检测杀细胞的毒素(pvl)的装置和方法
【专利摘要】本发明提供检测生物样本中生物分子，例如PVL,PBP2a和SPA的方法和装置。
【专利说明】
检测杀细胞的毒素(PVL)的装置和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检测生物样品中细菌毒素的装置和方法。尤其本发明涉及一种用于识别样品中存在的金黄色葡萄球菌菌株产生的生物分子，如杀细胞的毒素(Panton-Valentine Leukocidin, PVL)和 PBP2a,的横向流动检测。
【背景技术】
[0002]接下去的背景信息旨在帮助读者理解本发明，并不属于现有技术。
[0003]金黄色葡萄球菌是一种临床医学革兰氏阳性菌。约20-30%的健康人群的粘膜上携带金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌可引起多种疾病，包括败血症，中毒性休克，肺炎，皮肤和软组织感染，骨和人造植入物的感染。金黄色葡萄球菌也在多种动物中被检测到。
[0004]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是含有被称为PBP2a的另一种青霉素结合蛋白的金黄色葡萄球菌，PBP2a由基因mecA基因和不同的等位基因编码。正如其名称所示，MRSA的检测是通过存在甲氧西林情况下观察到金黄色葡萄球菌的生长，也可以是其他β -内酰胺类抗生素如青霉素类，头孢菌素类和碳青霉烯类。
[0005]由于治疗方法的局限性，MRSA是住院患者发病和死亡的一个重要原因，并对感染控制和公共卫生提出了挑战。由于需要昂贵的二线药物和检疫措施，MRSA花费了医疗服务提供者相当多的成本。世界上估计有5300万MRSA携带者，美国有250万MRSA携带者。
[0006]杀白细胞毒素(PVL)的毒素是金黄色葡萄球菌的噬菌体源性致病因子。它是金黄色葡萄球菌和MRSA临床上重要的噬菌体源性的致病因子。PVL是由两个相邻的共同表达基因 IukS-PV 和 lukF-PV(lukS-PV, IukF-PV, GenBank ΒΑ000033.2:MW1378undMWl379)编码。IukS-PV的T细胞表位能诱发LsT细胞强烈增殖，该IukS-PV的T细胞表位目前具有以下特点:N169YISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193 (Brown, et al.，OpenJ.1mmunol.，2(3):111-115(2012))。这些分子的聚合物在人类白细胞细胞膜上形成孔，导致细胞死亡和细胞因子的释放否。或者，其低浓度可诱导粒细胞的细胞凋亡。
[0007]PVL与Y -溶血素(lukF/S-hlg)和其他杀白细胞素有关(金黄色葡萄球菌中的lukE/D, lukM/lukF_P83和中间葡萄球菌(S.1ntermedius) /假中间葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的lukF/S-1nt)。PVL在结构上，按照序列相似性，与其它杀白细胞素有关，如金黄色葡萄球菌中的lukE/D，lukM/lukF-P83和中间葡萄球菌(S.1ntermedius)/ 假中间葡萄球菌(S.pseudintermedius)中的 lukF/S-1nt,与 hlgA/lukF/S-hlg - Y-溶血素/杀白细胞素位点。
[0008]如上所述，PVL是人类白细胞素，因为它在白血细胞的细胞膜上形成聚合微孔。白细胞死亡导致细胞因子的释放并吸引新的白血细胞。PVL基因为噬菌体源性并且是可移动的；它们被发现有非常多样化的克隆物(例如CC1，5，8，15，22，25，30，45，59，72，80，88，93，96/154，121，188，398)。到目前为止，PVL仅限于从人体分离的金黄色葡萄球菌菌株中。来自反刍动物(如牛，山羊和绵羊)的金黄色葡萄球菌有另一种特异的杀白细胞素，由IukM和lukF-P83 (例如，在 CC479, 151，133，97，30，20 中)基因编码。
[0009]当皮肤和软组织感染(SSTI)与慢性/复发性感染有关时，如疖病，尤其是在年轻人和曾健康的成年人中，从那里分离出的金黄色葡萄球菌中PVL经常能被检测到。PVL阳性的金黄色葡萄球菌也可引起更严重的疾病，例如坏死性肺炎。这种情况偶尔是其他呼吸道感染的并发症如感冒，其致死率可高达40%。与此相反，分离自健康携带者的金黄色葡萄球菌，或从那些与其他感染类型如菌血病有关的菌株中，PVL很少被分离到。
[0010]虽然PVL在20世纪30年代才有描述，但在19世纪后期(28)就已假设PVL为由某些金黄色葡萄球菌菌株产生的一种强效杀白细胞素。在20世纪40年代和60年代，全球爆发PVL阳性，甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌，到20世纪90年代后期已经出现PVL阳性MRSA后天免疫性群体(caMRSA)。
[0011]很多临床状况与PVL有关，包括皮肤和软组织感染，脓肿，疖病(疖)，和乳腺炎。这些状况的范围从轻微感染到威胁生命，例如坏死性筋膜炎。与PVL相关的感染往往是慢性或反复出现的。金黄色葡萄球菌偶尔也引起肺炎，常作为重复感染或流行感冒的并发症。坏死性肺炎，肺炎的最严重形式，通常与PVL有关，并且往往是致命的。
[0012]从健康携带者或与植入物有关的感染中分离到的金黄色葡萄球菌中，PVL是极罕见的。而来自如脓肿或疖等感染的菌株中，PVL是普遍的。由于倾向于引起慢性、复发性或特别严重感染，要确保对PVL阳性金黄色葡萄球菌菌株的治疗不同于“正常”金黄色葡萄球菌，要更加积极。在英国，这是卫生防护局做出的指导方针的官方推荐。
[0013]迄今为止，PVL检测主要使用分子方法，该方法基本上局限于具有设备和经验的参考中心和专业实验室来进行这种测定。目前检测PVL和PBP2a的方法包括聚合酶链接反应(PCR)来鉴定PVL和PBP2a的基因。PCR只能在专门的实验室用专用硬件和训练有素的人员来执行并且需要样品的制备。那些具有家庭医生和初级保健中心的患者不能使用这样的实验设施。这些不能确诊案例因而可能没有得到充分治疗，对病人造成更大的健康风险，并对医生和医院造成潜在的经济后果。鉴定产生PVL的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的其他方法，诸如那些在美国2010/0129839中公开的方法，需要预处理生物样品(即，加热)以变性PVL，除了要耗费更多时间和工作的免疫性测定如ELISA。
[0014]因此，最小限度样品处理的快来速检测PVL，PVP2a与金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)的方法和装置，同时确保准确和可靠的结果，这个需求持续存在。一个简单，快速的检测可以促进在初级和二级保健机构对PVL相关疾病的诊断，并确定该菌株是否耐甲氧西林。快速检测节省时间，因为来自参考实验室的结果往往需要数天或数周。从PVL阴性MRSA菌株中区分PVL阳性的MASA菌株的测试可能最终对患者造成更大的治疗益处，有助于在医院内预防前者的传播。另外，从PBP2a阴性MRSA菌株中区分PBP2a阳性MRSA菌株的测试可能最终对患者造成更大的治疗益处，有助于在医院内预防前者的传播。
【发明内容】
[0015]本发明提供了用于检测生物分子如生物样品中的PVL，PBP2a和SPV的横向流动动测定。该测定包括利用噬菌体展示技术培育针对金黄色葡萄球菌的PVL，PBP2a和SPA的重组抗体。
[0016]在一些实施例中，生物样品是培养物，液体培养物，伤口拭子，鼻拭子，或在兽医学中，伤口或乳房拭子。在实施例中，初代培养物是采自感染的患者，例如可能由多种病原体引起的疖病和脓肿。
[0017]本发明上述的摘要不意味着限制，从接下去的详细描述以及权利要求中将会明显体现本发明的其他特征和优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1A是一个表格，所述数据来自本发明的一些【具体实施方式】中的毒素抗体测定，显示了代表菌株体外产生PVL的浓度。
[0019]图1B是一个图，所述数据来自本发明的毒素抗体测定实施例，显示了代表菌株体外产生PVL的浓度。
[0020]图2是一个表格，其所述数据来自本发明毒素抗体测定实施例，来说明产生不同浓度毒素的不同菌株被确认。
[0021]图3是一个表格，其所述数据来自本发明毒素抗体测定实施例。描述了一个矩阵用于序列测定，来确定抗体的最优组合。0，无反应；(+)到+++，活性从弱到强。
[0022]图4是一个图形，显示了本发明的一个实施例(PVL-1401)中抗体的DNA和蛋白质序列信息。
