专利名称：一种从蛋清中提取溶菌酶的方法
技术领域：
本发明是关于一种溶菌酶的提取方法，更具体地说，是关于一种从蛋清 中提取溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶的分子量为14388，为由129个氨基酶组成的碱性球蛋白，是一 种稳定的天然蛋白质，在鸡蛋蛋清中含量最丰富，它的含量约占蛋清的3.5-4 重量。％，还有96重量％左右的蛋白质无溶菌活性而称为杂蛋白。溶菌酶是 一种国内外很紧俏的生化物质，广泛用于医药、化工、食品等行业。溶菌酶 的生产一般以鸡蛋清为原料，工业上常用直接结晶法和离子交换法、超滤法、 亲和色谱法、反胶团萃取、亲和膜色谱、扩张床吸附等技术从蛋清中提取溶 菌酶。虽然有些方法，如采用离子树脂进行洗脱的方法能够得到较高产率的 溶菌酶，但同时蛋清中的大部分蛋白质被破坏，无法应用在蛋白粉的生产工 艺中。
针对不破坏蛋清中蛋白而从蛋清中提取高附加值的溶菌酶的众多分离 纯化方法中，膜分离的方法，特别是超滤法因操作简单、费用低、产品不易 失活、无相变等优点而备受青睐。然而，新鲜蛋清中含有大量的大分子蛋白， 且分浓厚蛋白和稀薄蛋白两部分，未经处理的蛋清为高粘度不均一的体系， 无法直接将新鲜蛋清进行膜分离，而需要在进行膜分离之前先降低蛋清的粘 度。
降低清粘度并使蛋清液达到均一状态的操作方法有很多，如高速搅 拌、稀释等方法。在采用高速搅拌分散蛋清的时候，由于转心处的温度上升 很快，导致接近转心的蛋白会很快变质变性，势必会对溶菌酶的存在产生影响。此外，目前常用的方法还包括采用高倍稀释的方法来降低蛋清的粘度。 稀释液一般为去离子水或盐溶液。用去离子水稀释会产生大量地沉淀，经检 验，沉淀中含有大量的溶菌酶，因此逐渐用盐溶液取代了去离子水。然而， 通过稀释降低粘度的方法会增加料液体积，加重后续超滤操作的负担，而且 如果采用盐溶液作为稀释液，还需增加脱盐等后续操作，使整个工艺复杂化。 无论用盐溶液还是磷酸盐缓冲液作为稀释液进行稀释，都会在超滤操作中不 同程度的增大料液的处理量，这样就会使处理时间延长，产品成本增加。且 在对采用现有方法处理后的蛋清液进行超滤分离后，得到的溶菌酶的收率较 低。
发明内容
本发明的发明目的是克服现有提取溶菌酶的方法的溶菌酶的收率低，提 取效率低的缺陷，提供一种溶菌酶的收率高，提取效率高的从蛋清中提取溶 菌酶的方法。
本发明的发明人发现，蛋清中的溶菌酶仅有一小部分是以游离态存在 的，大部分溶菌酶与其它蛋清蛋白，如卵粘蛋白进行可逆性结合而形成大分 子复合体。该复合体主要是卵粘蛋白与溶菌酶之间存在的静电作用力造成 的，且引力受pH值和离子强度的影响比较大。在采用现有的搅拌或稀释的 方法虽然能够降低蛋清液的粘度，但是却无法完全破坏卵粘蛋白与溶菌酶复 合体之间的静电作用力，大部分溶菌酶仍然不是以游离态存在的，因此，在 进行超滤分离后溶菌酶的收率较低，若要使溶菌酶以单一游离态存在而进行 分离，必须首先破坏卵粘蛋白与溶菌酶复合体之间的静电作用力，使处于结 合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶。
本发明提供了一种从蛋清中提取溶菌酶的方法，该方法包括将蛋清进行 膜分离，其中，该方法还包括在将蛋清进行膜分离之前，先将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶。
