来自New English Biolabs或Boehringer Mannheim公司;
DNA顺序分析所需的引物由本实验室合成纯化;ATP来自Amersham公司;
Sepharose CL 4B和质粒pUC18来自Pharmacia-LKB公司;
表达质粒pPLc2833和大肠杆菌C600(pcI857)系麻省理工学院Khorana教授赠送;
质粒pWR13和大肠杆菌JM83系中国科学院上海细胞生物学研究所郭礼和教授赠送;
十二烷基磺酸钠(SDS)来自Boehringer Mannheim公司;
硝化纤维素膜来自美国Micro Filtration System公司;
4-氯-萘酚来自Sigma公司;
天然Rubisco抗体由上海市免疫学研究所周光炎教授帮助制备;
其它化学试剂均为市售国内产品。
寡核苷酸片段间的连接按单链法[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]进行。
3’-端部分配对的两条寡核苷酸的互补链复制成双链按Rossi等[Rossi，J.J.et al.，J.Biol.Chem.，(1982)257，9226-9229]的方法加以改进后进行。等摩尔的3’-端部分配对的两条寡核苷酸片段在30℃配对半小时后，加入DNA聚合酶大片段在四种dNTP存在下，依次保温反应25℃，5min;37℃，45min;25℃，10min。反应完成后，用乙醇沉淀出双链DNA。
质粒的构建对需要进行重组的质粒先按选择的限制性内切酶进行双酶解，酶解物经低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，按常规方法制备线性质粒大片段，然后与合成的基因片段或从另一个质粒双酶解后分离的基因片段连接，连接产物按常规方法转化大肠杆菌并以特定的抗菌素筛选转化子。从pUC18或pWR13衍生的质粒转化大肠杆菌JM83用氨苄青霉素37℃培养;从pPLc2833衍生的质粒转化大肠杆菌C600(pcI857)用氨苄青霉素和卡那霉素30℃培养。从克隆出的菌落中挑选单菌落于LB培养液中按常规方法扩增和制备构建的质粒。[参见文献Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniats，T.，Molecular Cloninga laboratory manual(2nd ed)(1989)，Cold Sping Harbor Laboratory Press，New York，]质粒中的基因DNA顺序分析按文献[Chen，H.-B.，et al.，Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878.]的条件用pUC18或pWR13多接头区两端的通用引物或基因合成中用作配对的短寡核苷酸为引物。
基因表达这里介绍以pPLc2833为载体[参见文献Remaut，E.，Tsao，H.，and Fiers，W.，Gene(1983)22，103-113.]的基因表达。
过夜培养的含表达质粒的菌液，稀释后在30℃培养使A650nm升高到0.5-0.8转入41℃热诱导，直到A650nm不再增加为止，约诱导4小时。
表达产物的分离纯化上述表达后的菌体经高速冷冻离心收集，悬浮于Tris.HCl缓冲液中，超声破碎并分离收集包函体，后者经尿素、Triton、盐酸胍等试剂的洗涤和处理后，溶于含盐酸胍的缓冲液中，并且在盐酸胍和巯基乙醇的存在下经凝胶过滤进一步分离纯化，最后得到纯度为95%、对天然水稻Rubisco抗体有特异免疫反应的基因工程RrbcL。
表达产物与RrbcS的体外装配将RrbcL G表达产物与基因工程产品RrbcS [Chen，H.-B.and Wang，G.-A.，Curr.Plant Sci.Biotechnol.Agric.(1993)15(Biotechnology in Agriculture)，160-164]一起溶解于含盐酸胍的缓冲液中，再将此溶液稀释到含尿素的缓冲液中，然后依次对尿素浓度逐渐减少的缓冲液透析，最后离心除去沉淀并超滤浓缩。对浓缩液进行非变性电泳分析。
实施例1RrbcL G的设计(A)编码DNA顺序的设计在计算机VAX/11-780辅助下进行RrbcL G的设计，将已知的RrbcL氨基酸顺序输入计算机后，运转美国国家生物医学研究基金会(NBRF)赠送的软件PSQ和NAQ，检查由计算机逆翻译的由简并密码子组成的RNA顺序中可能出现的限制性内切酶的识别顺序，然后按照(1)、大肠杆菌高表达基因密码子使用频率(表1)，(2)、在选定的克隆质粒pWR13中均匀安置单一的限制性内切酶在RrbcL合成基因中，和(3)、合成基因片段分段和消除自身配对等三项要求人工选定每个氨基酸的密码子而确定RrbcL编码基因的DNA顺序如图1中-25-1441的核苷酸排列次序。