[0023]图5是一个图形，显示了本发明的一个实施例(PVL-1841)中抗体的DNA和蛋白质序列信息。
[0024]图6是一个图形，显示了本发明的一个实施例(PVL-1321)中抗体的DNA和蛋白质序列信息。
[0025]图7是一个图形，显示了本发明的一个实施例中使用Binax卡片形式来测定的过程。
[0026]图8A的表格中描述数据来自本发明的毒素抗体测定实施例，说明产生不同浓度的毒素的不同菌株已经被确认。
[0027]图SB表格中描述数据来自本发明的毒素抗体测定实施例，说明产生不同浓度的毒素的不同菌株已经被确认。
[0028]图9是一个表格，所述数据来自本发明的毒素抗体测定实施例，来说明不同的固体培养基可以被使用。
[0029]图10是一个表格，所述数据来自本发明的毒素抗体测定实施例，来说明不同的液体培养基可以被使用。
[0030]图11的表格表示数据来自本发明的毒素抗体测定实施例。通过测定588个临床分离物和12个参考菌株，同时平行的用分子手段(DNA芯片)定性，获得敏感性，特异性，阳性和阴性预测值。
[0031]图12A列出了菌株和克隆物，并从复合物中鉴定PVL阳性的菌株，来开发本发明实施例中的毒素抗体测定。
[0032]图12B列出了菌株和克隆物，并从复合物中鉴定PVL阳性的菌株，来开发本发明实施例中的毒素抗体测定。
[0033]图13是一个表格，所示数据是来自几个国家的临床分离菌株的初步试验。
[0034]图14的表格表示通过位点研究获得的PVL阴性MSSA，PVL阴性MRSA，PVL阳性MSSA和PVL阳性MRSA的概率。
[0035]详细描述
[0036]本发明提供的装置和方法用于确定样品中被分析物的存在或存在数量。在一个实施例中，本发明提供检测细菌生物分子或毒素的设备和方法，例如生物样品中的金黄色葡萄球菌的PVL或PVP2a。在一个实施例中，样品是来自患者的生物样品。
[0037]用PCR产物来构建一个HisTaq-PVL融合质粒，该PCR产物包括来自已经过测序的参考菌株MW2/USA400中，PVL和IukF-PV两个组分中的一个组分的完整开放读码框。纯的IukF-PV融合蛋白被合成，分离和纯化。将纯化的材料作为抗原用于初次免疫，随后通过特定的噬菌体展示技术产生抗体。用不同的技术，天然和重组PV被用来进行噬菌体展示技术。类似的方法被用于开发PVP2a和SPA的抗体。
[0038]噬菌体展示抗体通过ELISA法初步定性，不同稀释物在微量管/带式蛋白质微芯片中被识别(ArrayTube?(AT)或ArrayStrip?(AS)的平台，由美艾利尔(Alere)技术有限公司开发)。捕获和检测抗体之间的所有可能组合都用微芯片来检测，从而发现在已知浓度的重组和天然毒素制剂的特定条件下的最特异，最敏感的抗体对。因此，对这些抗体的每一种可能的组合进行了测定，并且对PVL，SPA或PBP2a具有最高的灵敏度和特异性的抗体对进行鉴定。
[0039]针对重组生物分子产生的噬菌体展示抗体进行活性筛选，不仅只针对HisTaq融合蛋白，也针对生物分子的原始形式。微芯片分析结果表明，重组抗体能识别原始生物分子。然后这些抗体被用于开发横向流动动测定，以检测包括PVL，SPA和PBP2a的生物分子。通过一系列毒素稀释物，横向流的检测极限大约是在I纳克/毫升的数量级(见下文)。固定在微芯片上的抗体被用于评估金黄色葡萄球菌临床分离物的生物分子产物。一般来说，在相同培养条件下克隆物从属关系和外毒素产量间有一定的相关性。
[0040]收集的USA300临床分离物(ST8MRSA-1V，平均产生约4000纳克/毫升PVL，F组分)，昆士兰克隆(ST93-MRSA-1V，约 5000 纳克 / 毫升)，ST93-MSSA(ca.6，500 纳克 / 毫升)和ST59-MRSA-VT (约3，000纳克/毫升)显然平均产生比其他PVL阳性MRSA或MSSA菌株更多的PVL，例如ST80-MRSA-1V (ca.250纳克/毫升)，和CC5-MSSA (ca.750纳克/毫升)。这些实验证明，任何测试的菌株产生PVL产量的浓度明显高于所选的抗体组合的检测极限。
[0041]在一个实施例中，在检测设备中使用的抗体是PVL，SPA或PBP2a特异的重组噬菌体展示的抗体。在实施例中，在检测设备中使用的抗体是下列抗体克隆中的一个或多个=PVL-1031, PVL-1061, PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771，PVL-1841, PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10,PBP2a-17C8, PBP2a_19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a_pc_2.1, PBP2a_pc_2.2，SPA-A135,and SPA-4412.
[0042]在实施例中，抗体对包括抗体克隆PVL-1841，其可以与金颗粒轭合，抗体对也包括抗体克隆PVL-1401，它可以被固定，例如，在硝酸纤维素膜上作为捕获抗体。在其他实施例中，抗体对包括抗体克隆PVL-1841，其可以与金颗粒轭合，它也包括抗体克隆PVL-1321和抗体克隆PVL-1401作为捕获抗体被固定在，例如硝酸纤维素膜上。抗体克隆PVL-1321检测人的PVL，而抗体克隆PVL-1401检测人的PVL以及与牛乳腺炎的发病有关的牛变种(lukF-P83)。
[0043]在一个实施例中，在基础微生物实验室的条件下化验可以被用于检测金黄色葡萄球菌培养物中的生物分子。在一些实施方案中，使用的基本设备来执行化验，例如接种环，培养基，培养箱，和在细菌学和生物安全中的基本知识。本发明允许快速检测PVL，PBP2a和SPA,例如，直接对过夜细菌培养物进行化验，无需使用专门的设备，例如热循环仪，不需要生物分子的变型，例如通过加热，不需要专业分子生物学技术知识，如，核酸扩增。
[0044]在实施例中，用从患者皮肤和软组织感染中得到的拭子来执行化验，拭子样品可以在固体培养基上进行过夜初培养，金黄色葡萄球菌克隆在初培养中被鉴定并检测PVL，PBP2a和/或SPA的存在。在混合培养物或具有皮肤植物区系污染物的情况下，通过标准实验程序分离金黄色葡萄球菌进行二次培养。无论在初次或者二次培养中的生物分子都用试验设备检测，例如横向流动试纸，卡或试剂盒。
[0045]各种各样的检测设备可用于检测生物样品中生物分子的存在或不存在。在一个实施例中，测试装置可以是一种免疫测定装置，诸如横向流测试条，其被广泛用于测试各种分析物。然而，任何适宜的化验装置可以在本发明中被使用。
[0046]在一个实施例中，也可使用折叠卡片形式化验装置，例如霍华德钱德勒的美国专利号5468648(这里完整的引用在参考文献中)所述的装置。在另一个实施方案中，可使用带盒式测定装置。通过本发明中所述的测试装置对各种分析物进行检测或定量。该被分析物可以是传染性病原体。
[0047]测试试纸可被用于多种形式，如免疫或化学检测形式，用于检测样品中的目的被分析物。在特异结合化验中，如免疫测定法，浸溃试剂测试条的使用，是众所周知的(见，例如，May等的美国专利号5622871，完整的被引用在参考文献中)。测试条也可配置在非竞争性或竞争性测定形式中。在一些形式中，具有样品应用区，试剂区，和测试结果区的测试试纸条具有吸水材料。样品被施加到样品应用区并通过毛细管作用流入试剂区。
[0048]在试剂区，样品溶解并与检测被分析物(如果存在)必需的试剂混合。现在样品承载着试剂，继续流至测试结果区域中。另外一些试剂被固定在测试结果区域中，诸如与被分析物特异结合的分子。这些试剂与被分析物(如果存在的话)或者来自试剂区的第一试剂中的一种反应，结合。用来提供可检测的信号的标记存在于试剂区域中，或者在一个单独的标记区域。
[0049]一般，在非竞争性形式中，如果样品中含有被分析物则产生信号，如果不存在被分析物则没有信号产生。在竞争形式中，没有被分析物存在时产生信号，如果被分析物存在则没有信号产生。
[0050]在被分析物通过信号产生系统被检测的实施例中，例如通过与被分析物特异性反应的一种或多种酶，信号产生系统的一个或多个组件可以与测试条材料上的被分析物检测区绑定，绑定的方式与上述的特异结合成分与检测试纸条材料的相同。可替代的或附加的，包括在样品应用区，试剂区，或测试条的分析物检测区的信号产生系统的组成部分，或者被包括在整个测试条中的部分，可被浸溃到测试条的一种或多种材料中。可以通过这些组分溶液的表面处理，或通过一个或多个测试条材料浸没入这些组分溶液来实现。一个或多个表面处理或一个或多个浸没之后，测试条材料被干燥。可替代的或附加的，包括在样品应用区，试剂区，或测试条的被分析物检测区的信号产生系统的组分，或包含在整个测试条中的组分，可被应用到一个或多个测试条的测试条材料的表面，如同标记试剂一样。
