专利名称：一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶与活性蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物、医药及食品工业技术领域，更具体涉及一种从鸡蛋清中共分离制备溶菌酶和其它活性蛋白的方法。
背景技术：
鸡蛋清中含有溶菌酶、卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和其它多种球蛋白。其中，溶菌酶(Lysozyme)可以选择性水解细菌细胞壁的N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β_1，4糖苷键，是一种安全高效的天然抗菌剂，可用于海产品、水产品、肉制品、乳酪制品、低度酒、糕点等多种食品的防腐保鲜，用于基因工程中提取细菌体内的活性物质，用于制备口腔药片或漱口液，用于治疗副鼻窦炎、口腔溃疡和渗出性中耳炎等疾病。卵白蛋白可用于制备酶解卵白蛋白，发挥抑制细胞病变，增强人体免疫力，清除对人体有害的自由基，改善新陈代谢的作用。卵转铁蛋白具有抗菌与抗病毒活性，在提高机体的免疫功能，增强机体抗病防病能力，防治贫血方面具有广阔的应用前景。
当前所用的溶菌酶制备方法有直接结晶法、亲和色谱法、超滤法、反胶团萃取法与离子交换法等。这些方法有的虽然操作简单，成本较低，但是生产周期长，收率不高，纯度较低；有的成本较高，操作难度较大，限制了在工业上的大规模应用。同时上述方法都不利于共分离制备鸡蛋清中的卵白蛋白、卵转铁蛋白等其它活性蛋白。
我国目前已经成为世界上鲜蛋生产第一大国，但鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工程度明显落后于发达国家40%以上的鲜蛋加工率。如何更加有效地从鸡蛋清中分离获取溶菌酶及卵白蛋白、卵转铁蛋白等其它活性蛋白是当今深受关注的课题。发明内容
本发明的目的是提供一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶和其它活性蛋白的方法。该方法所用工艺简单快捷，条件温和，无需复杂设备，可以获得高纯度与高生物活性的溶菌酶，可以克服现有溶菌酶制备工艺的缺点。本发明在实施制备溶菌酶的同时还可以获得较高纯度的其它活性蛋白。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施: O室温下取新鲜鸡蛋，收集鸡蛋清，按照鸡蛋清与新鲜去离子水体积比为1:2的比例进行稀释，随后用IM盐酸调至pH 5.5左右，均匀搅拌I小时，SOOOrpm离心去除沉淀，收集上清液A。
2)向所得上清液A中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，至聚乙二醇的质量浓度达10-30%，再搅拌I小时，8000rpm离心，收集上清液B。
3)向所得上清液B中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度达到15%，混匀后于6000rpm离心,分别收集上层清液C与下层清液D。
4)对所得上层清液C，以膜截留分子量为3000_5000Da的超滤膜进行超滤，或者进行透析处理，对超滤或者透析处理所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶。
5)对所得下层清液D，以膜截留分子量为3000_5000Da的超滤膜进行超滤，或者进行透析处理，对超滤或者透析处理所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的较高纯度的其它活性蛋白。
本发明具有以下优点: I本发明涉及的提取原料鸡蛋清来源广泛，价格低廉； 2本发明所用工艺操作简单易行，生产周期短，无需复杂设备，易于大规模工业化生产； 3本发明所用工艺未使用任何有毒有害化学物质，确保产品质量的安全性； 4本发明所用分离步骤中无相变发生，有利于保护溶菌酶与其它蛋白的生物学活性； 5本发明从鸡蛋清中提取溶菌酶的同时还可以获取卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的较高纯度的其它活性蛋白，显著提高生产工艺的经济效益。
图1为一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶和其它活性蛋白的方法的工艺流程示意图。
图2为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚乙二醇200处理蛋清所得结果。其中，泳道1:蛋白分子量标准；泳道2:所用鸡蛋清原料；泳道3:质量浓度为10%的聚乙二醇200处理后鸡蛋清；泳道4:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得上相溶液；泳道5:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得下相溶液。
图3为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚乙二醇200处理蛋清所得结果。其中，泳道1:蛋白分子量标准；泳道2:所用鸡蛋清原料；泳道3:质量浓度为30%的聚乙二醇200处理后鸡蛋清；泳道4:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得上相溶液；泳道5:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得下相溶液。
图4为十二烷基 磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚乙二醇20000处理蛋清所得结果。其中，泳道1:蛋白分子量标准；泳道2:所用鸡蛋清原料；泳道3:质量浓度为10%的聚乙二醇20000处理后鸡蛋清；泳道4:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得上相溶液；泳道5:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得下相溶液。
图5为十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚乙二醇20000处理蛋清所得结果。其中，泳道1:蛋白分子量标准；泳道2:所用鸡蛋清原料；泳道3:质量浓度为30%的聚乙二醇20000处理后鸡蛋清；泳道4:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得上相溶液；泳道5:质量浓度为15%的硫酸铵处理后所得下相溶液。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的描述: 实施例1 新鲜鸡蛋清100ml，加入200ml新鲜去离子水，用IM盐酸调pH至5.5左右，搅拌I小时，8000rpm离心30min除去沉淀。离心获取的上清液，加聚乙二醇200，至聚乙二醇的质量浓度为10%，搅拌均匀，室温放置I小时，8000rpm离心30min，除去沉淀。离心获取的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度为15%，搅拌均匀，室温放置I小时，6000rpm离心30min，分别吸取上层清液与下层清液。上层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为溶菌酶，得率为80%。下层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的其它活性蛋白，得率为75%。所得溶菌酶经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，酶活可达到25000U/mg。所得其它活性蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明卵白蛋白与卵转铁蛋白为主要成分，分别占总蛋白的50%与30%，可以直接应用于食品工业或者进一步精制分离(见图2)。