(B)部分表达调控顺序的设计如前述。我们采用质粒pPLC2833作为RrbcL合成基因的表达载体。为了使这个载体能实际运作，必须在启动子与合成基因的5’端之间加上一个翻译的启动软件，即核糖体结合部位，它包括SD顺序和起始密码子ATG及有关核苷酸顺序。考虑到基因表达时转录出来的mRNA的5’端的200个核苷酸会形成二级结构，以及SD顺序在这个初生态mRNA5’端二级结构中的状况对表达的起始和产率会有很大影响[参见文献Chen，H.-B.et al.，(1995)待发表]。这样在计算机的辅助下，通过选择5’-端密码子的第三码和SD顺序和起始码ATG之间的核苷酸顺序，以使SD顺序和ATG处于mRNA二级结构的环区，从而得到了图1所示的顺序。
最后，在这个设计的基因顺序的3’-端加上二个终止密码子TAA和TAG以及两端为分子克隆所需要的EcoRI和BamHI限制性内切酶识别顺序的粘性末端，得到图1所示长度为1466b.p.的DNA顺序。
实施例2RrbcL G的全合成(A)寡聚脱氧核苷酸的制备RrbcL G被划分为如图3所示的RL01、RL02和RL03三个大片段。RL01(476b.p.)进一步划分为A、B、C、D、E、F和G七个正股寡核苷酸片段，二个末端负股片段A’b和fG’，以及中间四个短的连接用的桥式负股寡核苷酸bc、cd、de和ef。RL02(496b.p.)被划分为H、I、J、K、L和M六个正股寡核苷酸片段，二个末端负股短片段hh和mm，以及五个桥式负股寡核苷酸片段hi、ij、jk、kl、和lm。RL03(490b.p.)的片段划分与上面不一样，它被划分为正负股三组共计六个片段，即N(+)和O(-)、P(+)和Q(-)以及R(+)和S(-)。
总计32个寡核苷酸片段在DNA合成仪(ABI 381A型)上用固相亚磷酰胺三酯法合成。每个片段被单独合成后，经浓氨水55℃处理8小时，使之从固相上脱落并切除保护基团，粗产品浓缩后溶于水，用尿素变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离，含纯产物的凝胶带经碳酸氢三乙胺(1mol/l)浸出，用Sep-pek C18反相柱按Lo等人的方法[参见文献Lo，K-M.，Jones，S.S.，Hackett，N.R. & Khorana，H.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)81，2285-2289]脱盐得到纯的寡核苷酸片段。
纯的寡核苷酸用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常规方法进行5’-磷酸化。
(B)寡核苷酸间的连接合成基因大片段a.RL01的合成如图4所示，十三个片段分三组进行配对，即A、B、C、A’b和bc，D、E和de，F、G和fG’，然后合并，加入片段cd和ef，30℃保温五分钟后冷却到0℃，加入T4 DNA连接酶，在16℃反应16小时。反应产物经低熔点琼脂糖凝胶分离制备后，与已被EcoRI和ApaI双消化了的线性质粒载体pUC1802＊相连，直接转化大肠杆菌JM83。对转化子扩增后提取质粒进行酶解分析，并且对初步肯定含有RL01片段的质粒作DNA顺序分析，用原有的寡核苷酸片段对克隆片段中的减基缺失进行修复，最后再经DNA顺序分析检查，得到含RL01基因片段的质粒pRL01。
b.RL02的合成如图5所示，用类似制备RL01的方法，分三组配对一次连接(由于片段较长，连接温度宜在30℃进行)，制备出基因单链。单链基因片段与hh配对后与被ApaI和SalI消化过的pUC1802线性质粒相连。连接产物被酒精沉出后，与mm片段配对，在DNA聚合酶大片段＊ 此质粒系发明人实验室从质粒pUC18衍生而来，用DNA重组技术将后者的多接头区改为EcoRI-XhoI-ApaI-BamHI-XbaI-SalI-PstI-HindIII。存在及其相应的条件下反应一小时，然后加入T4 DNA连接酶和ATP，在16℃继续反应六小时，转化大肠杆菌JM83。对转化子扩增提取质粒进行酶解鉴定和DNA顺序分析，得到含RL02基因片段的质粒pRL02。
c.RL03的合成采用了完全不同于RL01和RL02的方法。如图6所示，RL03大片段分成三组来完成N(+)和O(-)，P(+)和Q(-)，R(+)和S(-)。以N(+)+O(-)为例，N(+)和O(-)在50℃到25℃冷却过程中配对，加入DNA聚合酶大片段在30℃反应一小时，沉淀出产物后，对其进行HindIII和SalI的双消化，产物乙醇沉淀出后与HindIII和SalI双消化的线性质粒pWR13相连，转化大肠杆菌JM83，得到质粒pRL0301。类似地从另外四片段可分别得到pRL0302和pRL0303。但是，由于这四个片段较长(最长可达124核苷酸单位)，聚合反应的温度必须在37℃，必要时[如R(+)+S(-)]还要加短片段(rr)以消除单链的二级结构。