按照本发明，要使溶菌酶以单一游离态存在而进行分离，必须首先破坏 卵粘蛋白与溶菌酶复合体之间的静电作用力，使处于结合态的溶菌酶解离为 游离态的溶菌酶。由于蛋清中的高分子蛋白多为糖蛋白，而卵粘蛋白其实也 是糖蛋白，本发明提供的使处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶的优
选的方法为在葡萄糖氧化酶(GOD)的存在下，使蛋清与含氧气体或能产生 含氧气体的物质接触，而葡萄糖氧化酶(GOD)能催化葡萄糖的氧化，在有 氧条件下能将葡萄糖氧化成与其性质完全不同的葡萄糖酸-S-内酯，通过降解 多糖即卵粘蛋白的方法削弱卵粘蛋白与溶菌酶之间的相互作用力，而使溶菌 酶解离成为游离态，为随后的膜分离提供良好的条件。采用本发明的方法得 到的溶菌酶的提取效率较高，且采用本发明的分离方法不会破坏蛋清中的其 它蛋白质，且操作方法、工艺步骤简单，可以应用于蛋白粉生产工艺中，同 时又提取高附加值的溶菌酶。
图1为本发明的方法中用于膜分离的超滤装置示意图。
具体实施例方式
按照本发明，所述从蛋清中提取溶菌酶的方法包括将蛋清进行膜分离， 其中，该方法还包括在将蛋清进行膜分离之前，先将蛋清中处于结合态的溶 菌酶解离为游离态的溶菌酶。
本发明所述将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶的方 法可以为各种能够降解蛋清中与多糖结合的处于结合态的溶菌酶中多糖即 卵粘蛋白而能削弱卵粘蛋白与溶菌酶之间的相互作用力，而使溶菌酶解离成 为游离态的溶菌酶的方法。优选情况下，将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶的方 法包括在葡萄糖氧化酶的存在下，将蛋清与含氧气体或能产生含氧气体的物 质接触。
按照本发明，在葡萄糖氧化酶的存在下，将蛋清与含氧气体或能产生含 氧气体的物质接触的方法包括将葡萄糖氧化酶与蛋清的均匀混合物与含氧 气体或能产生含氧气体的物质均匀混合。
所述接触的条件一般包括pH值、温度和时间，所述接触的温度可以为 葡萄糖氧化酶的任何最适作用温度， 一般为10-5(TC，优选为25-45'C，更优 选为30-35°C。所述接触的时间理论上越长越好，考虑到提取效率，优选所 述接触时间至少为0.5小时，优选为0.5-10小时，更优选为l-5小时。
优选情况下，所述pH值为2-10，优选为3-9，更优选为5-7.5。所述调 节pH值的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法。如根据蛋清或者 所得葡萄糖氧化酶与蛋清混合物的pH值，在其中加入酸性物质或碱性物质。 例如，所述酸性物质可以是硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述碱性物 质可以是氢氧化钠和/或氢氧化钾。
按照本发明的方法，所述葡萄糖氧化酶的用量没有特别限定，尽管少量 的葡萄糖氧化酶即可达到本发明的目的，但为了更好的降解多糖即卵粘蛋白 以削弱卵粘蛋白与溶菌酶之间的相互作用力，使溶菌酶解离成为游离态，优 选情况下，每升蛋清所用葡萄糖氧化酶的量为1-100毫升，更优选为5-60毫 升。
所述葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖的氧化，在葡萄糖氧化酶的存在下， 将蛋清与含氧气体或能产生含氧气体的物质接触而将蛋清中的葡萄糖氧化 成与其性质完全不同的葡萄糖-S-内酯。所述蛋清中的卵粘蛋白是一种糖蛋 白，按照本发明的方法，在葡萄糖氧化酶的存在下，将蛋清与含氧气体或能 产生含氧气体的物质接触，即，将葡萄糖氧化酶与蛋清的均匀混合物与含氧气体或能产生含氧气体的物质均匀混合，使糖蛋白即卵粘蛋白降解，降低卵 粘蛋白与溶菌酶之间的相互作用力，而使溶菌酶分离成为游离态。
