抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体及应用

抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体及应用
【专利摘要】本发明公开了一种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体及其应用，它由保藏号为CCTCC NO.C201669的杂交瘤细胞株AbM?F14FTSSCLS0167?KLH#15所分泌，本发明还公开了所述单克隆抗体的制备方法和应用。本发明的单克隆抗体能特异性地抑制Kv1.3通道的功能，降低血小板胞内钙浓度、抑制血小板活性，从而达到减少或防止血栓形成的目的。CCTCC NO:C20166920160420
【专利说明】
抗电压门控钾通道1 .3胞外环肽段的单克隆抗体及应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单 克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 电压门控钾通道（英文全称：voltage-gated potassium channel 1.3,以下简称 Kvl.3)是一类能够感受电压变化从而使钾离子跨膜外流的通道蛋白。它们在神经元、肌细 胞、淋巴细胞及血小板等可兴奋及非可兴奋细胞的生物电信号传导中发挥作用。电压门控 钾通道家族成员之一的Kvl. 3通道是电压依赖性钾通道Kvl家族主要的表达亚型之一，其由 KCNA3基因编码，是电压门控钾通道Shaker家族的成员。其由大约500个氨基酸的亚单位非 共价结合形成的同源四聚体，包括6个a螺旋组成的4组蛋白质亚单位6次跨膜形成单孔道通 道，它的门控由膜电位所控制，膜电位的改变可被包含正电荷的"电压感受器"区域所感知。 当细胞活化，膜电位高于-40mv时通道开放，使钾离子跨膜外流，使得膜电位负值加大，跨膜 电势差增大形成相对超极化电位，顺着电势差，钙离子流入细胞内，导致胞内钙离子浓度的 增加，而钙离子是重要的第二信使，能激活后续信号，使细胞进一步活化。Kvl. 3通道表达于 多种组织和细胞如：脑、脾、淋巴结、胰岛、睾丸、淋巴细胞、血小板等。大量研究已证实， Kvl.3在多种疾病中发挥重要作用：多发性硬化、1型糖尿病、银肩病、类风湿关节炎、移植物 抗宿主病、系统性红斑狼疮、冠状动脉硬化性心脏病、肿瘤等。因此，近十年来，Kvl.3通道的 研究受到广泛的关注。
[0003] Kvl. 3是血小板上主要的一种钾通道，每个血小板上大约有325个，密度相当于25y nf2，其在保持血小板膜电位及血小板活化中起到重要作用。现已证实，随着细胞活化，Kvl. 3 的大量开放促使钙离子大量内流入胞，激起后续反应。而抑制Kvl.3通道能够显著减弱钙离 子内流，减少胞内钙离子浓度的增加，降低细胞的活化。血小板的活化依赖于胞内钙离子浓 度的上升，钙离子作为第二信使和重要媒介能通过"钙触发一一钙释放"使胞内囊泡中的钙 离子大量释放同时引发胞外钙离子的大量内流，导致胞内钙浓度的迅速上升引起下游信号 分子活化，使血小板粘附位点暴露、囊泡大量释放诱聚物质、血小板骨架发生变化，最终导 致血小板聚集、活化，形成血栓。因此，通过抑制Kvl.3通道的功能，降低血小板胞内钙浓度、 抑制血小板活性，从而达到减少或防止血栓形成的目的在血栓性疾病、心血管疾病治疗中 前景令人瞩目，因此，寻求一种有效的、高选择性的Kvl.3阻断剂将受到更多的关注。
[0004] 目前所筛选出的选择性Kvl. 3通道阻滞剂主要是小分子化合物或从蝎子毒液和海 葵中提纯的毒肽类物质。然而由于电压门控钾通道具有较高的结构同源性，即不同的电压 门控钾通道具有高度一致的药物结合位点，因此研究发现，相当多一部分小分子化合物及 其衍生物和毒肽类物质在阻滞Kvl. 3通道的同时亦能阻滞神经系统和心脏中的电压门控 钠、钙等其他离子通道。例如:Kvl. 3通道与心脏复极HERG和KCNQ1/KCNE1钾通道阻滞剂结合 位点高度保守，因而使得现有的一些Kvl. 3通道阻滞剂，在阻滞Kvl. 3通道的同时，亦对HERG 和KCNQ1/KCNE1通道产生阻滞作用，常常会导致药源性的心律失常的发生，阻碍了一些 Kvl.3通道阻滞剂进一步开发成为临床药物。因此，美国食品和药品管理局(FDA)要求新上 市的该类药物应评估其对心脏复极电流的影响。另外，人源性和小鼠源性的Kvl.3通道的同 源性也较高，其氨基酸序列差异较小，因此开发出人源性Kvl. 3通道抑制剂，在小鼠水平进 行活体研究能为后期临床实验提供强有力、可信度高的实验证据。
