含有突变的lpdA基因的大肠杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的lpdA基因的大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇和丁二酸等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的lpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。
【专利说明】含有突变的IpdA基因的大肠杆菌及其应用发明领域
[0001]本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含有突变的IpdA基因的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌用于生产如乙醇、丁二酸、丁醇和1，3-丙二醇等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等化工原料的方法，以及通过引入突变的IpdA基因而提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶活性的方法。
[0002]发明背景
[0003]微生物发酵法生产化工原料(如乙醇、丁二酸等)近来取得了很大的进展。与传统的化学方法相比，微生物发酵法具有很多优势，例如高生产率、低成本、以及利用可再生的原料而非石油化工产品等。
[0004]在微生物发酵生产中，大肠杆菌(E.coli)由于其遗传背景清楚、易操作、易调控、易培养、生长迅速等优点，被广泛用于研究以获得高产菌株。大肠杆菌在缺氧条件下，通常消耗糖或其衍生物，并发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇等产物。野生型大肠杆菌生产乙醇和丁二酸等的产率通常较低。近年来的研究表明，对大肠杆菌的代谢途径中所涉及的酶进行遗传改造，可以获得相应的高产菌株。
[0005]丙酮酸脱氢酶复合物(TOH)在大肠杆菌代谢途径中发挥重要的作用。丙酮酸脱氢酶是三个酶的复合物，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧转化成乙酰辅酶A(acetyl-C0A)，同时将NAD+还原为NADH。乙酰辅酶A可继而被用于柠檬酸循环以进行细胞呼吸作用(cellular respirat1n)。 丙酮酸脱氢酶复合物将糖酵解代谢途径与柠檬酸循环联系起来。丙酮酸脱羧也称作“丙酮酸脱氢反应”，因为其中也涉及了丙酮酸的氧化(Hansen etal.，1996B1chim B1phys Actal22:355 - 358;Bisswanger1981J B1l Chem256:815 -822;Quail et al.，1994J Mol Microb1ll2:95_104)。
[0006]在微生物厌氧发酵过程中，NAD和NADH是维持氧化还原反应的重要辅因子，其中NAD是重要的电子受体，而NADH则是电子传递过程中重要的辅因子，它决定着反应过程中还原力的供给(Garrigues et al., 1997J Bacter1l 179:5282 - 5287;Cassey etal., 1998FEMS Microb1l Lettl59:325-329)。在糖酵解过程中一分子葡萄糖产生两分子的NADH，而丙酮酸脱羧过程中，一分子葡萄糖可以产生两分子的乙酰辅酶A，并且伴随四分子的NADH产生(glucose — 2acety1-CoA — 4NADH),这相对于丙酮酸转化为甲酸的过程多产生了两分子的NADH，增加了还原力的供给，所以提高丙酮酸脱羧反应中丙酮酸脱氢酶(PDH)的活力，对提高代谢过程中的还原力供给有很重要的意义。
[0007]PDH作为连接糖酵解和三羧酸循环(TCA)的重要酶，其在好氧条件下酶活较高，但在厌氧条件下酶活很低。PDH复合物所催化生成的产物乙酰辅酶A与NADH，能够抑制丙酮酸脱氢酶复合物的作用能力。NADH是用于微生物生物合成的重要的还原力来源，但是高浓度的NADH却会抑制丙酮酸脱氢酶复合物的活性，成为代谢路径中关键的限速酶。Kim(Kimet al., 2008J Bacter1ll90:3851 - 3858)筛选得到了 I3DH复合体中的二氢硫辛酰胺脱氢酶(LPD)突变株E354K (IpdlOl)使PDH在无氧条件下对NADH抑制的敏感性显著下降，提高了利用该途径生产乙醇的能力。Zhou (Zhou et al., 2008B1technol Lett30:335-342)等的研究也表明，Ipd突变的引入和对aceEF基因调控提高了丙酮酸脱氢酶(TOH)的活性，提高发酵过程中菌株的生长及产量。
[0008]为了提高大肠杆菌生产化工原料的产量和/或转化率，需要进一步对大肠杆菌的代谢途径进行改造。
[0009]发明概述
[0010]一方面，本发明提供了一种经工程化的重组大肠杆菌。
[0011]在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、P275和A358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0012]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的，并且其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0013]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰，并且在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。
[0014]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C。
[0015]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰，其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。
[0016]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变，并且其中所述突变均是用T置换C。
[0017]在优选的实施方案中，本发明的大肠杆菌中所含有的突变的IpdA基因的活性增强。