对得到的三个质粒分别进行DNA顺序分析，然后如图6所示将酶解释放出的三个片段一起重组进pWR13，得到pRL03，并作全顺序分析。
d.如图7所示，对pRL01、pRL02和pRL03分别作相应的酶解，放出的三个片段经常规方法纯化后一起克隆入pWR13，转化大肠杆菌JM83，最终获得含整个基因的质粒pC1RrbcL。
实施例3合成的RrbcL G在大肠杆菌中的表达如图7所示，质粒pC1RrbcL与pPLc2833分别经EcoRI/BamHI双酶解，前者取较小的结构基因片段，后者取线性质粒较大片段，连接重组成表达质粒pE1RrbcL，并转化大肠杆菌C600(pcI857)。取克隆的单菌落于20ml LB培养液中30℃摇荡过夜，然后此培养液稀释50倍至A650nm＝0.05-0.06，30℃培养约两小时至A650nm＝0.5-0.8时，转入41℃热诱导表达，分别于15’、30’、60’、120’和240’各取样1ml，离心后沉淀部分加入100ul菌体裂解液，悬浮并100℃煮三分钟，离心后取等光密度的样品量上样，经15%十二烷基磺酸钠变性的PAGE分离，然后用考马斯兰显色。结果显示在电泳迁移速度与天然RrbcL泳速相同的部位出现一条随表达时间延长而蛋白量不断增加的色带(图8)。
实施例4RrbcL G表达产物的纯化及其免疫鉴定离心收集(7，000xg，15min，4℃)诱导表达且在41℃培养四个小时的500ml大肠杆菌(含pE1RrbcL和pcI857)菌体(约1.4g)，用TE缓冲液(pH 8.0)洗一遍后，悬浮于20毫升Tris.HCl缓冲液(pH 8.0，0.1mol/l)中，冰水浴中超声破碎细胞5分钟(超声30秒，间隙30秒)，高速冷冻离心收集包涵体(10，000xg，10min，4℃)，4毫升含尿素(2mol/l)和2‰Triton的水溶液重新悬浮并放置半小时后，以同上一步的速度收集不溶物，再用上述相同的Tris.HCl缓冲液洗去尿素、Triton以及少量的杂蛋白。这样得到的包涵体用10毫升含盐酸胍(8mol/l)的缓冲液[Tris.HCl(pH7.8，100mmol/l)，NaCl(50mmol/l)，DTT(100mmol/l)]溶解(100℃3分钟)，离心除去不溶物(26，000xg，15min，10℃)。
上述澄清液(5ml)加样至-Sepharose CL 4B层析柱(2.2x50cm)中，此柱预先以洗脱液[Tris.HCl(pH7.8，100mmol/l)，NaCl(40mmol/l)，BME(1‰)，NaN3(0.2‰)，盐酸胍(6mol/l)]平衡，以3cm/hr的速度淋洗产物，整个洗脱过程只出现一蛋白质峰，Kav＝0.55。合并，以Bradford法定蛋白量，得到约30mg的大亚基。产品经15%SDS-PAGE分离并电转移至一硝化纤维素膜上，膜再被3%的牛血清蛋白饱和后，依次以抗水稻Rubisco的兔抗体和辣根过氧化酶(HRP)偶联的羊抗兔抗体洗，最后用二氨基联苯(DAB)显色(图9)，结果表明合成的RrbcL G的表达产物与水稻Rubisco抗体有特异反应。
实施例5RrbcL G表达产物与基因工程产品RrbcS的装配下述实验除注明外，都在室温进行。取实施例4的柱层析溶液二毫升(1.5mg/ml)和一毫克基因工程产品RrbcS(0.5ml)，将它们稀释到200毫升缓冲液[尿素(4mol/l)，Tris.HCl(pH7.8，40mmol/l)，MgCl2(10mmol/l)，BME(1‰)，EDTA(1mmol/l)，甘油(10%v/v)]中，依次对含不同浓度尿素的相同缓冲液分别透析24小时，尿素浓度依次为2.5mol/l、2.0mol/l、1.0mol/l、0.1mol/l。对含5%甘油的双蒸水透析一次，最后对缓冲液[Tris.HCl(pH7.8，10mmol/l)，MgCl2(1mmol/l)，BME(5mmol/l)，EDTA(0.1mmol/l)]在10℃透析两次。用100KD膜将透析液超滤浓缩到一毫升(10℃)，再真空浓缩到0.1毫升(0℃)。取样分别用变性和非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移到硝化纤维素膜上，进行免疫印迹试验(同上一实施例)。结果表明，得到了与天然Rubisco相比，具有相同的电泳性能和免疫性能的装配分子(图10)。
