专利名称：高活性鸡蛋清溶菌酶的简易提取方法
技术领域：
本发明涉及高活性鸡蛋清溶菌酶的简易纯化、浓缩与干燥方法。
背景技术：
溶菌酶具有专一水解微生物细胞壁的作用，故能杀菌和破壁，因而广泛用于食品工业的低度酒、香肠、糕点、面条、饮料、乳制品等的防腐；医疗保健方面的消炎药、漱口液、牙膏；基因工程方面的质粒、包含体、细胞的破壁作用；工业上酵母膏增产的酵母破壁等。溶菌酶的生产一般以鸡蛋清为原料，提取的方法早有报道，主要有树脂吸附、盐析与结晶及超滤法。结晶纯化法太费时，且生产率较低。超滤纯化浓缩法需要特殊设备，蛋清必需用磷酸盐缓冲液(I＝0.2)稀释10倍，蛋清蛋白质难于回收利用。纯化液常用冷冻干燥法，冷冻设备昂贵、耗电多。以上种种原因使高活性的溶菌酶生产成本高、而产品在国际上定价低、限制了溶菌酶的规模化生产。
发明内容本发明的目的是研发一种提取高活性鸡蛋清溶菌酶的简易方法。
蛋清溶菌酶粗制品或者盐析物经透析后的稀释液调节pH值、加少量磷酸盐再调节pH值、通过离心去除杂质，纯化液在40℃真空旋转蒸发，浓缩液于室温下真空干燥。详细操作程序见
。
该方法涉及的设备有离心机、搅拌器、pH试纸、透析袋、真空旋转蒸发器、真空泵和724树脂。试剂有硫酸铵、磷酸盐缓冲液、盐酸、氢氧化钠。
利用本方法提取的高活性鸡蛋清溶菌酶，其方法简便易行，产品质量高，用途广泛。
图1高活性鸡蛋清溶菌酶简易提取方法流程1中的1是新鲜鸡蛋洗净，取出蛋清(严防蛋黄混入)、冷藏；2是处理724树脂先后分别用2mol/L盐酸、氢氧化钠浸泡树脂2小时，分别用去离子水洗至近中性，再用0.15mol/L、pH6.5的磷酸盐缓冲液浸泡过夜，滤后备用；3是冷藏的蛋清加入处理好的724树脂(按每公斤蛋清加处理之前的树脂160克)，大力搅拌(冰浴中)吸附6小时，4℃静置待分层；4是离心(3000rpm，15min)，收集树脂，回收蛋清供食用；5是洗去杂蛋白树脂先用蒸馏水洗至洗液无浑浊，再用等体积的0.15mol/L、pH6.5的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤20min(冰浴下)，再重复两次；6是洗脱溶菌酶树脂用等体积10％的硫酸铵浸泡10min，搅拌30min，洗脱液经尼龙布过滤，准确量取体积。树脂再重复洗脱两次，合并洗脱液；7是盐析每83ml洗脱液在搅拌下缓慢加入32克固体硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后、4℃放置过夜，离心(3000rpm，15min)收集沉淀；8是透析将盐析沉淀装入透析袋，用去离子水透析24h，其间换两次去离子水；9是去杂质取出透析液，用2mol/L盐酸调整pH值4-5，离心，收集上清液。其沉淀加少量蒸馏水，再重复处理两次。上清液合并、调pH＝5.5，再加入1mol/L磷酸氢二钠～磷酸二氢钾缓冲液(pH＝5.5)达终浓度为10mmol/L，静置10min、离心、弃沉淀，收集上清纯化液；10是浓缩与干燥纯化液在(40±2)℃下真空旋转蒸发，变浊时倒出、冷冻。25℃以下真空干燥，获得淡黄色产品。
具体实施方式
实施例蛋清1178克，按比例加处理好的724树脂、搅拌(冰浴中)吸附6小时。离心、收集树脂，用水和磷酸盐缓冲液分别洗去杂蛋白，再用等体积10％的硫酸铵浸泡、搅拌洗脱。三次洗脱液的总体积约820ml。每83ml洗脱液加32克研细的硫酸铵搅拌至完全溶解，静置分层后，离心，收集盐析沉淀。沉淀对水透析，透析后调整pH4-5、离心、弃褐色沉淀。其上请液(约40ml)调整pH＝5.5、再加1mol/L磷酸氢二钠～磷酸二氢钾缓冲液(pH＝5.5)达终浓度为10mmol/L(约0.4ml)，静置10分钟，离心、弃沉淀。其纯化液在(40±2)℃下真空旋转蒸发，变浊时倒出，冷冻后25℃以下真空干燥。获产品为淡黄色大颗粒结晶0.7248克，其产品活性范围13539U/mg～15741U/mg。回收的蛋清可直接食用，磷酸盐、硫酸铵及蛋白质废水液可回收作肥料。724树脂经酸、碱处理，可反复利用。这样除可大大降低成本，实现蛋清的综合应用之外，主要是使溶菌酶的生产效率较传统方法可提高近20倍，效益显著。
权利要求
1.一种高活性鸡蛋清溶菌酶简易提取方法，其特征在于在生产程序中对取出的透析液用盐酸调整的pH值为4-5，上清液合并后再调pH值为5.5，再在45℃左右下真空旋转蒸发，在室温下真空干燥获得淡黄色产品。
全文摘要
本发明涉及鸡蛋清溶菌酶高活性的简易纯化、浓缩与干燥方法。蛋清溶菌酶被树脂吸附、洗脱、硫酸铵盐析、透析，再用创新技术调整透析液pH值、离心，收集上清液。其沉淀加少量蒸馏水、重复处理两次后弃褐色不容物，合并上清液、调pH＝5.5，加入1mol/L、pH＝5.5的磷酸盐缓冲液、达终浓度为10mmol/L，静置片刻、离心，收集纯化液，于40℃真空旋转蒸发，浓缩液冰冻后室温真空干燥。产品呈淡黄色、活性范围13539U/mg～15741U/mg，与超滤浓缩、冷冻干燥产品(14610U/mg)基本一致。其产率(0.7248g/kg蛋清)比文献报道的工艺(树脂吸附→洗脱→硫酸铵盐析→透析→结晶纯化→丙酮浓缩蒸发干燥)产率(0.0367g/kg蛋清)高19.75倍。生产成本低，效果显著。
文档编号C12N9/36GK1492041SQ0313904
公开日2004年4月28日 申请日期2003年9月12日 优先权日2003年9月12日
发明者杨景芝, 孙衍华, 张杰道, 白吉刚, 杨国栋, 李菡 申请人:山东农业大学