[0051]使用过程中，一个取样装置，例如拭子，可用于收集生物样品，如来自患者受感染的伤口的样品。一旦样品被收集，可以在培养基中培养，或直接施加到测定装置。生物样品可以在应用到测定装置之前，先在固体或液体培养基中培养一段时间，下面的例子中有进一步描述。该样品被施加到一个测定装置以确定目的被分析物的存在或存在浓度。在实施例中，测定可用于单独检测金黄色葡萄球菌PVL、金黄色葡萄球菌PBP2a、SPA的存在，不存在，或存在浓度，或者用于检测它们的任意组合，或包括其他相关标记组合例如，中毒性休克综合征毒素(TST1编码)，肠毒素A(entA或sea),肠毒素B(entB或seb),来自
S.pseuintermedius, S.1ntermedius,或 S delphinii 的杀白细胞毒素，α 毒素(α -溶血素，HLA)或β-溶血素(HLB)。在其它实施例中，上述的方法和装置可用于检测来源于动物样品的金黄色葡萄球菌或其毒素。例如，在反刍动物的各种物种中，包括，金黄色葡萄球菌克隆物CC151和479占主导地位，它们是引起牛乳腺炎的常见原因。显然，大多数牛菌株携带杀白细胞素基因lukM/lukF-P83，它可以作为偶然在人菌株间传播的牛群流行菌株变异的一个标记。
[0052]如本文中所讨论的，本发明提供了抗体，或能特异结合PVL毒素的功能性结合片段。所述抗体或抗体片段不需要预处理就能够特异性结合生物分子，例如，通过生物分子的变性。在一个实施例中，抗体或它的功能性结合片段，其特异性结合下面的一个或多个基因的表达产物:LUKS-PV，IukF-PV, IukM, lukF_P83，mecA和spa。例如，本发明的抗体可以是对 LUKS-PV 的 T 细胞表位具有特异性的抗体:N16OTISEVERQNSKSVQWGIKANSFIT193 (Brown,et al., Open J.1mmunol.，2 (3): 111-115 (2012))。
[0053]在一个实施例中，本发明的抗体包括克隆PVL-1031，PVL-1061, PVL-1101,PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-1881,PBP2a-1631, PBP2a_1721， PBP2a_1941， PBP2a_6G10， PBP2a_17A10， PBP2a_17C8，PBP2a-19Bl,PBP2a-8A5,PBP2a_9C6，PBP2a-PC_2.1，PBP2a-PC_2.2，SPA-A135 和 SPA-4412。然而，本领域技术人员应当理解，相同或基本相同的抗体可通过本领域已知的很多方法产生。
[0054]特别地，对本文演示的PVL具有亲和力的抗体可被鉴定，例如，通过使用公开抗体的竞争化验法，特别是那些对PVL具有高亲和力的公开抗体即，PVL-1321，PVL-1401和PVL-1841 ο抗体也可以是共享PVL表位结合区域的那些抗体。在这方面，这些领域的技术人员将熟悉那些识别抗体中结合区域的技术，包括但不限于Whitelegg和Rees, Marcatili,和 Sivasubramanian 所公开的模式技术(Protein Engineeringl3 (12):819 - 824 (2000)；MarcatiIi, et al.B1informatics, 24(17):1953 - 1954 (2008) ；and Sivasubramanian, etal..Proteins, 74(2):497 - 514(2009))。
[0055]如本文所用，术语“抗体”广义上包括多克隆和单克隆抗体，以及这些抗体的功能性结合片段。在本发明中有用的抗体，或它的功能性结合片段的特征在于，例如，对PVL毒素的表位具有特异性结合活性。
[0056]就抗体而言，使用的术语“特异性结合”或“特异性结合活性”是指抗体的互作，或其功能性结合片段，与特定表位的相互作用具有一个解离常数，至少约为IX1-6, 一般至少约I X 10_7，通常至少约I X 10_8，和特别地至少约I X 10_9或I X 10,或更小。就此而言，保留了与PVL的表位特异性结合的抗体的Fab，F(AB’)2，Fd和Fv片段被包括在抗体的定义内。
[0057]此外，本文所用的术语“抗体”包括天然存在的抗体以及非天然存在的抗体，包括，例如，单链抗体，嵌合抗体，双功能和人源化抗体，以及它的抗原结合片段。
[0058]在不同实施例中，PVL, PBP2a和/或SPA的检测可以组合一种或多种另外的被分析物。例如，本发明采用的方法和装置可适于检测一个或多个肠毒素A(ent A)的，肠毒素B(ent B),毒素休克综合症毒素(tstl), α毒素，α溶血素(HLA), β溶血素(HLB),和葡萄球菌激酶(SAK)。
[0059]下列实例被用来进一步说明本发明的实施例，但不意味着限制本发明的范围。虽然这些实例是使用实例中的典范，也可以选择使用本领域技术人员已知的其它程序，方法或技术。
[0060]实施例子
[0061]毒素抗体分析
[0062]图1A和IB显示了 PVL的浓度和许多金黄色葡萄球菌菌株(包括MRSA和MSSA)的克隆物的从属关系。
[0063]实施例子I
[0064]培养参数
抬养参数
[0065]-；--
培养基 Kiito&Noda$M!培养基
培养时闻謂小时
[0066]以前鉴定的产PVL的金黄色葡萄球菌(产量高水平的，低水平的生产菌株和牛的变体)生长在Kato&Noda肉汤培养基中过夜培养产生PVL。培养物上清液用横向流测定法检测(试纸片形式)。如图2所示，与微芯片测定的结果几乎完全一致。在金黄色葡萄球菌菌株NCTC8235上观察到微弱的假阳性结果
[0067]实施例子2
[0068]培养参数
培养参数
接种物^来η冷库的--个珠子
[_9]培养堪Kato&Noda_il^il 养描
培养吋则.......................................................................................2小时...........................................................................
[0070]以前鉴定的产PVL的金黄色葡萄球菌(产量高水平的，低水平的生产菌株和牛的变体)在Kato&Noda肉汤培养基中培养2小时用于检测，用横向流PVL试纸检测PVL的产量。结果与微芯片测定的结果几乎完全一致。
[0071]实施例子3
[0072]培养参数...........................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................mmmm..............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
[0073]小 BtJIf )
WWm五琼脂培养镇坊养时_18?24小时
[0074]以前鉴定的产PVL的金黄色葡萄球菌(高水平的生产菌株，低水平的生产菌株和牛菌株变体，lukM/lukF-P83)被接种到血琼脂平板上过夜培养，从过夜琼脂平板上分离的克隆被直接检测PVL的产量。结果与微芯片测定的结果几乎完全一致。
[0075]实施例子4
[0076]培养参数
培养参数
丽物I 过夜培养物，来A图5中指定的各种生K培养
[0077]培养基--------系列固体生K培养基(琼脂)
抬养时间18-24小时
[0078]以前鉴定的产PVL的金黄色葡萄球菌菌株(PVL阳性ST8-MRSA-1V USA300和ST22-MRSA-1V)在不同的固体培养基上过夜培养后被直接检测PVL的产量。从过夜琼脂平板上分离的克隆被直接用于横向流PVL测定(试纸形式)。所有的固体培养基都是阳性结果O
[0079]实施例子5A
[0080]培养参数
培养参数1..........................1iiS..............................................................来__「__1冷__雨的_:________:不■种环..................................
[0081]培.J1I
[0082]以前鉴定的产PVL的金黄色葡萄球菌菌株(很多不同克隆物)用MRSA ID显色琼脂(B1Merieux)过夜培养后在平板上被直接检测PVL的产量。从过夜琼脂平板上分离的克隆被直接用于横向流PVL测定(试纸形式)。所有克隆物都是阳性结果。
[0083]实施例子5B
[0084]培养参数培养基B1Mferieiix MRSA 1011色.?