[0005] 抗体与抗原的结合具有亲和力强、特异性高的特点，理论上开发出针对Kvl.3具有 阻滞效应的抗体可以作为Kvl. 3通道特异性的阻滞剂。中国发明专利（授权公告号 CN102180950B授权公告日2013.06.05)公开了一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽 段及其用途，该研究以人Kvl.3通道胞外环的一段肽段E314为免疫原性肽段，通过免疫学的 方法制备针对该肽段特异性的抗体有助于自身免疫性疾病或自身免疫相关疾病的治疗，该 专利并没有筛选出杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，并且该肽段E314为免疫原性肽段制备得 到的抗体并没有涉及在抗血小板，抗血栓方面的试验。

【发明内容】

[0006] 本发明的第一目的是提供能分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0007] 本发明的第二目的是基于人源性电压门控钾通道Kvl.3免疫原性肽段E314制备抗 Kvl. 3胞外环肽段E314的单克隆抗体；
[0008] 本发明的第三目的是提供所述单克隆抗体在抗血小板，抗血栓的应用。
[0009] 为实现上述第一目的，本发明采用的技术方案是：
[0010] 采用中国发明专利（授权公告号0价021809508授权公告日2013.06.05)中的人源 性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段为抗原，免疫小鼠进行细胞融合实验得到杂交瘤细胞， 将杂交瘤细胞进行筛选得到杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15,所述杂交瘤细胞 株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0: C201669，保藏日期：2016 ? 4 ? 20。
[0011] 所述人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段的氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asp-Pr〇-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pr〇-Asp 〇
[0012] 为实现上述第二目的，本发明采用的技术方案是：
[0013] -种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体的制备方法：
[0014] 将人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段作为免疫蛋白免疫小鼠，取小鼠的脾 细胞与骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合得到杂交瘤细胞株，经过三次筛选得到一株杂交瘤 细胞株 AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15,将杂交瘤细胞株 AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15 接种于 小鼠腹腔内，得到含单克隆抗体的腹水，用亲和层析法从腹水中提纯得到单克隆抗体。 [0015]为实现上述第三目的，本发明采用的技术方案是：
[0016]将得到的单克隆抗体进行小鼠尾出血时间实验，FeC13致颈动脉血栓形成实验，肺 栓塞实验，血小板聚集实验，血小板ATP释放实验，血小板粘附实验，血小板活化标志蛋白 InterginaIIb03及P-selectin的表达实验，血小板胞内Ca2+浓度的检测实验。通过在体内、 体外水平的小鼠实验证明该单克隆抗体能特异性的阻滞血小板Kvl.3通道功能，通过抑制 血小板胞内钙离子浓度上升从而影响血小板功能，其可作为抗血小板、抗血栓的新型抑制 剂。
[0017]本发明的有益效果：
[0018] 1)该发明中得到了抗电压门控钾通道1.3单克隆抗体的杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15。