所述能产生含氧气体的物质可以为各种能产生含氧气体的物质，优选为 过氧化氢，所述含氧气体可以为氧气或空气。
每升蛋清所用氧的量没有特别限定，少量氧的存在即可达到本发明的目
的，优选情况下，氧的用量至少为0.1摩尔，更优选为0.1-5摩尔，最优选 为0.5-3摩尔。所述氧的用量指参与反应的氧原子的物质的量。
按照本发明，所述接触的方法包括将葡萄糖氧化酶与蛋清的均匀混合物 与含氧气体或能产生含氧气体的物质均匀混合。所述将葡萄糖氧化酶与蛋清 的均匀混合物与含氧气体或能产生含氧气体的物质均匀混合的方法可以采 用本领域公知的各种方法，如可以直接向混合物中通入氧气，或者直接采用 搅拌来增加溶氧量的方法。优选情况下，可向葡萄糖氧化酶与蛋清的均匀混 合物中加入过氧化氢，过氧化氢在所述接触条件下发生分解反应生成氧气。 为了使氧气产生的更均匀，优选采用滴加的方式，更优选采用匀速滴加过氧 化氢的方法，即根据所要滴加的过氧化氢的总量和接触时间确定一个合适的 滴加速度，然后按该滴加速度匀速滴加。
按照本发明，所述葡萄糖氧化酶与蛋清的均匀混合物的制备方法可以采 用本领域公知的各种方法，如先采用搅拌、稀释或加入缓冲溶液等方法将蛋 清分散均匀得到均一的蛋清液，然后再加入葡萄糖氧化酶搅拌使葡萄糖氧化 酶与蛋清混合均匀，或者将葡萄糖氧化酶加入到蛋清中后再采用搅拌、稀释 或加入缓冲溶液等方法将蛋清分散均匀；优选情况下，所述葡萄糖氧化酶与 蛋清的均匀混合物的制备方法为采用超声波均质处理的方法。例如，可以先 将葡萄糖氧化酶与蛋清混合，然后用超声波均质处理，或者先对蛋清用超声 波均质处理，然后将经过均质处理后的蛋清与葡萄糖氧化酶混合，并优选再 次用超声波均质处理。当超声波达到某 -物质中时，由于声波的作用使物质中的分子也跟着振 动，振动的频率和声波频率相同，分子振动的频率决定了分子振动的速度。 频率愈高速度愈大。物质中的分子由亍振动所获得的能量除了与分子的质量 有关外，是由分子的振动速度的平方决定的，所以如果声波的频率愈高，也 就是物质分子愈能得到更高的能量、超声波的频率可以比声波高很多，所以 它可以使物质中的分子获得很大的能量，也就是说超声波本身可以供给物质 足够大的功率。
因此，采用超声波这种均质方式，可以通过控制它的功率来对蛋清进行 均质，既不会破坏细胞又可以达到良好的分散效果，得到均一的蛋清液。
用于超声波分散的设备为本领域常规的设备，如较大功率的直插式功率
类超声设备，它主要由超声波发生器和换能器两大部分组成。发生器将50 赫兹工频的电能转换成超声频率的电能供给换能器，而换能器连着变幅杆， 变幅杆插入液体中，从而将超声频率的电能转换为纵向振动的机械能，在液 体介质中产生超声空化效应。
一般而言，超声波在液体介质中传播时，因空化效应而产生疏密区，在 某些区域形成暂时的负压，可在介质中产生很多空腔，这些空腔随振动的高 频压力变化而膨胀、破裂；另外，超声波在液体介质中传播时还产生剧烈的 振动作用，使物质产生高速运动，从而相互碰撞。空化强度与超声输入功率 和超声频率有关，增大超声输入功率能增大空化强度，而超声频率越低则空 化强度越大，因此为了达到本发明的目的，优选较大功率的直插式功率类超 声设备，它的超声频率在20-100千赫兹，优选为20-30千赫兹。超声输入功 率低于100瓦，则空化效应不强，因此超声输入功率为高于100瓦，优选为 100-1000瓦。超声分散的时间为10-120分钟，优选为30-80分钟。