[0085]---------------------------------------------—
样品勘备/l:Staphylype_AI缓冲液中的-'
个接种环培养时间24小时
[0086]以前鉴定的PVL阴性的金黄色葡萄球菌菌株(很多不同克隆的复合物)用MRSAID显色琼脂(B1Merieux)过夜培养后在平板上被直接检测PVL的产量。从过夜琼脂平板上分离的克隆被直接用于横向流动PVL测定(试纸形式)。其结果与以不同克隆物为阴性对照的微芯片的结果几乎完全一致。
[0087]实施例子6
[0088]金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923 (从文化的加藤和野田肉汤上清中纯化)产生的一系列PVL毒素稀释物被用来确定试纸检测形式的检测极限。抗原浓度为10微克/毫升。按手册中所描述的，不同稀释物(终浓度)被施加并应用到横向流动PVL检测(试纸片形式)中。作为参考，用蛋白质芯片(ArrayStripTM)的检出极限被确定为约0.5毫微克/毫升。
[0089]
加入200 μ I试剂A后的终浓度
33.3ng/mL
10ng/mL
Ing/mL
0.1ng/mL
0.0lng/mL
0.0Olng/mL
检测极限被确定为?I纳克/毫升。~
[0090]实施例子7
[0091]来自金黄色葡萄球菌菌株ATCC25923上清液的未纯化的PVL毒素用来确定横向流PVL测定(浸溃片形式)受Kato和Noda培养基的所有组分影响的检测极限。不同稀释物(终浓度)如手册上描述的那样被施加并应用到横向流PVL测定(浸溃片形式)上。检测的检出限被确定为约I纳克/毫升。这些结果与实施例6相结合表明Kato&Noda肉汤培养基的组分似乎不影响测定的检出极限。
[0092]
PVL浓度(ArrayStrip?检测)?I5微克/毫升
ToxArray?的检测极限是约1.5纳克/毫升
200微升试剂A的终浓度，用I倍的PBS稀释。
33.3ng/mL
16.7ng/mL
3.33ng/mL
1.67ng/mL
0.33ng/mL
0.033ng/mL
检测极限被确定为约I纳克/毫升
[0093]实施例子8
[0094]通过凝固酶阴性的葡萄球菌(CNS)菌株作为阴性对照来确定横向流PVL测定的特异性。在Columbia血琼脂上和Kato&Noda肉汤培养基中过夜培养一批CNS菌株。从Columbia血琼脂以及Kato&Noda上清液直接分离的菌落用横向流PVL测定(浸溃片形式)进行检测
[0095]生长在Columbia血琼脂上的所有CNS菌株的PVL检测结果呈阴性。当CNS菌株在Kato&Noda中生长，那些在人体中经常被发现的CNS菌株的小种，其PVL检测结果呈阴性。
[0096]实施例子9
[0097]此前鉴定的包括高产PVL和低产PVL的金黄色葡萄球菌株，PVL阴性的菌株和产生假阳性结果的菌株(NCTC8325)，在Kato&Noda肉汤培养基中生长后，分别划线接种到Columbia血琼脂上过夜培养。分离的克隆在葡萄糖肉汤和脑心浸剂肉汤中过夜再培养。每个生长培养基的样品上清液直接用横向流PVL检测(试纸形式)PVL的产量。
[0098]PVL阴性菌株在两种培养基中仍然保持PVL阴性。在Kato&Noda肉汤培养基中呈假阳性的菌株在两种培养基中PVL是阴性。用两种培养基培养高产和低产PVL的菌株的横向流PVL检测是阳性。
[0099]实施例子10
[0100]以前鉴定的金黄色葡萄球菌(冷冻库存珠子)，包括高产PVL和低产PVL的菌株，划线接种到哥伦比亚血琼脂过夜。分离的克隆在葡萄糖肉汤与增加了人体血液或Fe++的葡萄糖肉汤培养基中过夜再培养。同样的，分离的菌落在Schaedler液体肉汤培养基与增加了人体血液或Fe++的Schaedler肉汤培养基过夜再培养。每种生长培养基的上清液样品直接用横向流PVL检测(试纸形式)PVL的产量。无论是培养基平板还是添加有Fe++的培养基都无PVL产生。然而，添加了人血到两种培养基中的任意一种都导致PVL的表达
[0101]实施例子11
[0102]设计一个研究来确定是否鼻腔样品中的正常细菌群落和分泌物会干扰横向流PVL的检测。具体地说，使用Puritan25-3316鼻拭子从具有阳性和阴性的金黄色葡萄球菌的患者上收集鼻样品。以前鉴定的金黄色葡萄球菌菌株加标后(?15CFU)直接进入鼻腔样品。用该拭子样品接种Kato&Noda液体培养基并培养过夜。用横向流PVL测定(试纸片形式)检测培养基中的PVL。正常鼻腔菌群并不干预PVL的检测。该实验结果表明，该试验具有筛选鼻腔样品的潜力，并且这些样品可被培养并用来检测PVL。
[0103]实施例子12
[0104]为了评估在常规实验室条件下使用的潜力，不同的接种时间和生长培养基被检测。
[0105]金黄色葡萄球菌用下列液体培养基中的一种在36°C摇床上生长3-12小时:葡萄糖肉汤，脑心浸液，或Kato和Noda培养基。用横向流PVL测定(试纸片形式)过夜培养物中PVL的产量。测定按照提供的手册进行。200微升检测试剂移入含有测定轭合物沉淀的反应管中。涡旋管子直到测定轭合物(紫色沉淀)被悬浮。加入100微升过夜培养物并晃动管子。试纸插入含有检测试剂和培养物样品的反应管中。10分钟后结果可被读取。观察到两个条带或线(检测与对照)被视为阳性结果。仅观察到对照线被认为是阴性结果。
[0106]可选择使用固体培养基，金黄色葡萄球菌在下列固体生长培养基的一种上36°C过夜生长:琼脂，Mueller Hinton 琼脂，MRSA ID? 显色培养基(B1Merieux), Columbia 血琼脂，加血的Mueller Hinton琼脂，C.A.P.琼脂和“巧克力”琼脂。生长过夜后挑取分离的克隆并重悬浮在100微升下列缓冲液中的一种:缓冲液Al (来自Alere Staphytype测定)，PBS, or TRIS/EDTA。200微升检测试剂被移入含有轭合物(紫色的沉淀)的反应管。沉淀通过涡旋重悬浮。100微升重悬浮细菌加入反应管，通过涡旋混匀。或者挑取一个接种环的菌落直接溶解在含有200微升检测试剂的反应管中。试纸片放入含有反应试剂和检测样品的反应管中。10分钟后结果可读取。观察到两个条带或线(试验与对照)被视为阳性结果。仅观察到对照线被认为是阴性结果。PVL浓度大概从1-5纳克/毫升开始，大于这个浓度可以被这个测定检测到。
[0107]实施例子13
[0108]在本实例中，从临床条件下分离的培养物被检测，该临床条件中PVL占合理的比例。分离物来自下面的条件:皮肤脓肿，“蜘蛛咬伤”病变(尤其是慢性/复发)，疖病(“疔疮”)，痈，脓肿形成乳腺炎，蜂窝组织炎，以及不寻常的或严重的皮肤及软组织感染，如热带性脓皮病或坏死性筋膜炎。分别对金黄色葡萄球菌进行鉴定和药敏试验，以及通过分子手段检测PVL基因并分配到克隆物和菌株。
[0109]231个金黄色葡萄球菌分离物被检测的，其来自美国、欧洲、澳大利亚、非洲和中东。属于26个不同金黄色葡萄球菌菌种的123个分离物为PVL阳性。属于33个金黄色葡萄球菌菌种的108个分离物是PVL阴性。
[0110]横向流PVL测定(试纸片形式)产生的结果如下列表I所示(包括重复试验)。
[0111]表1:横向流PVL测定(试纸片形式)结果
[0112]
真阳性结果j 124
真阴性结果1108
假阳性结果i
假阴性结果b
灵敏性 100%
特异性 98.18%
阳性预测值98.41%
阴性预测值 100%
[0113]横向流PVL测定(卡片形式)产生的结果如下列表2所示(包括重复试验)。
[0114]表2:横向流PVL测定(卡片形式)结果
[0115]
真阳性结果|23
真阴性结果假阳性结果i
假阴性结果0
灵敏性 100%
特异性 88.89%
阳性预测值79.31%
阴性预测值100%
[0116]实施例子14
[0117]一项涉及快速检测金黄色葡萄球菌培养物中的PVL的研究被执行，该研究使用单克隆抗体的横向流测定。研究的目的是为了评估检测PVL的横向流测定。
[0118]如这里所述，PVL是金黄色葡萄球菌噬菌体源的致病因子。它包含2个部件(S和F组分)，由2个虽然共定位、共表达，但独立的基因编码。这些分子的聚合物在人类白血球膜上形成孔导致细胞死亡。PVL与慢性/复发性皮肤和软组织感染(SSTI)有关，尤其是在年轻人和以前健康的成年人中，和坏死性肺炎。由于其临床相关性，携带PVL基因的金黄色葡萄球菌的检测具有积极治疗和感染控制措施(见万维网hpa.0rg.uk/webc/HPAwebFiIe/HPAweb_C/1218699411960)o然而，因为PVL检测是用分子的方法进行，目前该检测基本上限制于参照中心和专业实验室。为了促进快速，非分子的检测在临床实验室中的应用，单克隆抗体被培育，横向流测定被开发。