[0019] 2)该杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15可大量分泌出抗电压门控钾通道 1.3单克隆抗体。
[0020] 3)该单克隆抗体能特异性的抑制血小板Kvl. 3通道功能，为后续开发其作为临床 抗血小板、抗血栓的新型药物提供理论基础和实验依据。
【附图说明】
[0021] 图1: SDS-PAGE检测单克隆抗体纯度；1为蛋白质marker，2为纯化后的单克隆抗体；
[0022] 图2:小鼠尾出血时间实验，表示对照组小鼠，▲表示尾静脉注射单克隆抗体小 鼠，每只200yg，各 12只，P〈0.001;
[0023] 图3:对照组小鼠与注射单克隆抗体组小鼠在FeCl3作用后2min、4min、6min的血流 情况，*代表血管已被血栓完全堵塞。WT+saline:野生型C57雄鼠注射生理盐水，WT+AbM:野 生型C57雄鼠注射单克隆抗体；
[0024]图4:FeCl3致颈动脉完全堵塞时间统计图，示对照组小鼠，▲示尾静脉注射单克 隆抗体小鼠，每只200yg，各12只，P〈0.001;
[0025]图5:对照组及注射抗体组小鼠建立肺栓塞模型肺脏、心脏HE染色图片，箭头示血 栓；图5A:野生型C57雄鼠注射生理盐水后建立肺栓塞模型小鼠肺脏HE染色图；图5B:野生型 C57雄鼠注射单克隆抗体后建立肺栓塞模型肺脏HE染色图；图5C:野生型C57雄鼠注射生理 盐水后建立肺栓塞模型心脏染色图；图5D:野生型C57雄鼠注射单克隆抗体后建立肺栓塞 模型心脏HE染色图；
[0026]图6:对照组(sal ine)注射生理盐水与注射单克隆抗体组(AbM)小鼠建立肺栓塞模 型，肺脏堵塞血管数/总血管数*100%，每张肺组织切片取10个视野，每组5个肺组织，P〈 0.001；
[0027] 图7:对照组(sal ine)注射生理盐水与注射单克隆抗体组(AbM)小鼠建立肺栓塞模 型，观察20分钟后的死亡率，每组各8只；
[0028] 图8:不同浓度单克隆抗体与人血小板作用聚集曲线，单克隆抗体抑制人血小板聚 集率统计图及IC50;
[0029]不同浓度单克隆抗体在6种诱聚剂作用下人血小板的聚集曲线，ADP:二磷酸腺苷， Epinephrine :肾上腺素，Thrombin:凝血酶，Collagen:胶原，Ristocetin:瑞斯托霉素， A23187:钙离子载体;人血小板聚集率统计图及IC5Q示不同抗体浓度在不同诱聚集作用下血 小板聚集率/未用抗体时血小板的聚集率X100%，从图中曲线算得抗体对ADP(20yM)， Epinephrine(lOOug/ml),Thrombin(0.05U/ml),Collagen(10iig/ml),Ristocetin(1.5mg/ ml)的血小板聚集IC5Q为：9 ? 3μg/ml，8 ? 5μg/ml，8 ? 9μg/ml，8 ? 4μg/ml，9 ? 7μg/ml，对A23187(2y M)没有明显抑制作用，每组6个样本;其中图8A:人血小板与ADP反应血小板聚集曲线；图8B: 人血小板与Epinephrine反应血小板聚集曲线；图8C:人血小板与Thrombin反应血小板聚集 曲线；图8D:人血小板与Collagen反应血小板聚集曲线；图8E:人血小板与Ristocetin反应 血小板聚集曲线；图8F:人血小板与A23187反应血小板聚集曲线；图8G:人血小板聚集率统 计图及IC 50;
[0030] 图9:不同浓度单克隆抗体与小鼠血小板作用聚集曲线，单克隆抗体抑制小鼠血小 板聚集率统计图及IC50;
[0031] 不同浓度单克隆抗体在6种诱聚剂作用下小鼠血小板的聚集曲线，ADP:二磷酸腺 苷，Epinephrine:肾上腺素，Thrombin:凝血酶，Collagen:胶原，Ristocetin:瑞斯托霉素， A23187:钙离子载体;血小板聚集率统计图及IC5Q示不同抗体浓度在不同诱聚集作用下血小 板聚集率/未用抗体时血小板的聚集率X 10 0 %，从图中曲线算得抗体对A D P (2 0 y M)， Epinephrine(lOOug/ml),Thrombin(0.05U/ml),Collagen(10iig/ml),Ristocetin(1.5mg/ ml)的血小板聚集IC5Q为：8 ? 6μg/ml, 9 ? 3μg/ml, 9 ? 4μg/ml, 9 ? 3μg/ml, 9 ? 7μg/ml,对A23187 (2y M)没有明显抑制作用，每组6个样本;其中图9A:小鼠血小板与ADP反应血小板聚集曲线；图 9B:小鼠血小板与Epinephrine反应血小板聚集曲线；图9C:小鼠血小板与Thrombin反应血 小板聚集曲线；图9D:小鼠血小板与Co 1 lagen反应血小板聚集曲线；图9E:小鼠血小板与 Ristocetin反应血小板聚集曲线；图9F:小鼠血小板与A23187反应血小板聚集曲线；图9G: 小鼠血小板聚集率统计图及IC50;