实施例2 新鲜鸡蛋清100ml，加入200ml新鲜去离子水，用IM盐酸调pH至5.5左右，搅拌I小时，8000rpm离心30min除去沉淀。离心获取的上清液，加聚乙二醇200，至聚乙二醇的质量浓度为30%，搅拌均匀，室温放置I小时，8000rpm离心30min，除去沉淀。离心获取的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度为15%，搅拌均匀，室温放置I小时，6000rpm离心30min，分别吸取上层清液与下层清液。上层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为溶菌酶，得率为70%。下层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的其它活性蛋白，得率为65%。所得溶菌酶经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，酶活可达到25000U/mg。所得其它活性蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明卵白蛋白与卵转铁蛋白为主要成分，分别占总蛋白的50%与25%，可以直接应用于食品工业或者进一步精制分尚(见图3)。
实施例3 新鲜鸡蛋清100ml，加入200ml新鲜去离子水，用IM盐酸调pH至5.5左右，搅拌I小时，8000rpm离心30min除去沉淀。离心获取的上清液,加聚乙二醇20000,至聚乙二醇的质量浓度为10%，搅拌均匀，室温放置I小时，8000rpm离心30min，除去沉淀。离心获取的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度为15%，搅拌均匀，室温放置I小时，6000rpm离心30min，分别吸取上层清液与下层清液。上层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为溶菌酶，得率为55%。下层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的其它活性蛋白，得率为50%。所得溶菌酶经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，酶活可达到25000U/mg。所得其它活性蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明卵白蛋白与卵转铁蛋白为主要成分，分别占总蛋白的25%与35%，可以直接应用于食品工业或者进一步精制分尚(见图4)。
实施例4 新鲜鸡蛋清100ml，加入200ml新鲜去离子水，用IM盐酸调pH至5.5左右，搅拌I小时，8000rpm离心30min除去沉淀。离心获取的上清液,加聚乙二醇20000,至聚乙二醇的质量浓度为30%，搅拌均匀，室温放置I小时，8000rpm离心30min，除去沉淀。离心获取的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度为15%，搅拌均匀，室温放置I小时，6000rpm离心30min，分别吸取上层清液与下层清液。上层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为溶菌酶，得率为35%。下层清液以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜在室温下进行超滤，对超滤液进行真空冷冻干燥，所得白色粉末即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的其它活性蛋白，得率为40%。所得溶菌酶经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，酶活可达到25000U/mg。所得其它活性蛋白经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明卵白蛋白与卵转铁蛋白为主要成分，分别占总蛋白的25%与30%，可以直接应用于食品工业或者进一步精制分尚(见图5)。`
权利要求
1.一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶与活性蛋白的方法，按照下述步骤进行: (1)室温下取新鲜鸡蛋，收集鸡蛋清，按照鸡蛋清与新鲜去离子水体积比为1:2的比例进行稀释，随后用IM盐酸调至pH 5.5左右，均匀搅拌I小时，SOOOrpm离心去除沉淀，收集上清液A ； (2)向所得上清液A中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，至聚乙二醇的质量浓度达10-30%，再搅拌I小时，8000rpm离心，收集上清液B ； (3)向所得上清液B中加入饱和硫酸铵溶液，至硫酸铵的质量浓度达到15%，混匀后于6000rpm离心,分别收集上层清液C与下层清液D ； (4)对所得上层清液C，以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜进行超滤，或者进行透析处理，对超滤或者透析处理所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为溶菌酶； (5)对所得下层清液D，以膜截留分子量为3000-5000Da的超滤膜进行超滤，或者进行透析处理，对超滤或者透析处理所得溶液进行真空冷冻干燥，得到白色粉末，即为卵白蛋白与卵转铁蛋白为 主的较高纯度的其它活性蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种共分离制备鸡蛋清溶菌酶与活性蛋白的方法，步骤如下在室温下收集鸡蛋清，并调节pH至5.5左右，搅拌均匀后离心；向离心后得到的上清液中加入分子量介于200-20000的聚乙二醇，搅拌均匀后离心；向离心后得到的上清液中加入饱和硫酸铵溶液，混匀后离心；分别收集离心得到的上层清液和下层清液；对上层清液进行超滤或者透析处理可以得到高纯度的鸡蛋清溶菌酶；对下层清液进行超滤或者透析处理可以得到卵白蛋白与卵转铁蛋白为主的较高纯度的其它活性蛋白。本发明简单易行，成本低廉，条件温和，可以很好地保持溶菌酶品质，适用于大规模工业化生产，同时还可以得到其它活性蛋白，进一步提高生产效益。
文档编号C07K14/79GK103160482SQ201310080459
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月14日 优先权日2013年3月14日
发明者闻崇炜, 宁德刚, 徐卫东 申请人:江苏大学