实施例6RrbcL V377N突变体结构基因的构建与表达(A)RrbcL V377N基因突变体限制性片段选择和设计首先，我们从RrbcL G结构图(图1)中找到编码第377位氨基酸(即缬氨酸，V377)的密码子GTT，然后在其两端选择两个合适的限制性位点，BsaHI和NgoMI。将密码子GTT改成天冬酰胺的密码子AAC，同时也将第384位缬氨酸密码子GTA改为GTT，此处核苷酸顺序的改变导致原有的BsaAI限制性位点的消失，这就方便了突变体基因与原基因的比较鉴定。这样我们合成了下述双链限制性内切酶片段BsaHINgoMICGTCATTCCGAACGCATCTGGTGGCATCCACGTTTGGCATATGAGTAAGGCTTGCGTAGACCACCGTAGGTGCAAACCGTATACGGCC黑体表示改变了的碱基，划线部分说明BsaAI位点的消失。
(B)含V377N突变体基因克隆质粒的构建首先将质粒pC1RrbcL进行BsaHI的部分酶解，再用NgcMI对制备出的BsaHI单消化质粒彻底消化，分离制备最长的线性质粒大片段，然后以120的比例与上述新合成的BsaHI/NgoMI限制性DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM83，转化子经长度及BsaAI酶解情况与原质粒的比较，证实已得到含RrbcL V377N突变体基因的质粒pC1RrbcL-V377N。
(C)含RrbcL V377N突变体基因的表达和产物鉴定按实施例3相同的方法将质粒pC1RrbcL-V377N与pPLc2833重组得到表达质粒pE1RrbcL-V377N，转化大肠杆菌C600(pcI857)并进行基因表达，然后按实施例4和例5相同的方法纯化表达产物、进行产物鉴定和与小亚基的装配试验。结果类似，不再附图。
此外，类似于实施例5，可以逐步突变本发明的合成基因，直到其中238个密码子被改变，即使这样得到的突变体基因，其密码子与本发明的水稻Rubisco大亚基合成基因相对应的密码子仍有50%以上相同。
权利要求
1.一种在大肠杆菌中高表达的水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(缩写Rubisco，EC4，1，1，39)大亚基合成基因，其特征在于该基因的DNA核苷酸顺序是如下所显示的-25～1441的核苷酸。-2.5AATTCCTCTAAGGAGGTAAGAACAAA -1ATGTCCCCACAGACTGAAACTAAAGCTAGCGTTGGTTTTAAAGCAGGCGTTAAGGACTH S P Q T K T K A S V O F K A G V K DACAAGTTGACCTACTACACCCCGGAATATGAA 90Y K L T Y Y T P E Y EACTAAAGACACTGATATCCTGGCGGCTTTCCGTGTAACCCCGCAGCCGGGTGTTCCGCT K D T D I L A A F R V T F Q F G V FCTGAGGAAGCTGGCGCAGCTGTAGCGGCTGAA 180F E E A G A A V A A ETCTTCCACTGGTACCTGGACCACCGTATGGACTGACGGTCTGACGAGCCTGGATCGTTS S T G T W T T V W T D G L T S L D RACAAAGGCCGCTGCTACCACATCGAGCCCGTT 270Y K G R C Y H I K P VGTTGGTGAAGACAACCAGTACATCGCTTACGTTGCATATCCGCTGGACCTGTTCGAGGV G E D N Q Y I A Y V A Y P L D L R EAAGGTTCGGTAACCAATATGTTCACTTCTATC 360E G S V T N M F T S IGTTGGTAACGTGTTTGGCTTCAAAGCCCTGCGTGCACTGCGTCTGGAGGATCTGCGCAV G N V F G F K A L R A L R L K D L RTCCCGCCAACTTACTCTAAAACTTTCCAGGGC 450I P P T Y S K T F Q GCCGCCACACGGTATCCAGGTTGAACQTQACAAACTGAACAAATACGGCCGCCCGCTGCP P H G I Q V K R D K L N K Y G R P LTGGGTTGTACCATCAAACCGAAACTGGGCTTA 540L G C T I K P K L G LAGCGCTAAAAACTACGGTCGCGCGTGCTACGAATGTCTACGCGGTGGCCTGGACTTCAB A K N Y G R A C Y E C L R G G L D FCCAAGGATGACGAAAACGTTAACTCTCAGCCA 630T K D D E N V N S Q PTTCATGCGTTGGCGTGATCGATTTGTATTCTGCGCTGAAGCTATCTACAAGTCTCAAGF