[0032] 图10:血小板ATP释放实验，H示人血小板，M示小鼠血小板Ab示单克隆抗体，血小板 释放ATP能力用血小板上清ATP浓度表示，对照组不加入抗体，实验组加入单克隆抗体(20ii g/ml)，n = 5广P〈0.05广P〈0.01;其中图10A:人血小板ATP释放实验统计图，图10B:小鼠血小 板ATP释放实验统计图；
[0033] 图11:血小板粘附实验，H示人血小板，M示小鼠血小板，Ab示单克隆抗体，标尺表示 100M1;图11A:对照组人血小板粘附实验免疫荧光染色图；图11B:单克隆抗体孵育人血小板 粘附实验荧光染色图；图11C:对照组小鼠血小板粘附实验荧光染色图；图11D:单克隆抗体 孵育小鼠血小板粘附实验荧光染色图；
[0034] 图12:血小板活化标志蛋白Interginanb03及P-selectin的表达实验，H示人血小 板，M示小鼠血小板，Ab示单克隆抗体，n = 5广P〈0.05广P〈0.01;图12A:人血小板在各诱聚剂 作用下Interginanb03的表达；图12B:小鼠血小板在各诱聚剂作用下Interginanb03的表 达；图12C:人血小板在各诱聚剂作用下P-selectin表达情况；图12D小鼠血小板在各诱聚剂 作用下P -selectin表达情况；
[0035] 图13:血小板胞内Ca2+浓度的检测实验，H示人血小板，M示小鼠血小板，Ab示单克隆 抗体，ADP :二磷酸腺苷，Epinephrine :肾上腺素 ，Thrombin :凝血酶，Col lagen :胶原， Ristocetin:瑞斯托霉素，A23187:钙离子载体A23187;图13A:流式细胞术测得在不同浓度 单克隆抗体及各种诱聚剂作用下人血小板胞内钙离子动员情况；图13B:流式细胞术测得在 不同浓度单克隆抗体及各种诱聚剂作用下小鼠血小板胞内钙离子动员情况。
【具体实施方式】
[0036] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合【附图说明】，这些 实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，实施例中所用到的各种常用化学试 剂均为市售产品。
[0037] 实施例1抗原的制备
[0038] 采用中国发明专利（授权公告号0价0218095(?授权公告日2013.06.05)中的人源 性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段，其氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser- Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp。根据其氨基酸序列采用PSSM8型多肽自动合成仪，固相法 合成多肽。采用戊二醛偶联法，以KLH作为载体合成多肽一 KLH完全抗原，将偶联KLH后的多 肽定量3.0mg/ml，得到肽段命名为F14FTSSCLS0167-KLH，置于-70°C冰箱中备用。
[0039] 实施例2杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15的制备
[0040] 1)动物免疫
[00411 将肽段F14FTSSCLS0167-KLH，按每只小鼠60ug蛋白的量皮下初次免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，编号为：1、2、3、4。然后进行皮下第一次加强免疫，免疫量为每只小鼠30ug 蛋白，两周后进行皮下第二次加强免疫，免疫量为每只小鼠30ug蛋白，两周后第三次加强免 疫，免疫量为每只小鼠30ug蛋白，两周后小鼠眼眶取血，须_清效价(如表1所示），选取血清 效价最高1号小鼠，两周后再用免疫原50ug腹腔冲击1号小鼠。