[0018]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中或者整合至染色体中。
[0019]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或Pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0020]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因err和编码PTS系统酶IICBae的基因ptsG。
[0021]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:pflB基因表达的抑制、和/或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0022]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
[0023]在第二方面，本发明提供了一种生产化工原料的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
[0024]在一个实施方案中，本发明提供了用于生产乙醇、丁二酸、丁醇和/或1，3-丙二醇的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
[0025]在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产化工原料中的用途。
[0026]在一个实施方案中，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产乙醇、丁二酸、丁醇和/或1,3-丙二醇中的用途。
[0027]附图简述
[0028]图1:㈧IpdA基因及IpdA突变基因的PDH酶活性分析；(B) IpdA基因及IpdA突变基因受NADH/NAD抑制的分析。
[0029]图2:使用RBS文库调控JC-007的IpdA*基因获得的突变库中随机挑选的10个克隆厌氧发酵。(A)乙醇的产量和转化率；(B)丙酮酸脱氢酶活性。
[0030]图3:使用RBS文库调控JC-015的aceEF基因获得的突变库中随机挑选的10个克隆厌氧发酵。(A)乙醇的产量和转化率；(B)丙酮酸脱氢酶活性。
[0031]图4: (A)野生型IpdA基因以及突变的IpdA基因(IpdA*)的核苷酸序列比对；(B)野生型以及突变的IpdA基因(IpdA*)所编码的多肽的氨基酸序列比对
[0032]发明详述
[0033]除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
[0034]一方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因
[0035]如本文所用，术语“经工程化的重组大肠杆菌”、“工程化的大肠杆菌”和“重组大肠杆菌”可互换使用，均是指经过遗传改造的大肠杆菌，其中所述的遗传改造可以是，例如，基因表达的增强、基因表达的抑制、引入新的基因、引入突变的基因或者对基因进行突变等，其中可以通过本领域常规的技术手段实现基因表达的增强或基因表达的抑制，例如基因的敲除、改变基因的拷贝数、引入质粒、改变基因的启动子(例如使用强启动子或弱启动子)
坐寸O
[0036]在一个实施方案中，本发明提供了一种重组的大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰:T81、P275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0037]在一个实施方案中，本发明提供了一种重组的大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰:Τ81、Ρ275和Α358，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的，并且其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0038]术语“突变”具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者取代一或多个氨基酸。
[0039]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.: 2进行序列比对而确定的。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0040]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073，对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的，并且其中所述突变均是用T置换C。在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0041]IpdA 基因(Genbank ACA79157.1)是编码硫辛酰胺脱氢酶(EC No: 1.8.1.4)的基因。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型IpdA基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1所示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变的IpdA基因含有对应于如下突变的一或多种突变:C242T、C823T、和C1073T(参见图4A);而所述突变的IpdA基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一或多种氨基酸置换:T811、P275S、和A358V(参见图4B)。
[0042]本领域技术人员会意识到不同大肠杆菌菌株的IpdA基因序列可能与SEQ IDN0.:2所示IpdA基因序列不完全等同，以及不同大肠杆菌菌株的IpdA基因所编码的多肽序列可能与SEQ ID N0.:1所示的多肽序列不完全等同。在本发明的某些实施方案中，所述突变的IpdA基因中的突变位于对应于SEQ ID N0.:2的第C242位、第823位、和/或第1073位的位置上。在本发明的某些实施方案中，所述突变的IpdA基因所编码的多肽中的置换位于对应于SEQ ID N0.:1的第81位、第275位、和/或第358位的位置上。