[0119]通过噬菌体展示法过量表达的PVL，F组分被用于产生单克隆抗体。接下去免疫小鼠，分离B细胞的mRNA并扩增。得到对抗体的抗原结合部分特异的cDNA，连接入噬菌体，然后转化到大肠杆菌中。得到纯化的抗体，通过ELISA初步定性，不同稀释物在microtiterstrip-mounted蛋白质芯片上显迹。这样可以快速地确定捕捉和检测抗体的最佳组合。这些抗体被用来设计横向流动测定如，免疫层析测定，在该测定中金标检测抗体与样品材料(金黄色葡萄球菌培养物)混合，通过毛细作用向固定了检测抗体的区域流动。在阳性情况下，可观察到一个明显的线形成。制作两种不同的测定形式(试纸和Binax卡)平行处理来优化操作过程和和条款。这个试验被用于来自皮肤和软组织感染的金黄色葡萄球菌分离物，平行的，分离物通过芯片杂交测定基因型，来确定菌株和克隆物的从属关系以及它们的PVL状态
[0120]图7描述了 Binax卡片形式的检测过程。对于试纸片形式，用接种环挑取培养物并搅拌放入含有标记抗体缓冲液的管子中。然后，试纸片放入管子中，10分钟后结果可读取。
[0121]为了选择捕捉和标记抗体的最优组合，每一种抗体的4种不同浓度在蛋白芯片上显迹。这些芯片用重组PVL的F组分，原始PVL(2种不同浓度，来自菌株ATCC25923)或来自兽医CC705分离物的“牛杀白细胞素”lukM/lukF-P83以及所有抗体的所有生物素标记的制备物来检测。根据这些结果，抗体5和抗体10的组合物被选定来建立检测PVL(F组分)以及lukF-P83基因产物的横向流测定。
[0122]在最初的一系列的实验中，检测在不同的生长培养基中培养的已知菌株。如Kato&Noda或Schaedler描述的,在肉汤中，在脑心浸液中以及从普通琼脂挑取的克隆材料中，具有或不具有血液的Mueller Hinton琼脂中，MRSA ID琼月旨(B1Merieux), Columbia血，C.A.P.和“巧克力”琼脂中被注意到有可检测的PVL产量。在葡萄糖肉汤上偶尔观察到假阴性结果，以及来自Kato&Noda肉汤或血琼脂的克隆物CC8菌株的假阳性结果。这些横向流测定用于筛选来自SSTI诊断标本中的共计450个临床分离物。这些菌株源于澳大利亚，特立尼达和多巴哥，美国，英国，德国，瑞典，西班牙，挪威，日本，乌干达和沙特阿拉伯。258株被证明是阳性。它们所属的分离物属于20个克隆物的37个不同的菌株。已检测了192PVL阴性分离物属于29克隆物的47个不同的菌株。PVL阳性分离物的比例在被检测的全部SST I分离物中占10.5% (瑞典样品)到81.4% (澳大利亚样品)。
[0123]该检测允许PVL快速检测在不能够进行分子检测的常规细菌学实验室条件下进行。因为它利用标准培养基的过夜纯培养(包括显色琼脂筛选MRSA)，可以很容易地与这样的实验室的工作流程相结合。因此，预计将有助于及时干预治疗PVL相关感染病例，以及帮助选取一些分离物递交参考中心进一步分型。
[0124]实施例子15
[0125]用筛选测定对使用PBP2a结合抗体的PBP2a检测进行评估，PBP2a结合抗体通过这里所讨论的噬菌体展示技术产生。一系列来自金黄色葡萄球菌USA300的稀释过的PBP2a被用于检测评估。很多克隆物(数据未显示)具有阳性结果。
[0126]实施例子16
[0127]此前鉴定的金黄色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本发明的抗体检测PBP2a和SPA产量。很多克隆物(数据未显示)具有阳性结果。
[0128]实施例子17
[0129]此前鉴定的金黄色葡萄球菌(很多不同的克隆物)用本发明的抗体检测PVL，PBP2a和SPA产量。很多克隆物(数据未显示)具有阳性结果。
[0130]实施例子18
[0131]这个实例描述了横向流检测法的发展，使用这里所述的单克隆抗体在常规临床微生物实验室建立快速，非分子的PVL检测。该测定对生长在各种不同培养基的分离物进行了验证，然后利用从SSTI重新获得的国际金黄色葡萄球菌对检测进行评估。
[0132]为了开发快速的表型测定，通过噬菌体展示法，重组PVL的F组分被用于产生单克隆抗体。在蛋白芯片上显迹，用不同的IukF制备物和测定抗体筛选这些抗体。这样就鉴定出了用于建立横向流测定的最优抗体组合。这个试验被用来检测金黄色葡萄球菌培养物中的PVL。对纯化的天然和重组抗原的检测极限被确定为约I纳克/毫升。各种固体和液体培养基的过夜培养物都适用于PVL检测。
[0133]600个被测定的菌株和临床分离物来自美国、欧洲、澳大利亚，非洲和中东的患者。平行的分离物通过DNA芯片杂交确定基因型来证实PVL类型并被转移到克隆表达中。这个试验中测定的灵敏性，特异性，阳性和阴性预测值分别是99.7%，98.3%，98.4%和99.7%。302个临床分离物和参考菌株是PVL阳性并被归属到21个不同的克隆物。
[0134]总的来说，横向流检测允许在常规细菌学实验室进行快速的经济的PVL检测。因为检测利用标准培养基的培养物，不需要高级设备，可以简单的整合到实验室的工作流程中，有助于及时治疗PVL相关感染病例。
[0135]下面为所用的材料和方法
[0136]重组PVL，F组分
[0137]PVL F组分基因(IukF-PV)用在5’和3’端包含一个EcoRl酶切位点和Notl酶切位点的设计引物(lukF-PV_fw_5Eco, CCTGAATTCATGAAAAAAATAGTCAAATC(SEQ ID NO: 13)和lukF-PV_rev_5Not, ATAGCGGCCGCTTAGCTCATAGGATTTT(SEQ ID NO:14))进行扩增。来自全测序ST1-MRSA-1V参考菌株丽2的DNA作为模板。PCR产物被克隆到一个市售载体(Τ0Ρ0
II,Invitrogen, Karlsruhe,德国)上并测序。得到的序列与GenBank登记的相应序列比较(BA000033.2 ； 1529381:153035)。确认的克隆用EcoRl/Notl酶切，包含开放性读码框的DNA片段被插入pet28a表达载体(Novagen, Darmstadt,德国)连接后，表达载体转化入大肠杆菌BL21.用50毫升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1毫摩尔)诱导后，在50毫升LB培养基中(LB培养基，添加了卡那霉素)获得表达重组蛋白。离心收集大肠杆菌细胞并冰冻过夜。表达重组蛋白在镍-次氮基三乙酸-琼脂糖(N1-NTA-琼脂糖)柱(Qiagen, Hamburg,德国)上按照生产商家的说明书纯化。每个步骤取出部分试样通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析重组蛋白的存在。每一个样品中的蛋白质浓度用二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(Pierce公司，波恩,德国)测定。
[0138]噬菌体展示过程和抗体的初测定
[0139]通过噬菌体展示法过表达的PVL F组分被用于产生单克隆抗体。接下去免疫小鼠，分离扩增B-细胞的mRNA。获得对抗体的抗原结合部分特异的cDNA，被连入噬菌体，并转化到大肠杆菌。获得的抗体被纯化，通过ELISA初鉴定，不同的稀释物在microtiterstrip-mounted 蛋白芯片显迹。
[0140]根据此前描述的手册使用抗体芯片。
[0141]为了选择捕捉和标记抗体的最优组合，每一个选定的11种抗体中的5个不同浓度被点样到蛋白芯片上。为了测定所有可能的组合，这些芯片用重组PVL F组分，天然的PVL (2种不同浓度，来自CC30-MSSA菌株ATCC25923)或“牛杀白细胞素”lukM/lukF_P83 (来自兽用CC151/705分离物)作为抗原，以及用生物素标记的所有11种抗体的制备物作为检测抗体来测定。然后通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶轭合物和通过过氧化物酶引发的染料沉淀来进行染色。
[0142]这个途径能确定捕捉检测抗体的最优组合(见图3).