[0042] 其中免疫效价检测方法：用抗原F14FTSSCLS0167-KLH，2ug/ml，4°C包被过夜；2% 牛奶，37 °C封闭2h ;血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照（blank)为PBS，阴性对照 (negative)为阴性血清200倍稀释。用ELISA法在酶标仪450mm波长处测吸收度0D值，以（待 测孔0D值一空白孔0D值)/(阴性对照孔0D值一空白孔0D值）。每次试验均设3个复孔阴性对 照，取平均值做表。
[0043]表1免疫效价的检测
[0045]^2)细胞融合实验
[0046] 2.1)准备骨髓瘤细胞sp2/0:将状态良好的骨髓瘤细胞sp2/0细胞轻柔的从培养瓶 壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中备用。
[0047] 2.2)准备1号小鼠的脾细胞:将免疫完毕后的1号小鼠眼球取血，然后拉颈处死，放 入75 %的酒精中浸泡5min。取一块平皿，在平皿中倒入少量无血清的頂DM，将细胞筛及注射 器内芯放入平皿中，用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上，用注射器的内芯轻轻地 将脾充分碾碎。
[0048] 2.3)骨髓瘤细胞sp2/0与脾细胞混合:将步骤2.2得到的脾细胞吸入步骤2.1中装 sp2/0的离心管中混合，离心1500rad/min，5min，倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞 吹匀。
[0049] 2.4)清洗混合细胞:将离心好的混合细胞，倒掉上清，用无血清的頂DM将细胞小心 轻柔地吹匀，再离心1500rad/min，5min。再将离心好的细胞上清尽量倒掉，拍打离心管底充 分悬浮细胞，将离心管放入37°C温水中，在1分钟内缓慢加入lml的PEG，加完后，在温水中静 置lmin。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的頂DM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的頂DM， 最后离心l〇〇〇rad/min，5min倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀得到混合细胞。
[0050] 2.5)准备胸腺细胞：用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞放入 15ml离心管中，再加入lml的HAT，放在孵箱中备用。
[0051 ] 2.6)培养：将步骤2.3中的混合细胞倒入步骤2.4中准备好的胸腺细胞。再加入 25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放 入湿盒中，然后放入孵箱中培养。
[0052] 3)杂交瘤细胞ELISA筛选
[0053] 3.1)用包被液稀释抗原F14FTSSCLS0167-KLH控制终浓度为2ug/ml，每孔100ul包 被酶标板，置于4°C过夜然后用洗液洗涤3次。共10板X96个细胞单克隆待筛选。
[0054] 3.2)然后用2 %牛奶封闭液封闭，每孔200ul，置于37 °C孵箱，培养2h;后用洗液洗 涤3次。
[0055] 3.3)加入一抗(步骤2.6得到的细胞培养上清）、阴性对照(骨髓瘤细胞SP2/0培养 上清）、空白对照(PBS)、阳性对照（阳性血清用PBS200倍稀释），均为每孔lOOul，置于37°C孵 箱，培养lh然后后用洗液洗涤3次。
[0056] 3.4)每孔中加入20000倍?83稀释的二抗，每孔100111，置于37°(：孵箱，培养111 ;取出 后用洗液洗涤3次。
[0057] 3.5)显色，每孔加入显色液10〇111，显色时间为51^11，然后每孔加入5〇111终止液终 止。
[0058] 3.6)检测：用双波长(450，630)测吸光值，从10板X96个细胞单克隆筛选出11株阳 性杂交瘤细胞株。
[0059] 4)单克隆细胞亚类鉴定
[0060]将步骤3.6中筛选得到的11株阳性杂交瘤细胞株进行亚类鉴定，亚类鉴定的方法 如下：
[0061 ] 4 ? 1)用 1 OOmM PBS(pH7 ? 4)稀释包被抗体至0 ? 5ug/ml，每孔加0 ? 1ml，4°C，过夜。
[0062] 4 ? 2)用PBS-T洗2次，每孔加入200ul封闭液，370C孵育2h。
[0063] 4.3)用PBS-T洗3次;每孔加入100ul杂交瘤细胞株的上清，370C孵育lh。