[0043]在本发明中，“对应于” SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.:2中某一特定位置的位置可以通过序列比对而确定，包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽或核苷酸序列，本领域技术人员可以在适当的位置引入相应的突变，从而实现本发明的技术效果。另外，本领域技术人员也可以使用保守和类似的氨基酸残基来置换相应位置上的氨基酸残基，或者在IpdA基因序列中引入同义突变，而实现本发明的技术效果。
[0044]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰，并且在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。
[0045]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变，并且其中所述突变是用T置换C。
[0046]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQID N0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰，并且其中在对应于T81的位置上的修饰是用I置换T，在对应于P275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于A358的位置上的修饰是用V置换A。
[0047]在一个实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.: 2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变。在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种大肠杆菌，其中含有突变的IpdA基因，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQ ID N0.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变，并且其中所述突变均是用T置换C。
[0048]在一个优选的实施方案中，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
[0049]如本文所用，术语“基因表达增强”，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式实现，例如但不限于:在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白活性增强”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因的表达增强”以及“基因所编码的蛋白质的活性增强”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0050]在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一些实施方案中，使用的强启动子例如是:Ppck*(SEQ ID N0.:5) (Zhang et al., 2009b, ApplEnviron Microb1l75:7807-7813)或 M1_93(SEQ ID N0.:6) (Lu et al.，2012，ApplMicrob1l B1technol93:2455-2426)。
[0051]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中或者染色体中。
[0052]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于染色体中。
[0053]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中含有突变的IpdA基因，并且所述突变的IpdA基因位于质粒中。
[0054]如本文所用，术语“质粒”具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有:pEASY-Blunt、pACYC184、pTrc99A、pTrc99A_M、pTrc99A-M_Kan、pKD4 和 pKD46 等。
[0055]如本文所用，术语“染色体”具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术人员熟知的，例如可以参见 Michael R.Green 和 Joseph Sambrook 的〃Molecular Cloning:ALaboratory Manual〃(Fourth Edit1n)。
[0056]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或 PflB或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或Pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0057]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因err和编码PTS系统酶IICBae的基因ptsG。
[0058]在本发明中，ptsl基因(GenBank No:ACA76928.1、NC_010468.1)编码一种磷酸转移酶，其被称为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I (EC No:2.7.3.9)0 ptsH基因(GenBank No:ACA76929.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr (EC No:2.7.1.69)。err基因(GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGlc (ECNo:2.7.1.69)。ptsG基因(GenBank No:ACA78131.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶 IICBGlc (EC No: 2.7.1.69)。