[0143]横向流测定PVL的原理
[0144]检测金黄色葡萄球菌初代培养中PVL的横向流测定是免疫层析膜测定，该测定用上述芯片选定的2个高灵敏性的噬菌体展示重组单克隆抗体。针对PVL的2个选定抗体被用于设计横向流测定，其中一个抗体在检测试纸上作为捕获抗原，而第二种抗体在反应管内被金标记并包被。测定试纸由固定在膜支撑物上的PVL捕获抗体和对照蛋白组成，加样品和吸收剂后形成两条明显的线。T执行检测时，金黄色葡萄球菌分离物或培养物上清液被加到包被的反应管中，反应管含有与已添加的萃取剂共轭的金标。然后PVL检测试纸条被放入反应管支持液体样品和轭合物。10分钟后根据粉色到紫色样品线的存在或不存在对检测的结果进行解释。两条带(PVL线和对照线)说明是有效的阳性结果，而一条线(对照线)说明有效的阴性结果。没有明显的对照线说明这是无效的检测。
[0145]测定的执行
[0146]对来自SSTI (见下文)的金黄色葡萄球菌的分离物进行检测，该菌通过芯片杂交检测基因型来确定菌株和克隆物的从属关系和PVL状态。280微升萃取剂被特异的加入含有冻干抗体-金轭合物的包被反应管内。挑取一个接种环的金黄色葡萄球菌克隆材料，放入管子，用接种环彻底混合直到细胞和轭合物沉淀全部溶解。使用液体培养基时，200微升缓冲液和100微升过夜液体培养物被加入反应管并混合。然后检测试纸被插入反应管，在室温下培养10分钟后，检测试纸离开管子并进行读取。
[0147]菌株和分离物
[0148]检测共计600个金黄色葡萄球菌菌株和分离物的IukF-PV产量，同时包括甲氧西林敏感(MSSA)和抗加氧西林(MRSA)的金黄色葡萄球菌。
[0149]PVL 阴性参考菌株是 Sanger MSSA476(测过序的 STl-MSSA-SCC/us, GenBank 检索号 BX571857.1)，Mu50 和 N315 (同时测过序的 ST5-MRSA-1I，GenBank BA000017.4 和ΒΑ000018.3)，NCTC8325(测过序的 ST8-MSSA, GenBank CP000253.1)，COL (测过序的 CC8/ST250-MRSA-1, GenBank CP000046.1)以及澳大利亚(WA)MRSA_8 (ST75-MRSA-1V03-17848 ;(23))和 WA-MRSA-59 (具有非典型 SCCmec 元件的 CC12-MRSA)。
[0150]PVL 阳性参考菌株是 MW2-USA400 (测过序的 STl-MRSA-1V, GenBankBA000033.2)，USA300-FPR3757 (测过序的 ST8-MRSA-1 V，GenBankCP000255.1)，ATCC25923 (以质量控制为目的广泛用于诊断生物学的著名分离物ST30-MSSA),昆士兰 caMRSA(ST93-MRSA-1V03-16790)和 WA-MRSA-60/ 孟加拉海湾caMRSA(ST772-MRSA-V)。
[0151]另外，包括从具有SSTI的患者上收集到的588个临床分离物。
[0152]源自澳大利亚的临床分离物(作为全国性的澳大利亚集团金黄色葡萄球菌的耐药性监测项目SAP2008and SAP2010的部分)可在万维网www.agar group, org/files/FED% 20REP0RT% 20SAP2008% 20MRSA% 20final.pdf 和 www.agar group.0rg/files/FED %20REP0RT% 20SAP210% 20MRSA% 20FINAL% 20shrink.pdf 上获得。
[0153]更多的临床分离物来自德国的诊断实验室(Dresden大学医院)，沙特阿拉伯(法赫德国王医学城，利雅得)，西班牙(Hospital Universitari Germans, Trias i Pujol,巴达洛纳)，瑞典(OerebiX)大学附属医院)，特立尼达和多巴哥共和国(从全国各地区医院)，乌干达(在恩德培的医学研究理事会)和英国(包括在布里斯托尔西南部的一个医院，和国家葡萄球菌参考单位，HPA，伦敦)。所有来自英格兰的分离物和来自其他国家(8个来自沙特阿拉伯，7个来自德国，3个来自澳大利亚)分离物的PVL状态是已知的。这些菌株被包括是为了最大限度地代表广泛的克隆物范围，在对来源于不同的国家的PVL进行概率分析时，这些菌株被排除在外。
[0154]另外，检测17个分离物的LukF-P83 ;包括属于家畜相关菌系CC133，CC151/705和CC479的兽医来源(牛和羊)的P83阳性分离物。这些分离物来自以前的研究或参考弗里德里希洛弗勒研究所，德国耶拿。作为对照，3个lukM/lukF-P83阴性分离物被包括:2个CC133分离物，一个来自疣鼻天鹅，一个是来自Dresden大学医院的人类分离物和来自牛的CC479分离物。没有lukF-P83阴性CC151/705分离物可用于检测。
[0155]用不同培养基验证横向流动测定
[0156]液体培养基包括葡萄糖肉汤(0X0ID，目录为Nr.CM67加葡萄糖)，脑心浸液(0X0ID, CM225)，2XTY(胰蛋白胨/酵母提取物)，Schaedler肉汤+维生素K3 (梅里埃，42106)和Kato和Noda所描述的肉汤
[0157]接下去所用的固体培养基为:普通琼脂(0X0ID，CM3),加血与不加血的MuellerHinton琼脂(0X0ID，CM337)，哥伦比亚血琼脂(琼脂主要成分0X0ID，CM331和羊血0X0ID，FSR1055)，C AP琼脂，“巧克力”琼脂(琼脂基础0X0ID, CM331和羊血0X0ID FSR1055加血晶素，赛瓦，24410，和NAD，默克，1.024542)和市售葡萄球菌MRSA显色培养基(MRSA ID琼月旨，b1Merieux, 43459)。
[0158]芯片程序
[0159]为了确认PVL状态并分配给相应的克隆物和菌株，所用分离物用DNA芯片杂交定性。根据生产商家的说明执行程序；引物、标记和进一步的细节同上所述。
[0160]酶裂解后简单的制备DNA。多重引物延伸来扩增和标记(通过混合生物素-16-dUTP)大概对应170个基因的共计333条靶序列。单链扩增产物与具有相应探针的芯片进行杂交。添加了能结合生物素标记的链霉亲和辣根过氧化物酶结合物，并用过氧化物酶-引发染料沉淀，使杂交可视化。对由此产生的芯片上的斑点图案进行扫描，分析，与此前模式菌株的参考数据相比较。在补充文件中提供了所有菌株和分离株的全杂交图。
[0161]获得下列试验结果
[0162]抗体筛选
[0163]根据图3显示的筛选结果，抗体1401(这里也指PVL-1401)和抗体1841(这里也指PVL-1841)的组合被选定来建立能检测PVL(F组分)以及lukF_P83基因产物的横向流测定。通过一些稀释，确定横向流测定对纯化的天然和重组抗原的检测极限约为I纳克/毫升。
[0164]对不同生长培养基的横向流检测试验
[0165]在最初的一系列实验中,检测在不同生长培养基上培养的已知菌株。培养PVL阴性 Mu50 (ST5-MRSA-1I)，NCTC8523 (ST8-MSSA)，ST398-MRSA-V 和 ST8-MSSA 的已知菌株以及PVL 阳性的 USA300-FPR3757 (ST8-MRSA-1V，USA300)，CC30-MSSA 和 ST93-MRSA-1V (昆士兰克隆)分离物的液体生长培养基中(葡萄糖肉汤，脑心浸液，2XTY，Schaedler, Kato&Noda)被检测。PVL阴性ST8-MSSA菌株NCTC8325在Kato&Noda所描述的生长培养基中具有微弱但一致的假阳性结果。用ST8-MSSA相同表型的临床分离菌株没有观察到相同情况。所有其他的结果是正确的。
[0166]从产生正确阳性结果的普通琼脂,无血和有血Mueller Hinton琼脂,哥伦比亚血，C.A.P和“巧克力”琼脂上挑取克隆材料(USA300-FPR3757和PVL阳性的ST22-MRSA-1V)。然后从哥伦比亚血琼脂的过夜培养菌落筛选临床分离株(见下文)。
[0167]除了前述的生长培养基，对市售的用于检测MRSA的发光培养基进行了测试(MRSAID琼脂来自梅里埃公司)。对以下的PVL阳性菌株进行了测试，并取得了正确的结果:CC1-MRSA-1V(MW2, USA400)，CC5-MRSA-1V,ST8-MRSA-1V (USA300-FPR3757)，ST22-MRSA-1V,ST30-MRSA-四(西南太平洋克隆)，ST59/ST952-MRSA-V (T)(台湾克隆)，CC80-MRSA-1V (欧洲 caMRSA 克隆)，CC88-MRSA-1V 和 CC152-MRSA-V。PVL 阴性菌株 CC1-MRSA-1V&SCC/us(WA-MRSA-1/45), ST22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/Barnim), ST45-MRSA-1V(柏林 EMRSA)，ST75-MRSA-1V (WA-MRSA-8)，ST239-MRSA-1II (维也纳 / 匈牙利 / 巴西流行株)，以及在 MRSAID琼脂上产生准确(阴性)结果的CC80-MRSA-1V的一个PVL阴性变体。
[0168]LukF_P83 的检测
[0169]14个lukF-P83阳性分离物(2个CC133，4个CC479和8个CC151)在横向流测定中产生阳性结果。3个lukF-P83阴性分离物(2个CC133和I个CC479)被正确的鉴定为阴性。
[0170]用横向流测定和芯片筛选临床分离物
[0171]与芯片的基因分型数据比较时，301个实验是真阳性，293个是真阴性；有5个假阳性，和I个假阴性。这相当于灵敏性99.7%,特异性98.3%, PPV98.4 %和NPV99.7 %。随后对这六个错误结果的实验进行重复并取得正确的结果，这说明在初级测定时操作错误。