H R W R D R W V F C A B A I Y R S QCAGAGACTGGCGAAATCAAGGGCCATTATCTG 720A E T G E I K G E Y LAATGCTACTGCAGGTACTTGCGAAGAAATGATCAAACGTGCTORATTCGCGCGTGAGCH A T A G T C E E M I Q R A V W A R ETCGGTGTTCCGATTGTTATGCTCGACTACCTG 810L G V P I V H E D Y LACAGGCGGTTTCACCGCTAACACTAGTCTGGCACACTACTGCCGTGACAACGGCCTGCT G G W T A N T S L A E Y C R D N G LTTCTGCACATCCACCGTGCTATGCATGCTGTA 900L L H X H R A M H A VATCGACCGCCAGAAAAACCACGGTATGCACTTCCGTGTACTGGCAAAAGCTTTGCGTAI D R Q K N H G M H F R V L A K A L RTGTCTGGTGGCGATCACATCCACGCGGGCACC 990M S G G D H I H A G TGTGGTTGGTAAACTCGAGGGTGAACGCGAAATGACTCTGGGTTTTGTCGACCTGCTGCV V G K L E G E R K M T L G F V D L LGTGATGACTTCATCGAAAAGGACCGTGCGCGC 1080R D D F I K K D R A RGGTATCTTCTTTACCCAGGACTGGGTTTCCATGCCGGGCGTCATTCCGGTTGCATCTGG I F F T Q D W V S H P G V I P V A SGTGGCATCCACGTATGGCACATGCCGGCGCTG 1170G G I H V M H M P A LACTGAGATCTTCGGTGACGACTCTGTTCTCCAATTCGGTGGCGGCACCCTGGGCCATCT E I F G D D E V L Q F G G G T L G HCTTGGGGCAACGCACCTGGTGCTGCGGCAAAC 1260P W G N A P G A A A NCGTGTGGCCCTGGAGGCCTGCGTTCAGGCTCGTAACGAAGGTCGCGATCTGGCTCGTGR V A L K A C V Q A R N E G R D L A RAAGGCAACGAAATCATTCGTTCCGCTTGCAAA 1350E G N E I I R S A C KTGGTCTCCGGAACTGGCCGCGGCTTGCGAAATCTGGAAAGCGATCAAGTTCGAATTTGW E P E L A A A C H I W K A I K F E FAGCCGGTTGATAAACTGGACAGCTAATAG 1441E P V D K L D So(CCTAG)
2.如权利要求1所述的合成基因，其特征在于由这个合成基因衍生的突变体基因，与权利要求1所述的合成基因相对应的密码子有50%以上相同。
3.如权利要求1和2所述的合成基因，其特征在于可应用于产生水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基及其突变体，包括将合成基因插入大肠杆菌质粒载体组成克隆质粒pClRrbcL和表达质粒pElRrbcL，然后转化大肠杆菌宿主细胞，以及在大肠杆菌中的基因表达和表达产物的纯化，并将其与水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基进行装配，形成Rubisco整分子。
4.如权利要求3所述的合成基因，其特征在于所述大肠杆菌质粒载体是pWR13或pPLc2833。
5.如权利要求3所述的合成基因，其特征在于所述的大肠杆菌宿主细胞是JM83、C600或C600(pcI857)。
全文摘要
水稻核酮糖1，5-二磷酸羧化酰/加氧酶(缩写Rubisco)大亚基的结构基因(1466 b，p，)已按大肠杆菌高表达密码子分配系数重新设计和被全合成。这个含有45个单一的限制性核酸内切酶部位的合成基因已在大肠杆菌中高表达(180mg/l)，纯化后的表达产物与基因工程产生的水稻Rubisco小亚基重组经免疫印迹法分析鉴定生成了分子量和免疫性与天然水稻Rubisco相同的产物。
文档编号C12N15/70GK1106862SQ94114008
公开日1995年8月16日 申请日期1994年11月30日 优先权日1994年11月30日
发明者陈海宝, 王国安 申请人:中国科学院上海有机化学研究所