[0059]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:ptsl基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pf IB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源glf基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源glf基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0060]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:ptsl基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或PflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强jPpck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0061]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰:ptsl基因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或PflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0062]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰:ptsl基因表达的抑制、和/或ptsl基因所编码的蛋白质的活性抑制；pflB基因表达的抑制、和/或pflB所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达的增强、和/或Pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0063]在本发明中，pflB基因(GenBank No: ACA78322.1)编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formate lyase)(EC No:2.3.1.54)。adhE 基因(Genbank No:ACA78022.1)编码乙醇 / 乙醒脱氢酶(Alcohol/acetaldehyde dehydrogenase) (EC No: 1.1.1.1, ECNo: 1.2.1.10)。IdhA 基因(GenBank No:ACA77176.1)编码乳酸脱氢酶 A(lactatedehydrogenase A) (EC No: 1.1.1.28)。galP 基因(GenBank No:ACA76443.1)编码半乳糖MFS转运蛋白。glf基因(GenBa nk No:AAA27691.1)编码葡萄糖转运蛋白Glf (glucosefacilitator protein)。pck 基因(GenBank No:ACA75988.1)编码憐酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，又称作 PCK 酶(EC No:4.1.1.49)。
[0064]如本文所用，术语“基因表达的抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方式实现，例如但不限于:基因的敲除、减少基因的拷贝数、改变基因的启动子(例如使用弱启动子)等。如本文所用，术语“基因所编码的蛋白质的活性抑制”具有本领域内熟知的含义，是指基因转录翻译后产生的蛋白活性的降低。其可以例如通过基因表达强度的降低、基因中核苷酸的插入或缺失、氨基酸位点的突变来实现。实现“基因表达的抑制”以及“基因所编码的蛋白质的活性抑制”的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0065]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0066]frdABCD基因簇编码富马酸还原酶(EC No: 1.3.5.4),包括frdA基因(GenBankNo:ACA79460.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdB基因(GenBank No:ACA79461.1)编码富马酸还原酶黄素蛋白亚基、frdC基因(GenBank No:ACA79462.1)编码富马酸还原酶C亚基、和frdD基因(GenBank No:ACA79463.1)编码富马酸还原酶D亚基。
[0067]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的一或多种修饰:pflB基因表达的抑制、和/或Pf IB基因所编码的蛋白质活性的抑制；IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0068]在另一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下修饰:pflB基因表达的抑制、和/或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；ldhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
[0069]在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有如下的修饰:aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
[0070]aceEF基因簇编码丙酮酸复合体E1/E2，包括aceE基因(GenBank No:ACA79159.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体El (EC No: 1.2.4.1)和aceF基因(GenBank No:ACA79158.1)编码丙酮酸脱氢酶复合体E2。