[0064] 4.4汗85-1'洗3次；用封闭液1:1000稀释的111^标记的抗体0.11111每孔，分别加入适 当的孔中，370C孵育lh。
[0065] 4 ? 5 )PBS-T洗3次；每孔加50ul底物溶液，10-20min内于双波长(450，630)测吸光 值，记录保存数据。
[0066]将筛选出来的11株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到10株IgG的阳性杂交瘤细 胞株(如表2所示）
[0067] 表2亚类鉴定

[0069] 5)杂交瘤细胞终筛
[0070]用已筛出的10株细胞上清与健康人血小板反应，观察其抑制血小板聚集的程度， 筛出15号及14号杂交瘤细胞株，选择最优的一株细胞株即15号杂交瘤细胞，命名为杂交瘤 细胞株 AbM-Fl 4FTSSCLS0167-KLH# 15。
[0071 ]实施例3单克隆抗体的大量制备与初步纯化
[0072] 将杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠 腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水，用亲和层析法 提纯抗体并用SDS-PAGE检测抗体纯度(结果如图1)。
[0073 ]实施例4小鼠尾出血时间实验(结果如图2)
[0074]固定好C57小鼠，用制得的单克隆抗体以每只小鼠200yg的剂量尾静脉注射野生型 C57雄鼠，对照组用同剂量生理盐水尾静脉注射野生型C57雄鼠，5分钟后将鼠尾尖剪去3_， 将尾尖放入37°C蒸馏水皿中，测量自然出血到自然止血的时间。结果如图2,图2表明该单克 隆抗体能明显增加小鼠尾出血时间。
[0075] 实施例5FeCl3致颈动脉血栓形成实验(结果如图3~4所示）
[0076]固定好小鼠，用单克隆抗体以每只200yg的剂量尾静脉注射野生型C57雄鼠，对照 组用同剂量生理盐水尾静脉注射野生型C57雄鼠，将小鼠麻醉，分离颈动脉，用5*5mm纸片浸 入10 %FeCh溶液，包裹分离出的劲动脉40s，用小动物超声仪检测颈动脉血流，并记录血流 完全停止的时间，如图3~4表明单克隆抗体能显著延长FeCl 3致颈动脉血栓形成时间。
[0077]实施例6心肺栓塞实验(结果如图5~7所示）
[0078]固定好小鼠，用单克隆抗体以每只200yg的剂量尾静脉注射野生型C57雄鼠，对照 组用同剂量生理盐水尾静脉注射野生型C57雄鼠，5分钟后尾静脉注射lOOiil胶原与肾上腺 素混合物，观察小鼠状态，30分钟后处死小鼠，取心、肺组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包 埋，HE染色切片。图5~7表明单克隆抗体能显著减轻肺栓塞的发生，减少肺内及右心室内血 栓的形成，降低肺栓塞死亡率。
[0079] 实施例7血小板聚集实验(结果如图8~9所示）
[0080] 取未服用抗凝剂的健康体检人群新鲜血液，llOOrpm离心13分钟分离富含血小板 血浆(PRP);摘眼球取C57小鼠全血lOOOrpm离心13分钟分离富含血小板血浆，加入不同浓度 的单克隆抗体孵育5min后分别与二磷酸腺苷(20yM)，肾上腺素（100μg/ml)，凝血酶(0.05U/ ml)，胶原（lOμg/ml)，瑞斯托霉素（1.5mg/ml)，|丐离子载体A23187(2iiM)反应，在血小板聚集 仪上观察血小板聚集能力，并记录曲线，观察时间为5min，其中图8~9表明单克隆抗体能抑 制多种诱聚剂(二磷酸腺苷、肾上腺素、凝血酶、胶原、瑞斯托霉素）导致的人和小鼠血小板 聚集，其抑制效果最佳浓度为19.38μg/ml，抗体对能增加胞内钙浓度的A23187作用不显著。 [0081 ]实施例8血小板ATP释放实验(结果如图10)
[0082]取未服用抗凝剂的健康体检人群新鲜血液，llOOrpm离心13分钟分离富含血小板 血浆(PRP);摘眼球取C57小鼠全血lOOOrpm离心13分钟分离富含血小板血浆，加入或不加入 单克隆抗体(20μg/ml)，孵育5min后分别与二磷酸腺苷（20yM)，肾上腺素（100μg/ml)，凝血 酶(0.05U/ml)，胶原（10μg/ml)，瑞斯托霉素（1.5mg/ml)，钙离子载体A23187(2yM)反应，离 心取上清用ATP检测试剂盒及酶标仪检测各样本ATP浓度，结果如图10表明单克隆抗体能有 效降低人和小鼠血小板释放ATP的能力。
[0083]实施例9血小板粘附实验(结果如图11)