[0172]总的来说，297个检定分离物和5个参考菌株是PVL阳性。通过芯片杂交，它们被分配到 21 个克隆物中，CCl (包括 ST772)，CC5, CC8 (包括 ST72)，CC15, CC22, CC25, CC30, CC45，CC49, CC59, CC80, CC88, CC93, CC96, CC121, CC152, CC188, CC398 和 3 个未鉴定的菌系(图13)。它们中的一个产生 1-141-1-1-128-3 的 MLST (与 STsl279/1496/1982 有关)。最常分离到的PVL阳性菌系是CC12 (来自不同区域的50个分离物，都是MSSA)，CC8 (46个分离物包括来自特立尼达岛和多巴哥岛的MSSA，以及来自各区域的“US300” )和CC93 (42个分离物，MSSA和ST93-MRSA-1V，昆士兰caMRSA克隆，几乎全部来自澳大利亚)。287个PVL阴性检测分离物和7个参考菌株属于31个不同克隆物:CC1，CC5, CC6, CC7, CC8 (包括ST72和ST239)，CC9 (ST834)，CC12, CC15, CC20, CC22, CC25, CC30 (包括 ST34)，CC45, CC50, CC59, CC75,CC80, CC88, CC96, CC97, CC101, CC121, CC140, CC188, CC398, CC425, CC509, CC707 和 CC1021.一个CC不能分派2个分离物。
[0173]阳性金黄色葡萄球菌在不同国家的流行
[0174]在所有SSTI的分离物中流行的PVL阳性分离物在不同国家之间存在广泛的变化。在澳大利亚的样品中观察到的PVL阳性率最高，有82.2% (90中的72)为PVL阳性。PVL阳性菌株的一半(74个中的37个)是CC93，并且其中大部分是MRSA (37个CC93分离物的29个，78% )，这反映了目前所谓的昆士兰caMRSA克隆所造成的负担。第2位和第3位常在澳大利亚被分离到的PVL阳性克隆是CC121-MSSA(N = 15)和CC93_MSSA(N = 8)。仅有两个ST8-MRSA-1V(USA300)菌株被鉴定。PVL阴性金黄色葡萄球菌菌株分别来自多个CC菌系，包括 CCl, CC5, CC8, CC8/ST72, CC15, CC22, CC30, CC45, CC88 和 CC188，包括两个 MRSA 克隆；ST22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/Barnim EMRSA)和 ST5-MRSA-1V (小儿克隆/WA-MRSA-65)。
[0175]来自德国的SSTI分离物中，有PVL概率是40 % (50个中20个)。最常见的菌株是 CCl21-MSSA (η = 7)和 CC30-MSSA (η = 4)。每一个 ST8-MRSA-1V (USA300)和ST93-MRSA-1V (昆士兰caMRSA克隆)分离物都被鉴定，后者与传播到澳大利亚有关。在PVL阴性之中，CC30和CC8是最常被分离到的；其他CC包括CC5，CC7, CC8/ST72, CC15, CC22, CC45,CClOl 和 CC398。 属于 CC7-MRSA-1V, CC22-MRSA-1V(UK-EMRSA-15/BarnimEMRSA)，ST5/ST225-MRSA-1I(UK-EMRSA-3/Rhine-Hesse EMRSA)和CC45-MRSA-1V (柏林EMRSA)的PVL阴性的MRSA单菌落被鉴定。
[0176]对于来自沙特阿拉伯的分离物，47.3%被证实是PVL阳性。大约一半是MRSA (η =13)，该MRSA具有属于CC80-MRSA-1V (欧洲caMRSA克隆)的最常见的PVL阳性单克隆。最常见的分离物PVL-MSSA克隆是CC30-MSSA(n = 4)和还未被鉴定的MSSA (η = 3)。PVL阴性菌株属于 CCl, CC5, CC6, CC7, CC8, CC9/ST834, CC15, CC22, CC25, CC30, CC45, CC75 (与 ST1667有关)，CC80, CC96, CC97, CC398 (ST291/813)，和一个未鉴定菌系。MRSA 的比例高(29 个 PVL阴性中8个是MRSA);最常见的菌株是ST239-MRSA-1II (维也纳/匈牙利/巴西克隆，η =4)。其他MRSA属于CC22-MRSA-1V的tstl-阳性变种，CC80-MRSA-1V的PVL阴性变种，仅知道来自马耳他(27)的 CC5-MRSA-1V&SCC/us 菌株和 CC9/ST834-MRSA-VI。
[0177]第二高的PVL概率被发现在西班牙，具有75% (44个中33个)的PVL基因和分泌LukF-PV蛋白阳性。这里最常见的克隆是ST8-MRSA-1V(USA300)的ACME阴性变种，有10个分离物被分配给该变种。接着是CC30-MSSA(n = 6)和CC22_MSSA(n = 5)。PVL阴性属于各种各样的 CC (CC5, CC8/ST72, CC15, CC30, CC45, CC121, CC188 和 CC707)，不包括任何 MRSA。
[0178]最低的PVL流行率在瑞典分离物中被发现，仅16.7% (114个中19个)是PVL阳性，都是 MSSA0 最常见的 PVL 阳性菌株是 CC30-MSSA(n = 4)和 CCl21-MSSA (η = 3)。PVL阴性分离物是 CCl, CC5, CC7, CC8, CC12, CC15, CC20, CC22, CC30, CC45, CC50, CC88, CC97, CClOI, CC121, CC188, CC509and CC1021。CC45 (η = 19)和 CC15(n= 18)是最常见的 CC 分离物。MRSA没有被发现。
[0179]在特立尼达岛和多巴哥岛共和国，PVL流行率是50% (80个中40个分离物)。最丰富的PVL阳性菌株是CC8-MSSA(n = 18)，该菌株另外携带肠毒素基因sed，sej, ser, sek和seq。两个CC8-MRSA-1V分离物被鉴定为具有相同的毒素属性，但缺乏ACME，因此与WA-MRSA-62类似。ST8-MRSA-1V (USA300)，即携带ACME位点和肠毒素基因sek和seq，在三种情况下被鉴定。其他分离到的常见的PVL阳性菌株是CC30-MSSA(n= 10)和CC5_MSSA(n=5)。PVL 阴性分离物包括 CCl, CC6, CC7, CC8, CC8/ST72, CC8/ST239, CC12, CC15, CC45, CC59，CC101, CC121, CC188 和与 CC75 (ST1223, ST1667)有关的不寻常菌株。PVL 阴性 MRSA 菌株是 CC59-MRSA-V&SCC/us 和 ST239-MRSA-1II (维也纳 / 匈牙利 / 巴西克隆)。
[0180]与来自其他国家的收集菌株相对应的，英国的分离物的PVL状态是已知的，因此其PVL率不能与其他国家的进行比较。很多不同的PVL-MRSA菌株在伦敦的分离物中被鉴定出，CC30-MRSA-1V (西南太平洋caMRSA克隆)，CC5-MRSA-1V (小儿克隆)，CC5-MRSA-V, CC80-MRSA-1V (欧洲 caMRSA 克隆)，ST59/ST952-MRSA-V (T)(台湾 caMRSA克隆)，ST772-MRSA-V (孟加拉海湾 caMRSA 克隆 /WA-MRSA-60)，ST8-MRSA-1V (USA300)和ST93-MRSA-1V(昆士兰 caMRSA 克隆)。PVL 阴性分离物属于 CCl, CC8, CC8/ST239, CC12, CC22，CC25, CC30, CC45, CC59, CC121, CC425 包括 MRSA 菌株 CCl-MRSA-1V (WA-MRSA-1/57)，ST239-MRSA-1II (维也纳 / 匈牙利 / 巴西克隆)，CC22-MRSA-1V (UK-EMRSA-15/Barnim EMRSA)和ST59-MRSA-V。进一步包括来自英国西南部第二中心的已知为PVL阳性的28个分离物。这些分离物被排除在PVL概率分析之外，但他们的种群结构是值得注意的。这个组仅包括 2 个 PVL 阳性 MRSA，ST772-MRSA-V (孟加拉海湾 caMRSA 克隆 /WA-MRSA-60) andCC1-MRSA-1V (USA400)。也包括一个 CC59-MSSA可能是 ST59/ST952-MRSA-V (T)(台湾 caMRSA克隆)的SCCmec检测突变体,根据抗性基因和毒性标记(erm(B), apha3, sat, tet (K), cat,fexA, seb/k/q, lukF/S-PV)的杂交属性。这个组中最常见的菌株是PVL阳性CC22_MSSA(n=10)。另外5个具有SPA类型t417或tl601的PVL阳性CC22分离物携带“SCCfus”组件(ccrA/B-1，and Q6⑶50，or fusC)。这些分离物来自平均年龄接近94岁的患者。这在PVL阳性中是不寻常的发现，这说明这个克隆物与这个区域护理设备间的可能联系。PVL是金黄色葡萄球菌独特的毒力标志，与临床症状的关联非常普遍，这些症状往往要么慢性/反复发作，或偶尔进展迅速而危及生命。因此PVL的诊断检测能满足目标患者的管理的需要。这里所述的横向流测定允许在不能轻易进行分子测定的常规细菌学实验室中进行PVL快速检测。当利用标准培养基的过夜培养物时，例如Columbia血琼脂，这样就能轻易的整合入常规诊断实验室的工作流程中。因此测定可能有助于及时干预PVL相关感染病例，也能帮助选择一些需要递交参考中心进一步分型的菌株。金黄色葡萄球菌体外分泌的PVL有广泛的变化，然而基因型和表型间的高度一致说明lukS/F-PV阳性菌株在标准培养基条件下通常能表达可检测数量的PVL。在这个研究中没有鉴定到含有PVL基因却不产生体外毒素的分离物。由于缺少体外表达造成假阴性的可能性是很低的。这个研究中所包括的PVL和lukM/lukF-P83阳性菌株的多样性说明，可能的PVL序列特异变体菌系不会对PVL检测造成障碍，PVL检测使用这里所述的抗体。