纳米荧光检测探针及其用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途
【专利摘要】本发明揭示了一种纳米荧光检测探针及其作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途，采用纳米荧光微粒与荧光探针结合制备出实时荧光定量PCR检测中所需的荧光检测探针，该荧光检测探针不仅适用于单一核酸扩增检测试剂盒，也适用于三联核酸扩增检测试剂盒，其中纳米荧光微粒具有核壳结构，粒径为200～400nm，其内核为包含有不同梯度的荧光分子的聚合物微粒，外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团。本发明形成的荧光检测探针使用寿命长，检测灵敏度高，检测结果稳定可靠，大大提高了核酸扩增检测的灵敏度，且其制备成本低，降低了核酸扩增检测试剂盒的检测分析成本，便于推广。
【专利说明】纳米荧光检测探针及其用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸扩增检测【技术领域】，尤其是涉及一种纳米荧光检测探针及其用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途。
【背景技术】
[0002]聚合酶链式反应(PCR)是无需使用活生物体而酶促复制DNA的分子生物学技术。PCR在医学和生物研究实验室中普遍用于多种任务，例如检测遗传疾病、鉴定基因指纹、诊断感染性疾病、克隆基因、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和准确性能力，分子生物学家已将PCR作为核酸检测的首选方法。通常在PCR反应的终点或平台期进行DNA检测，这使得难于定量起始模板。实时PCR或动态PCR通过随着反应进程而记录扩增子浓度而提高了终点PCR分析的性能。扩增子浓度最常通过与被扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。荧光探针的信号强度、灵敏度直接影响了 PCR检测结果的灵敏性和准确性，因此研究一种灵敏度高、光稳定性强、合成成本低的荧光探针用于PCR扩增已成为目前研究的热点。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种纳米荧光检测探针，通过在纳米荧光检测探针碱基两端使用纳米荧光微粒标记，使其能够适用于单联或者多联的核酸扩增检测试剂盒。
[0004]本发明同 时还要提供一种纳米荧光检测探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途，采用本发明中的纳米荧光微粒应用于核酸扩增检测，可以大大提高核酸扩增检测的灵敏度，且降低了核酸扩增检测的检测分析成本。
[0005]为实现上述目的，本发明提出如下技术方案:提供一种纳米荧光检测探针，包括荧光探针，所述荧光探针与靶序列负链互补，且所述荧光探针5’端和纳米荧光微粒结合，3’端带一延伸阻断分子磷酸，所述纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为200~400nm，所述内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，所述外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，所述聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或两者的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50%，所述的荧光分子的重量占所述纳米荧光微粒总重量的0.05%~5%。
[0006]优选地,还包括与所述突光探针具有互补序列的淬灭探针,所述淬灭探针5’端和荧光探针5’端互补，其3’端连接一个淬灭分子对甲基红，且所述淬灭探针与所述荧光探针的长度不等。
[0007]更进一步地，所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。
[0008]所述其它单体为选自氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一种或多种。
[0009]所述官能团为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐及聚乙二醇基中的一种。
[0010]所述荧光分子为罗丹明、荧光素及其衍生物、肾上腺素染料及氟硼莹中的一种或多种。
[0011]优选地，所述荧光分子的重量为所述纳米荧光微粒总重量的0.2%~5%。
[0012]优选地，所述纳米荧光微粒的粒径为200~300nm。
[0013]本发明采取的又一技术方案是:一种纳米荧光检测探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途，所述纳米荧光检测探针可用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒。
[0014]优选地，所述核酸扩增检测试剂盒包括对于单一检测目标以及多项检测目标同步检测的试剂盒。
[0015]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0016]1、本发明采用的纳米荧光微粒具有使用寿命长，制备稳定且具有良好的单分散性等优点，是非常好的荧光信号放大的载体，其与荧光探针结合后形成的检测探针，是荧光检测技术中高灵敏度分析检测和定量测试中的理想检测探针。
[0017]2、本发明中的纳米荧光微粒非常稳定，受外界影响小，荧光稳定，这为通过荧光进行定量检测的核酸扩增 检测提供了良好的检测条件，将其表计的荧光检测探针应用于核酸检测中，可以大大提高检测灵敏度。
[0018]3、本发明中的纳米荧光检测探针制备方法简单，降低了核酸扩增检测试剂盒的检测分析成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1、图2是本发明实施例1制备的纳米荧光微粒的扫描电镜示意图；
[0020]图3~6是本发明核酸扩增检测在四种波长下的检测波形示意图；
[0021 ] 图7是本发明荧光纳米检测探针用于PCR检测与常见荧光物的对比检测波形示意图。
【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例对上述方案作进一步说明，应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中所采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0023]实施例1表面官能团为羧基的纳米荧光微粒的制备，包括如下步骤:
[0024](I)制备表面具有羧基的聚甲基丙烯酸甲酯微粒
[0025]取Polysciences公司产的聚甲基丙烯酸甲酯微粒(2.7%, 0.324 μ m) 5ml,清洗离心后在IOml超纯水中悬浮超声,加入含3mg甲基丙烯酸单体(用于在微粒表面形成羧基)的Iml /K，混合2min,加入含15mg聚乙烯醇的0.5ml /K，搅拌2min,然后加入含8mg十二烧基硫酸钠的0.5ml水,混合2min,然后加入5ml乙醇,搅拌5min,得到聚甲基丙烯酸甲酯微粒。
[0026](2)制备纳米荧光微粒[0027]通过注射器向步骤(1)所得聚甲基丙烯酸甲酯微粒中，缓慢加入含Img罗丹明的750 μ I 二氯甲烧,加入时间可以超过5min,继续搅拌5min。通过注射泵以0.5ml/min速度加入水25ml，然后空气气流去除一些溶剂定容到30ml。对微粒进行离心去除上清液，用90%乙醇清洗三遍，清洗后的微粒用30ml水悬浮，即得纳米荧光微粒。
[0028]实施例2纳米荧光微粒的表征
[0029]取实施例1制备的10μ I纳米荧光微粒，悬浮在750 μ I水中进行检测，在610nm处收集微粒的激光光谱，发射光谱在580nm处采集。对微粒进行扫描电镜测试，粒径在270~290nm之间，粒径均匀，如图1和图2所示。
[0030]实施例3适用于核酸扩增试剂盒的荧光检测探针的制备
[0031 ] 荧光检测探针由两条长短不同但是具有互补序列的荧光探针和淬灭探针构成。其中，荧光探针与靶序列负链互补，其5’端和实施例1制备的纳米荧光微粒结合，其3’端带一延伸阻断分子磷酸。淬灭探针的5’端和荧光探针5’端互补，其3’端连接一个淬灭分子对甲基红。在碱基、甲基红CPG、磷酸CPG的合成原料为中荧光探针和淬灭探针合成，形成荧光检测探针，同时在合成过程中自动生成荧光检测探针的修饰。
[0032]合成完毕后，将荧光检测探针在浓氨水55°C下切割并脱保护15小时，经MicroPure II反相纯化柱纯化后，在进一步用高效薄层色谱板纯化荧光检测探针，最后用分光光度计定量。
[0033]其中合成 原料均购自美国SIGMA公司，荧光探针和淬灭探针采用PE公司的391A型DNA合成仪自动合成。
[0034]实施例4PCR检测步骤
[0035]混合50 μ IPCR反应体系，PCR反应体系内含:引物15pmol，实施例4制备的不同的荧光检测探针各15pmol，检测DNA50-100ng，I倍PCR缓和液，Taq DNA聚合酶2 μ I,Mg++终浓度3pmol/L，混合后，PCR反应体系在PCR检测仪器上，96°C下预变性2min，然后94°C变性10s，53。。复性30s，60。。延伸40s，共40循环。
[0036]取16个样本(四个梯度，其中一个梯度为10个样本量，其他三个梯度各为两个样本量)，在四种波长下检测，如图3~6所示:
[0037]通过分析图3-图6，我们可知:同一种样本在不同激发波长下，测定的CT值差值为0.3内，荧光集团稳定，扩增效率高，斜率为-3.31。
[0038]另外，使用市面上较为常见的荧光物与本发明在FAM激发波长480nm做比较，由图7可知:
[0039]本发明纳米荧光微粒荧光强度高于市面上的荧光物强度，结果稳定可靠，易于推广，且用于PCR扩增检测时的循环数少于使用常见荧光物进行PCR扩增检测的循环数，大大提高了 PCR扩增检测效率。
[0040]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种纳米荧光检测探针，包括荧光探针，其特征在于:所述荧光探针与靶序列负链互补，且所述荧光探针5’端和纳米荧光微粒结合，3’端带一延伸阻断分子磷酸，所述纳米荧光微粒具有包括内核与外壳的核壳结构，粒径为200~400nm，所述内核为包含有荧光分子的聚合物微粒，所述外壳具有修饰在所述聚合物微粒外表面上的一种或多种官能团，所述聚合物微粒为聚甲基丙烯酸甲酯的微粒或甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物的微粒或两者的混合物，其中甲基丙烯酸甲酯的重量至少占所述纳米荧光微粒总重量的50%，所述的荧光分子的重量占所述纳米荧光微粒总重量的0.05%~5%。
2.根据权利要求1所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:还包括与所述荧光探针具有互补序列的淬灭探针，所述淬灭探针5’端和荧光探针5’端互补，其3’端连接一个淬灭分子对甲基红，且所述淬灭探针与所述荧光探针的长度不等。
3.根据权利要求1所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物中，甲基丙烯酸甲酯与所述其它单体的结构单元数均大于等于50。
4.根据权利要求1或3所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述其它单体为选自氟乙烯、氯乙烯、溴乙烯、乙烯碘化、苯乙烯以及丙烯酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述官能团为选自羧基，乙醇胺基，羟基，胺基，氨基，亚胺基，环氧基，异氰酸酯基，金属醇盐及聚乙二醇基中的一种。
6.根据权利要求1所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述荧光分子为罗丹明、荧光素及其衍生物、肾上腺素染料及氟硼莹中的一种或多种。
7.根据权利要求1或6所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述荧光分子的重量为所述纳米荧光微粒总重量的0.2%~5%。
8.根据权利要求1所述的纳米荧光检测探针，其特征在于:所述纳米荧光微粒的粒径为 200 ~300nm。
9.一种纳米荧光检测探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途，其特征在于:所述纳米荧光检测探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的纳米荧光检测探针用作单联或多联核酸扩增检测试剂盒的用途，其特征在于:所述核酸扩增检测试剂盒包括对于单一检测目标以及多项检测目标同步检测的试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK103834734SQ201410081406
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】李明, 李超, 彭年才, 倪晓龙, 苗保刚, 李红东 申请人:苏州天隆生物科技有限公司