所述采用超声波均质处理的具体方法没有特别限定，可以采用连续式处 理方法也可以采用间歇式处理方法。优选情况下，为了使均质效果更好，优选采用间歇式处理方法，如，所述超声波处理方法可以包括多个处理阶段， 相邻的两个处理阶段之间包括时间间隔，每个处理阶段的处理时间可以为 1-5秒钟，所述时间间隔可以为6-15秒钟；所述处理阶段的个数没有特别限
定，优选情况下，总的处理时间为5-30分钟。每个处理阶段的功率可以相 同也可以不同。
按照本发明，所述对与含氧气体或能产生含氧气体的物质接触后的蛋清 进行膜分离的方法可以采用本领域公知的各种膜分离方法及设备进行膜分 离，如可以采用透析、盐析、超滤以及微滤等方法。本发明优选采用超滤的 方法对与含氧气体或能产生含氧气体的物质接触后的蛋清进行膜分离，从蛋 清中分离出溶菌酶。
如图1所示，所述超滤装置一般包括样品槽l，泵2，压力表3，调控阀 4和膜组件5，在进行超滤处理的时候，样品槽1中的料液通过管道被泵2 从入口7泵入膜组件中，经过超滤后，从出口6收集滤液，残余物通过出口 8流出，并通过调控阀4控制残余物流出的流量，并返回样品槽l中再次进 行循环超滤。压力表3分别显示上、下两膜层的压力，而得到膜组件的膜间 压力。
应用超滤的方法可以根据截留分子量截留生物大分子以及胶体物质等， 本领域技术人员可以根据具体情况选用适合特性的超滤膜，所述超滤膜的特 性包括超滤膜的膜材料、耐温范围、有效膜面积、最大操作压力、使用的pH 值、最大残存体积以及膜尺寸等。本发明优选的超滤膜的截留分子量为 13000-100000道尔顿，优选为14000-20000道尔顿；膜间压力差为0.04-0.2 兆帕，优选为0.04-0.12兆帕。
下面将通过具体实施例来更详细地描述本发明。
实施例1该实施例说明本发明提供的溶菌酶的提取方法。
在3(TC下，将300毫升蛋清置于钢桶中，将超声波细胞粉碎机(宁波 荣顺科技仪器厂生产，型号为JY99-IIIS，超声波频率为20千赫兹，最大输 出功率为2800瓦)的变幅杆(直径为15毫米)放入钢桶中，并且浸入液 面以下20毫米，接通电源，超声波功率为100瓦，进行间歇式的超声波处 理，每处理3秒，停10秒，总的处理时间为5分钟；然后改变超声波功率 为300瓦，继续采用每处理3秒，停10秒的方式进行超声波处理，总的处 理时间为5分钟；然后采用同样的处理方法分别在功率为500瓦和700瓦 下处理10分钟。得到均质后的蛋清液。
采用液相色谱，采用Superose GL凝胶色谱柱，流动相为含有1摩尔/ 升NaCl的100毫摩/升的磷酸盐缓冲溶液(pH 9.0)，设定流速为1毫升/分钟。 排出的流体用UV检测器在波长为340纳米处进行在线检测。溶菌酶的标 准样品在此系统中的流出时间(即出峰时间)为第28分钟，而该样品的出 峰时间也为第28分钟，根据此流出时间处的吸光度值并结合溶菌酶的标准 曲线确定样品中溶菌酶的含量，即，测得该均质后的蛋清液中溶菌酶的浓 度为5克/升，记为Co。
在上述均质后的蛋清液中加入HC1水溶液(浓度为1摩尔/升)调节pH 值为6.0，然后在3(TC下，加入10毫升葡萄糖氧化酶，混合均匀后，滴加 H202 (浓度为30重量％)， &02的加入量为0.8摩尔。然后在3(TC下反应5 小时，得到含有溶菌酶的料液。采用液相色谱，采用Superose GL凝胶色谱 柱，流动相为含有1摩尔/升NaCl的100毫摩/升的磷酸盐缓冲溶液(pH9.0)， 设定流速为1毫升/分钟。排出的流体用UV检测器在波长为340纳米处进行 在线检测。溶菌酶的标准样品在此系统中的流出时间(即出峰时间)为28 分钟，而该样品的出峰时间也为28分钟，根据此流出时间处的吸光度值并 结合溶菌酶的标准曲线确定样品中溶菌酶的含量，即，测得该料液中溶菌酶的浓度为4克/升，记为c;。