[0084]用100μg/ml胶原包被载玻片，4°C保存。取未服用抗凝剂的健康体检人群新鲜血 液，llOOrpm离心13分钟分离富含血小板血衆(PRP)，将PRP 2500rpm离心10min弃上清用台 氏液洗三次后得洗涤后血小板;取C57小鼠全血lOOOrpm离心13分钟分离富含血小板血浆， 将PRP2500rpm离心10min弃上清用台氏液洗三次后得洗涤后血小板;加入或不加入单克隆 抗体(20μg/ml)，孵育5min后，将血小板置于胶原包被过的载玻片，lOmin后用PBS洗三次，用 CD41抗体做荧光染色，在荧光显微镜下观察血小板粘附情况，结果如图11表明单克隆抗体 能抑制人及小鼠血小板静态粘附功能，降低其粘附能力。
[0085] 实施例10血小板活化标志蛋白InterginaIIb03及p-selectin的表达(结果如图 12)
[0086]取未服用抗凝剂的健康体检人群新鲜血液，llOOrpm离心13分钟分离富含血小板 血浆(PRP)，将PRP2500rpm离心10min弃上清用台氏液洗三次后得洗涤后血小板;取C57小鼠 全血lOOOrpm离心13分钟分离富含血小板血衆，将PRP2500rpm离心10min弃上清用台氏液洗 三次后得洗涤后血小板;加入或不加入单克隆抗体(20iig/ml)，孵育5min后，分别与二磷酸 腺苷（20yM)，肾上腺素（100μg/ml)，凝血酶（0.05U/ml)，胶原（10μg/ml)，瑞斯托霉素 (1 ? 5mg/ml)，钙离子载体A23187(2yM)反应，用带荧光探针的CD41 (即InterginaIIb03)及 ⑶62p(即P-selectin)孵育血小板，在流式细胞仪上检测其平均荧光强度，图12表明单克隆 抗体能降低Interginanbfo及P-selectin蛋白的表达，显著抑制人及小鼠血小板的活化。 [0087]实施例11血小板胞内Ca 2+浓度的检测(结果如图13)
[0088]取未服用抗凝剂的健康体检人群新鲜血液，llOOrpm离心13分钟分离富含血小板 血浆(PRP)，将PRP2500rpm离心10min弃上清用台氏液洗三次后得洗涤后血小板;取C57小鼠 全血lOOOrpm离心13分钟分离富含血小板血衆，将PRP2500rpm离心10min弃上清用台氏液洗 三次后得洗涤后血小板;加入或不加入单克隆抗体(20iig/ml)，孵育5min后，分别与二磷酸 腺苷（20yM)，肾上腺素（100μg/ml)，凝血酶（0.05U/ml)，胶原（10μg/ml)，瑞斯托霉素 (1.5mg/ml)，钙离子载体A23187(2yM)反应，用Flu 〇-3AM孵育血小板，在流式细胞仪上检测 其平均荧光强度，结果如图13,结果表明单克隆抗体通过降低血小板胞内钙离子浓度而发 挥其抑制血小板活化的功能。
【主权项】
1. 一种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体，由保藏号为CCTCC NO: C201669 的杂交瘤细胞株 AbM-Fl 4FTSSCLS0167-KLH# 15产生。2. 根据权利要求1所述的一种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体，其特征 在于:所述杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15保藏在中国典型培养物保藏中心，保 藏号为CCTCC N0:C201669。3. -种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体的制备方法，其特征在于:将保 藏号CCTCC N0:C201669的杂交瘤细胞株AbM-F14FTSSCLS0167-KLH#15接种于小鼠腹腔内， 得到含单克隆抗体的腹水，用亲和层析法从腹水中提纯单克隆抗体。4. 一种抗电压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体的应用，其特征在于:所述抗电 压门控钾通道1.3胞外环肽段的单克隆抗体在抗血小板，抗血栓药物的应用。
【文档编号】C07K16/18GK105968199SQ201610325161
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】王朝晖, 刘坤, 范澄, 黄诗媛, 盛玉龄, 舒砚文, 刘琳玲, 王珏
【申请人】华中科技大学同济医学院附属协和医院