这里描述的菌株收集物进一步提供了与SSTI相关的金黄色葡萄球菌的分子流行病学的快照。在PVL阳性甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌中，CC121(总计50个分离物)和CC30(35个分离物)占主导地位。在特立尼达和多巴哥共和国中PVL阳性CC8-MSSA是非常丰富的，虽然这个菌株在其他地方罕见。这印证了USA300菌株在加勒比海/拉丁美洲地区出现的假说。这个研究还显示了 MRSA在世界的不同部分造成了严重的问题。MRSA(在这个研究中)流行率低或没的国家是瑞典和乌干达，瑞典在MRSA感染控制是具有非常严格的政策，乌干达在医疗保健和兽医中使用抗生素对金黄色葡萄球菌的选择压力比其他国家有更多的限制。在别的地方，由PVL阳性/ACME阳性 ST8-MRSA-1V (USA300)，PVL 阳性 /ACME 阴性 ST8-MRSA-1V, PVL 阳性 ST80-MRSA-1V (欧洲 caMRSA 克隆)和 ST93-MRSA-1V(昆士兰 caMRSA 克隆)和 PVL 阴性 ST239-MRSA-1II 主导的MRSA经常被分离到。横向流测定与MRSA显色筛选培养基相结合的可能性促进了新兴的PVL阳性caMRSA菌株的快速筛选。这有助于捕获它们的传播和进一步的扩散。在澳大利亚和西班牙分离物中PVL阳性的高百分率以及ST93-MRSA-1V(昆士兰caMRSA克隆)和ST8-MRSA-1V在这两个国家的主导优势说明，是以建立PVL阳性MSSA种群为代价外，PVL阳性caMRSA的扩展没有发生。除了限制内酰胺的功效作为主要的治疗选择，PVL阳性caMRSA的出现可能因此导致PVL疾病相关的负担增加。虽然在当前研究中分离物的数量不足以明白的证明这样的趋势，还需进行关于PVL阳性金黄色葡萄球菌的分子流行学的进一步研究。
[0181]这里所述的发明可以在缺少未具体公开的任何要素或多个要素，一个或多个限制的情况下实施。所采用的术语或表达被用作描述术语而不是限制，并且，这里也没有任何意图在使用本发明的术语和解释的时候，并没有排除那些与本发明描述的特征等同的例子，但是，可以认识到，很多基于本发明权利要求范围内的改动也是可能的。以你，可以理解，尽管本发明机遇很多的实施例子进行了揭示和描述，基于发明描述的精髓进行改进或改变是本领域一般技术人员可以进行的，这样的改变和活便也被认为是属于本发明哪些从属权利要求所限定的范围。
[0182]本发明说明书中提到的所有文章、专利和专利申请，和所有其他文献和电子信息和杂志的全部或部分作为本发明的一部分作为参考。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。 申请人:保留物理上的上述文章、专利、专利申请或其他文献与本申请说明书结合的权利。
[0183]这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。
【权利要求】
1.一种检测样品中生物分子的方法，包括: a)让样本与抗体或抗体的功能片段接触并形成轭合物，该抗体特异结合选自以下一个或多个基因的表达产物:IukS-PV, IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和 spa ； b)检测轭合物，从而检测所述的毒素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中抗体或抗体的功能片段是PVL-1841的克隆，PVL-1321的克隆，或PVL-1401的克隆。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，样本与抗体或抗体片段接触，所述的抗体或抗体的功能片段为PVL-1841克隆，PVL-1321克隆，和PVL-1401克隆中的至少两个克隆。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，抗体或抗体片段从下列中进行选择:PVL-1031，PVL-1061,PVL-1101, PVL-1321,PVL-1401, PVL-1451,PVL-1631,PVL-1711,PVL-1771, PVL-1841，PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10,PBP2a-17C8, PBP2a-19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和SPA-4412。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，抗体或抗体片段为下列PVL-1031，PVL-1061，PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-188I,PBP2a-1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10, PBP2a_17C8, PBP2a_19BI, PBP2a-8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和 SPA-4412 中的至少选择两个。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的功能结合片段选自抗体或抗体片段从下列Fab, F (ab’) 2，Fd, Fv或者它们的组合进行选择。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的抗体与可被检测的标记物轭合。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述的标记物为金属颗粒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述的金属为金。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的样本包括预培养的金黄色葡萄球菌的细胞中的表达产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述的培养基为液体或固态培养基。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括让样本与抗体或抗体的功能片段接触，其中所述的抗体或功能片段特异结合PVL，PBP2a，或A蛋白或者它们的组合。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)在免疫检测装置或微阵列上进行。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的免疫检测装置为横向流动免疫检测装置。
15.抗体或抗体的功能结合片段，该抗体或功能结合片段特异结合IukS-PV,IukF-PV,IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一个或多个基因的表达产物，其中所述的抗体选自于 PVL-1031, PVL-1061, PVL-1101, PVL-1321, PVL-1401, PVL-1451, PVL-1631, PVL-1711, PVL-1771, PVL-1841, PVL-1881, PBP2a_1631, PBP2a_1721, PBP2a_1941, PBP2a_6G10, PBP2a_17A10, PBP2a-17C8, PBP2a_19Bl, PBP2a_8A5, PBP2a_9C6, PBP2a-pc_2.1, PBP2a-pc_2.2，SPA-A135,和 SPA-441216。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中所述的功能结合片段从？&13，？(&13’)2，？(^\或它们的组合中进行选择。
17.根据权利要求16所述的抗体，所述的抗体或者功能结合片段与可被检测的标记物轭合。
18.根据权利要求17所述的抗体，所述的可被检测的标记物为金属颗粒。
19.根据权利要求18所述的抗体，所述的金属为金。
20.根据权利要求15所述的抗体，其中所述的抗体或功能结合片段被下列核酸序列SEQ ID NOs: 1,3，5，7，9 或 11 所克隆。
21.根据权利要求15所述的抗体，其中所述的抗体或功能结合片段包括SEQIDNOs: 2，4，6，8，10或12的氨基酸序列。
22.检测样本中生物分子的检测装置，该装置包括如权利要求15所述的抗体或功能结合片段。
23.根据权利要求22所述的装置，其中该装置被设置为微列阵或横向流动试剂盒。
24.用于检测样本中生物分子的盒子，该盒子包括如权利要求15所述的抗体或功能结合片段。
25.根据权利要求24所述的盒子，进一步包括一个或多个试剂和说明书。
26.用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法，包括通过让样本接触如权利要求15所述的抗体来形成抗体轭合物,从而检测IukS-PV, IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一个或多个基因的表达阐述的水平；和检测所述的轭合物。
27.抗体或抗体的工能结合片段,其中该抗体或其功能结合片段特异结合IukS-PV,IukF-PV, IukM, lukF-P83, mecA,和spa基因中的一个或多个基因的表达产物或它们的肽链，其中所述的抗体与权利要求20-21所述的结合所述表达产物的抗体竞争。
【文档编号】G01N33/53GK104185790SQ201280055383
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】R·易瑞特, S·莫列克, J·J·瑞嘉麦, J·布鲁且尔 申请人:美艾利尔圣地亚哥公司