制备图1所示的超滤装置，将上述经过均质处理的料液通过泵通入膜组
件(Pall公司的Mininate TFF Capsule w/100Kd Omega平板超滤膜，有效膜 面积为400厘米2)中进行超滤，料液的通入量使超滤膜的膜面流量为10毫 升/分钟，通过压力表控制膜组件的膜间压力差为0.08兆帕，超滤时间30分 钟，收集到24毫升透过液，并采用液相色谱测得该透过液中溶菌酶的浓度 为3克/升，记为Cp。
并按照下述公式计算得到溶菌酶的提取效率为4.5克/米2.小时。
提取效率公式Y=JXRXC0
Y为溶菌酶产率，克/米、小时；
J为渗透通量，升/米2，小时-，
R为溶菌酶的透过率，％;
Q)为原料液中溶菌酶的浓度，克/升。
R = Cp/Cr
Cp为透过液中溶菌酶的浓度，克/升； Cr为主体料液中溶菌酶的浓度，克/升。
J=V/ (tXA)
V为t时间(小时)内收集的样品的体积，升； A为有效膜面积，米2。
实施例2
该实施例说明本发明提供的溶菌酶的提取方法。
在3(TC下，将300毫升蛋清置于钢桶中，将超声波细胞粉碎机(宁波荣顺科技仪器厂生产，型号为JY99-IIIS，超声波频率为20千赫兹，最大输出 功率为2800瓦)的变幅杆(直径为15毫米)放入钢桶中，并且浸入液面以 下20毫米，接通电源，超声波功率为300瓦，进行连续的超声波分散，15 分钟后，得到均质后的蛋清液。采用液相色谱测得该均质后的蛋清液中溶菌 酶的浓度为5克/升，记为Co。
在上述均质后的蛋清液中加入HC1水溶液(浓度为1摩尔/升)调节pH 值为7.0，然后在35'C下，加入2.5毫升葡萄糖氧化酶，混合均匀后，以2 毫升/分钟的滴加速度滴加H202 (浓度为30重量％)， 11202的加入量为0.3 摩尔。然后在35"C下反应3.5小时，得到含有溶菌酶的料液。采用液相色谱 测得该料液中溶菌酶的浓度为3.8克/升，记为Cr。
制备图1所示的超滤装置，将上述经过均质处理的料液通过泵通入膜组 件(Pall公司的Mininate TFF Capsule w/30Kd Omega平板超滤膜，有效膜面 积为400厘米2)中进行超滤，料液的通入量使超滤膜的膜面流量为15毫升 /分钟，通过压力表控制膜组件的膜间压力差为0.08兆帕，超滤时间20分钟， 收集到20毫升透过液，并采用液相色谱测得该透过液中溶菌酶的浓度为3.5 克/升，记为Cp。并按照实施例1的方法计算得到溶菌酶的提取效率为6.91 克/米2，小时。
实施例3
该实施例说明本发明提供的溶菌酶的提取方法。
按照实施例1的方法从蛋清中提取溶菌酶，不同的是，采用机械搅拌的 方法对蛋清进行均质，搅拌速度为300转/分钟，搅拌时间为15分钟。采用 与实施例1相同的方法测得该均质后的蛋清液中溶菌酶的浓度为4.8克/升， 记为C。。然后，采用与实施例1相同的方法向均质后的蛋清中加入葡萄糖氧 化酶并进行随后的超滤处理，H2(32的加入量为0.12摩尔，反应温度为4(TC，反应时间为2.5小时，超滤前，采用液相色谱测得该料液中溶菌酶的浓度为 4.3克/升，记为C超滤后采用液相色谱测得该透过液中溶菌酶的浓度为3.2 克/升，记为Cp。并按照实施例1的方法计算得到溶菌酶的提取效率为4.28 克/米2 小时。