[0071]本发明中，增强的方法包括RBS文库调控:用核糖体结合位点(RBS，ribosomebinding site)文库序列(核昔酸由随机喊基组成)提闻基因的表达水平的策略。
[0072]在第二方面，本发明提供了一种生产化工原料的方法，其中包括培养本发明的大肠杆菌的步骤。
[0073]在一个实施方案中，本发明的方法包括培养本发明的大肠杆菌的，以及任选的分离或纯化所得的化工原料。
[0074]本发明的方法可以用于生产各种可通过微生物发酵产生的化工原料，包括但不限于:丁二酸、乙醇、丁醇和1，3-丙二醇等。
[0075]在一个实施方案中,本发明所述的“培养”包括种子培养和发酵培养。
[0076]如本文所用，术语“种子培养”是指将用于发酵的菌种在固体培养基上活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。
[0077]如本文所用，术语“发酵培养”是指利用微生物菌种，在适宜的条件下，将培养基组分经过特定的代谢途径转化为某些特定产物的过程。
[0078]在一个实施方案中，本发明的方法中包括将本发明的大肠杆菌厌氧发酵。
[0079]如本文所用，术语“厌氧发酵”是指利用厌氧发酵菌株，在隔绝空气的条件下，经特定代谢途径将培养基组分转化为某些特定产物的过程。
[0080]在一个实施方案中，本发明的方法中的培养过程不进行任何通气步骤。
[0081]在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的方法包括以下步骤:
[0082](I)将本发明的重组大肠杆菌接种于种子培养基，在适宜大肠杆菌生长的条件下培养一段时间得到种子液；
[0083](2)将种子液接种于发酵培养基，在厌氧条件下培养。
[0084]本发明的方法中可以使用本领域中常规用于培养大肠杆菌的各种培养条件，例如培养基、培养温度、培养时间和是否摇动以及摇动速度等。本领域技术人员根据需要可以选择适当的培养条件。本发明的方法中所使用的培养条件以及发酵条件是本领域技术人员熟知的(诸葛健等，1994，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社)。
[0085]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:温度为30_45°C，例如30-31 0C >31-32 °C >32-33 °C >33-34 °C >34-35 °C >35-36 °C >36-37 °C >37-38 °C >38-39 °C、39-40 O、40-410、41-42 O、42-43 O、43-44 O、或 44-45 V。
[0086]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:种子培养的时间为6-16小时,例如6-7小时、7-8小时、8-9小时、9-10小时、10-11小时、11-12小时、12-13小时、13-14小时、14-15小时、或15-16小时。
[0087]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:发酵培养的时间为2-5天，例如2天、3天、4天、或5天。
[0088]在一个实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10% (V/V)的接种量接种于种子培养基，例如0.1%、0.5%、1%、2.5%、5%、或10%。。
[0089]在一实施方案中，本发明的培养条件包括但不限于:将种子液按照终浓度OD550=0.05-0.5 的接种量接种于发酵培养基，例如 OD55tl 为 0.05-0.1,0.1-0.2,0.2-0.3、0.3-0.4 或 0.4-0.5。
[0090]在一实施方案中，可以使用常用于大肠杆菌的培养基。用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的氮源，例如有机含氮化合物或无机含氮化合物或其混合物。在一实施方案中，所述有机含氮化合物例如选自豆饼粉、花生饼粉、牛肉膏、鱼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆中的一种或任意几种的混合物，所述无机含氮化合物选自硝酸盐(如硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙)，铵盐(如磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵)中的一种或任意几种的混合物。在一实施方案中，用于本发明的大肠杆菌的培养基可以包括合适的碳源，例如选自葡萄糖、淀粉、淀粉水解糖、果糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、脂肪酸、乙酸、丙酮酸、和富马酸中的一种或任意几种的混合物。
[0091]在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的种子培养基和发酵培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0092]大量元素:葡萄糖、KH2PO4,K2HPO4, (NH4) 2HP04、MgSO4.7H20、和甜菜碱-KCl ；
[0093]微量元素:FeCl3.6H20、CoCl2.6H20、CuCl2.2H20、ZnCl2、Na2MoO4.2H20、MnCl2.4H202、和 H3BO3。
[0094]在一个实施方案中，本发明的培养基由以下成分组成(溶剂为水):
[0095]大量元素:葡萄糖20-l20g/L，KH2P042-5g/L, K2HP044-8g/L, (NH4) 2HP043-5g/L,MgSO4.7H200.1-0.3g/L、以及甜菜碱-KC10.1-lg/L ；
[0096]微量元素=FeCl3.6H201_5 μ g/L、CoCl2.6H200.05-1 μ g/L、CuCl2.2H200.05-1 μ g/L、ZnCl20.05-1 μ g/L、Na2MoO4.2H200.05-1 μ g/L、MnCl2.4H2020.1 - 1 μ g/L, H3BO30.01-0.5 μ g/L。
[0097]在一个实施方案中，本发明中对大肠杆菌进行培养的具体方法如下:
[0098]将菌株厌氧发酵，包括以下步骤:
[0099](I)种子培养:将1/3-1/2体积的种子培养基置于三角瓶中，高温高压灭菌。冷却后将本发明的重组大肠杆菌按照0.1-10%(V/V)的接种量接种于种子培养基，在37°C以及摇动的条件下培养6-16小时得到种子液，用于发酵培养基接种；
[0100](2)发酵培养:将1/3-1/2体积的发酵培养基体积置于厌氧发酵罐中，将种子液按照终浓度OD55tl=0.05-0.5的接种量接种于发酵培养基，37°C培养2_5天，得到发酵液。
[0101]在一个实施方案中，本发明生产化工原料的方法中还包括从发酵液中收集、提取、分离和/或纯化所得的化工原料的步骤。
[0102]在第三方面，本发明涉及本发明的大肠杆菌在生产丁二酸中的用途。实施例
[0103]本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
[0104]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0105]实施例1:菌株HX-024的构律
[0106]以野生型大肠杆菌ATCC8739为起始菌株，敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，敲除丙酮酸甲酸裂解酶编码基因Pf 1B，敲除磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I基因PtsI，激活半乳糖MFS转运蛋白GalP，激活磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶PCK，敲除磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA，激活苹果酸合成酶AceA和异柠檬酸裂解酶AceB，激活二羧酸Dcu转运蛋白DcuC，得到菌株NZ-037。
[0107]再将NZ-037经过1080代进化后获得菌株HX021。
[0108]从重组大肠杆菌菌株HX021出发，敲除mgsA基因(GenBank N0.ACA78263.1)，获得重组大肠杆菌HX023。
[0109]HX023经过360代进化后获得菌株HX024。HX024以保藏号CGMCC 7259 (2013年2月25日，分类命名:大肠埃希氏菌E.coli)保藏于CGMCC (北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中科院微生物所)。具体构建过程可以参见发明人于同日提交的题目为“生产丁二酸的重组大肠杆菌及其应用”的专利申请说明书。
[0110]实施例2:lpdA及IpdA突夺某闵克降于DTrc99A-M
[0111](I)质粒PXZ163和pXZ174的构建(其中所含有的IpdA基因分别来自于 E.coli ATCC 8739 (Gunsalus et al.，1941，J B1l ChemHl: 853-858)和菌株HX-024(CGMCC7259):
[0112]以E.coli ATCC8739 和 HX-024 的基因组 DNA 为模板，用引物对 8739-lpdA-up-SacI/8739-lpdA-down-PstI (SEQ ID N0.:7/SEQ ID N0.:8)分别进行 PCR 扩增；用限制性内切酶SacI和PstI I (NEB, UK)在37°C酶切30分钟，用相同的限制性内切酶处理pTrc99A_M质粒(Shi et al., 2013, Metab Engl6:1-10),用 PCR 纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extrat1nKU，购自B1MIGA生物技术有限公司);克隆体系:取50ng目标片段，20ng载体pTrc99A_M片段，加入2 μ 110ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至 20μ 1，37°C反应30分钟；加入1μ I Τ4连接酶(NEB公司，400，000粘附末端单位/ml)，室温反应2小时得到连接产物；氯化钙热转化法:取5μ I连接产物加入50 μ ITransl-Tl感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，冰浴30分钟。42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加入250μ1 LB培养基，200rpm，37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有卡那霉素(终浓度为50 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，进行菌落 PCR 验证，引物为 pTrc99A-F/pTrc99A-R(SEQ ID N0.: 17/SEQ ID N0.: 18) ?送样测序分析，结果正确的为阳性克隆，得到质粒PXZ163和pXZ174(表3)。
[0113](2)质粒pXZ165(含有IpdA所编码的多肽中的单突变E354K)、pXZ173(含有IpdA所编码的多肽中的单突变T81I)、pXZ178(含有IpdA所编码的多肽中的单突变P275S)和PXZ179 (含有IpdA所编码的多肽中的单突变A358V)的构建:
[0114]以质粒pXZ163 的 DNA 为模板，用引物对 8739-lpdA-E354K-F/8739-lpdA_E354K-R(SEQ ID N0.:9/SEQ ID N0.: 10)，或引物对 8739-lpdA-T811-F/8739-lpdA_T811-R(SEQ ID N0.:11/SEQ ID N0.:12),或引物对 8739-lpdA-P275S-F/8739-lpdA_P275S-R(SEQID N0.: 13/SEQ ID N0.: 14)，或引物对 8739-lpdA-A358V-F/8739-lpdA_A358V-R(SEQ IDN0.: 15/SEQ ID N0.:16)进行反向PCR扩增；分别得到大小约4kb的片段用限制性内切酶DpnI (NEB公司)在37°C处理模板30分钟，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extrat1nKU，购自B1MIGA生物技术有限公司)；克隆体系:取30ng纯化后的PCR扩增产物，加入2 μ 110ΧΤ4连接缓冲液(NEB公司)、I μ I Τ4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μ 1，37°C反应30分钟；加入I μ I T4连接酶(NEB公司，400，000粘附末端单位/ml)，室温反应2小时得到连接产物；氯化钙热转化法同实施例2(1)。取200 μ I菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为50μg/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，送样进行测序分析，正确的质粒命名为PXZ165, pXZ173，pXZ178和pXZ179 (表3)。