对比例1
该对比例说明溶菌酶的参比提取方法。
按照实施例1的方法从蛋清中提取溶菌酶，不同的是，在进行超滤之前， 不加入葡萄糖氧化酶，并采用机械搅拌的方法对蛋清进行均质，搅拌速度为 300转/分钟，搅拌时间为15分钟。采用与实施例1相同的方法测得该均质 后的蛋清液中溶菌酶的浓度为4.8克/升，记为Co，因为没有加入葡萄糖氧化 酶的步骤，因此C;二C()。超滤后采用液相色谱测得该透过液中溶菌酶的浓度 为2.92克/升，记为Cp。其它条件和方法同实施例1，并按照实施例1的方 法测得溶菌酶的提取效率为3.5克/米2，小时。
由上述结果可以看出，与现有方法相比，采用本发明的方法从蛋清液中 提取出的溶菌酶的提取效率较高，且采用本发明的分离方法不会破坏蛋清中 的蛋白质，操作方法、工艺步骤简单，可以应用于蛋白粉生产工艺中，同时 提取高附加值的溶菌酶。
权利要求
1、一种从蛋清中提取溶菌酶的方法，该方法包括将蛋清进行膜分离，其特征在于，该方法还包括在将蛋清进行膜分离之前，先将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中，将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶的方法包括在葡萄糖氧化酶的存在下，将蛋清与含氧 气体或能产生含氧气体的物质接触。
3、 根据权利要求2所述的方法，其中，所述能产生含氧气体的物质为 过氧化氢。
4、 根据权利要求2所述的方法，其中，所述含氧气体为氧气或空气。
5、 根据权利要求2所述的方法，其中，将蛋清与含氧气体或能产生含 氧气体的物质接触的条件包括pH值为2-10，接触的温度为10-50°C，接触 的时间至少为0.5小时；每升蛋清所用氧的量至少为0.1摩尔，每升蛋清所 用葡萄糖氧化酶的量为1-100毫升。
6、 根据权利要求5所述的方法，其中，将蛋清与含氧气体或能产生含 氧气体的物质接触的条件包括pH值为3-9，接触的温度为25-45"C，接触的 时间为0.5-10小时；每升蛋清所用氧的量为0.1-5摩尔，每升蛋清所用葡萄 糖氧化酶的量为5-60毫升。
7、根据权利要求2所述的方法，其中，接触的方法包括将葡萄糖氧化酶与 蛋清的均匀混合物与含氧气体或能产生含氧气体的物质均匀混合，所述葡萄 糖氧化酶与蛋清的均匀混合物的制备方法为将葡萄糖氧化酶与蛋清混合，然后用超声波均质处理，或者先对蛋清用超声波均质处理，然后将经过均质处 理后的蛋清与葡萄糖氧化酶混合，并再次用超声波均质处理。
8、 根据权利要求7所述的方法，其中，超声波频率为20-100千赫兹， 超声波的超声输入功率为100-1000瓦，超声波均质处理的时间为10-120分 钟。
9、 根据权利要求1所述的方法，其中，所述膜分离的方法包括采用超 滤膜对与含氧气体或能产生含氧气体的物质接触后的蛋清进行超滤，所述超 滤膜的截留分子量为13000-100000道尔顿，膜间压力差为0.04-0.2兆帕。
全文摘要
一种从蛋清中提取溶菌酶的方法，该方法包括将蛋清进行膜分离，其中，该方法还包括在将蛋清进行膜分离之前，先将蛋清中处于结合态的溶菌酶解离为游离态的溶菌酶。采用本发明的分离方法不会破坏蛋清中的蛋白质，且操作方法、工艺步骤简单，可以应用于蛋白粉生产工艺中，同时提取高附加值的溶菌酶。
文档编号C12N9/36GK101434944SQ200710187139
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者祝学远 申请人:比亚迪股份有限公司