[0115](3)质粒pXZ180(含有IpdA所编码的多肽中的双突变P275S A358V)的构建:以质粒pXZ178 (含有IpdA所编码的多肽中的单突变P275S)的DNA为模板，用引物对8739_lpdA-A358V-F/8739-lpdA-A358V-R(SEQ ID N0.: 15/SEQ ID N0.:16)进行反向 PCR 扩增，分别得到大小约4kb的片段用限制性内切酶DpnI (NEB公司)在37°C处理模板30分钟，用PCR纯化试剂盒清洗(Gel/PCR Extrat1n KU，购自B1MIGA生物技术有限公司)；克隆体系同实施例2 (2);氯化钙热转化法同实施例2 (I)。加入250 μ I LB培养基，200rpm, 37°C孵育I小时。取200 μ I菌液涂在含有氨苄霉素(终浓度为50 μ g/ml)的LB平板上，过夜培养后，挑选2-3个克隆，送样进行测序分析，正确的质粒命名为PXZ180 (表3)。
[0116]表1.本发明构建的菌株
[0117]
[0118]
【权利要求】
1.一种重组大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有突变的IpdA基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID N0.:1所示氨基酸序列如下位置的一个或多个位置上含有修饰:Τ81、Ρ275和 Α358, 对应的位置是通过与SEQ ID N0.:1进行序列比对而确定的， 其中在对应于Τ81的位置上的修饰是用I置换Τ，在对应于Ρ275的位置上的修饰是用S置换P，以及在对应于Α358的位置上的修饰是用V置换Α， 任选地，所述大肠杆菌中所述突变的IpdA基因的表达增强、和/或所述突变的IpdA基因所编码的蛋白质的活性增强。
2.权利要求1的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQID N0.:2所示核苷酸序列如下位置的一个或多个位置上含有突变:C242、C823和C1073， 对应的位置是通过与SEQ ID N0.:2进行序列比对而确定的， 其中所述突变均是用T置换C。
3.权利要求1的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的A358的位置上含有修饰。
4.权利要求2的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQID N0.:2所示核苷酸序列的C1073的位置上含有突变。
5.权利要求1的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因所编码的多肽在对应于SEQIDN0.:1所示氨基酸序列的T81、P275和A358的位置上都含有修饰。
6.权利要求2的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因在对应于SEQID N0.:2所示核苷酸序列的C242、C823和C1073的位置上都含有突变。
7.权利要求1-6任一项的大肠杆菌，其中所述突变的IpdA基因位于质粒或染色体中。
8.权利要求1-6任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌中还含有如下修饰: 磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；PflB和/或adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制； IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP基因和/或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强；和 pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
9.权利要求8的大肠杆菌，其中所述磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)中所涉及的基因是选自如下的一或多种基因:编码PTS系统酶I的基因Pts1、编码PTS系统酶Hpr的基因ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因err和编码PTS系统酶IICBele的基因ptsG。
10.权利要求1-6任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的遗传改造: PflB基因表达的抑制、和/或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制； IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和 frdABCD基因簇表达的抑制、和/或frdABCD基因簇所编码的蛋白质活性的抑制。
11.权利要求ι-?ο任一项的大肠杆菌，其中所述大肠杆菌还含有如下的遗传改造:aceEF基因簇表达的增强、和/或aceEF基因簇所编码的蛋白质活性的增强。
12.生产乙醇和/或丁二酸的方法，所述方法包括培养权利要求1-11任一项的大肠杆菌。
13.权利要求1-11任 一项的大肠杆菌在生产乙醇和/或丁二酸中的用途。
【文档编号】C12N1/21GK104178442SQ201310198769
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】张学礼, 朱欣娜, 陈晶 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所