温和气单胞菌的lamp检测引物组及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种温和气单胞菌LAMP检测引物组及检测试剂盒。包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，所述试剂盒包括检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。还公开了利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法；本发明的试剂盒操作简便快速，适合现场检测；特异性强；检测灵敏度高，可达到320fg/mL；准确率高、可靠，具有广泛的应用前景。
【专利说明】温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于温和气单胞菌检测【技术领域】，具体涉及一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒。
【背景技术】
[0002]温和气单胞菌(Aeromonas sobria,AS)隶属于弧菌科,气单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌。广泛分布于淡水、污水、土壤以及人的食物链，是水产养殖中危害较大的致病菌之一，此病常暴发流行，死亡率高，能引起出血性败血症，主要危害中华鳖、巴西龟、罗非鱼、鲤鱼、黄鳝、鳗鲡、泥鳅、蟹。同时也可以通过被污染的水产品、畜禽肉类和水源等途径感染人，弓丨发患者出现急性腹泻，也可能引起脑膜炎、脓毒性关节炎和败血症。不仅给养殖业造成严重的经济损失，同时给人类健康带来危害，是一种重要的人-畜-鱼共患病的病原体。国内外学者普遍认为，早发现疾病并采取诸多措施阻止细菌传播，是综合预防有效的方法。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的温和气单胞菌检测方法是减少温和气单胞菌发生和危害的重要途径。[0003]目前温和气单胞菌的检测方法主要有生化检验法和分子生物学方法等。由于气单胞菌的生化性状上极为相似，在常规诊断上需通过生化检验排除其它种，检验方法步骤繁琐、需要鉴定的生化反应数目多，耗时长，且易造成结果不准确，特别是鉴定到种的水平，尤为困难，其特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。PCR技术自问世以来，凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验人员和环境的要求高，仪器设备复杂、操作步骤多。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR的仪器设备昂贵，使用成本较高，无法满足现场检测需要。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、定量化、费用低廉化的方向发展。因此，建立检测温和气单胞菌快速准确的方法，对促进中国水产养殖、水产品安全及口岸检疫有重要作用。
[0004]环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是NOTOMI 等建立的一种新的核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6 (或8)个区域设计4 (或6)种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在60~65°C的恒温条件下,历时几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、电泳等过程，基因的扩增及产物检测可一步完成。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。但是迄今为止，市场上还未见用于检测温和气单胞菌的LAMP检测引物及试剂盒问世。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，该引物组特异性强，灵敏度高。
[0006]本发明的目的还在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，快速，简便，成本低。
[0007]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID N0.6中所示。
[0008]各引物具体的核苷酸序列分别如下所示:
[0009]AS-F3:CGGACGAATGGACTCGAA (SEQ ID NO:1)。
[0010]AS-B3:AAGCTCTGGCAGAGGCTC (SEQ ID NO:2)。
[0011]AS-FIP:AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC (SEQ ID NO:3)。
[0012]AS-BIP:GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG (SEQ ID NO:4)。
[0013]AS-LF:AGCGAGTTCCGGCTCTTC (SEQ ID NO:5)。
[0014]AS-LB:CACTTCGCAAGCCTGCTG (SEQ ID NO:6)。
[0015]本发明还提供一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括上述三对检测引物组。
[0016]本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括上述三对检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。
[0017]作为本发明的一种较佳的实施方式，本发明所述的检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比为8:4:1。
[0018]本发明所述的LAMP反应液优选含IOmM dNTP、10 X ThermoPol反应缓冲液和150mMMgSO4水溶液，作为一种较佳的实施方案，其中IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
[0019]本发明所述的阳性对照优选为含有温和气单胞菌ZipA序列(Genbank登录号为JN830311.1)的重组质粒，所述的阴性对照为无菌去离子水。
[0020]作为本发明的更进一步改进:本发明所述试剂盒还包括显色剂SYBR Green I。
[0021]本发明利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法，可以含以下步骤:
[0022](I)提取待检样品DNA,用DNA提取试剂盒提取待检样品细囷的DNA,犾得待检样品的DNA提取液；
[0023](2)恒温基因扩增LAMP反应:选取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照，调节反应温度为63~65 V，反应时间65min，反应结束后80°C保持5min ；
[0024](3)结果判断:通过观察反应容器内白色沉淀的产生来判断扩增结果，如有沉淀，则表不待检样品中存在温和气单胞圃，如无沉淀，则表不待检样品中不存在温和气单胞圃；或在LAMP反应产物中加入6XBuffer以及琼脂凝胶进行电泳，电泳结束后将凝胶采用EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，如发现有阶梯状的扩增条带，则待检样品中存在温和气单胞菌，如无阶梯状的扩增条带，则待检样品中不存在温和气单胞菌。
[0025] 在该检测温和气单胞菌的方法中:
[0026]本发明步骤(2 )中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比优选为 8:4:1。
[0027]本发明步骤(2)中所述LAMP反应液含IOmM dNTPUOXThermoPol反应缓冲液和150mM MgSOyjC溶液，其中 IOmM dNTP、10XThermoPol 反应缓冲液和 150mM MgSOyK溶液的体积比优选为8:5:2。
[0028]作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤(2)的恒温基因扩增LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25 μ L，25 μ L的LAMP反应体系具体包括:8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6 μ M，AS-BIP1.6 μ Μ, AS-LF0.8 μ M, AS-LB0.8 μ Μ, AS-F30.2 μ Μ, AS-B30.2 μ Μ,2 μ L待检样品的DNA提取液，无菌去离子水补足至25 μ L，并加入两滴矿物油，振荡离心，以及阳性对照和阴性对照。
[0029]本发明利用上述温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒检测温和气单胞菌的方法，还可以含以下步骤:
[0030](I)提取待检样品DNA,用DNA提取试剂盒提取待检样品细囷的DNA,犾得待检样品的DNA提取液；
[0031 ] (2)恒温基因扩增LAMP反应:取LAMP检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液和封闭液矿物油，置于反应容器中，并设置阳性对照和阴性对照，调节反应温度为63~65°C，反应时间65min，反应结束后80°C保持5min，其中显色剂SYBR Green I在LAMP反应前加入反应容器中或待LAMP反应结束后加入反应容器中；
[0032](3)结果判断:通过观察反应容器内颜色的变化来判断扩增结果，如显色橙色，则表不待检样品中不存在温和气单胞囷，如显不绿色，则表不待检样品中存在温和气单胞囷。
[0033]在该检测温和气单胞菌的方法中:
[0034]步骤(2)中所述LAMP检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比优选为8:4:1。
[0035]步骤(2)中所述LAMP反应液含IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液和150mMMgSOyjC溶液，其中IOmM dNTP、10XThermoPol反应缓冲液和150mM MgSOyK溶液的体积比优选为8:5:2。
[0036]作为该检测方法的一种优选的实施方案，其中步骤(2)的恒温基因扩增LAMP反应中，LAMP反应体系可以为25 μ L，25 μ L的LAMP反应体系具体包括:8U Bst DNA聚合酶，AS-FIP1.6 μ M，AS-BIP1.6 μ Μ, AS-LF0.8 μ M, AS-LB0.8 μ Μ, AS-F30.2 μ Μ, AS-B30.2 μ Μ,2 μ L待检样品的DNA提取液，无菌去离子水补足至25 μ L，并加入两滴矿物油，振荡离心，显色剂10 X SYBR Green I，以及阳性对照和阴性对照。
[0037]实际上，本发明中对于恒温基因扩增LAMP反应的反应产物，结果判断可采用如下三种方法之一:
[0038]①通过观察反应管内沉淀的产生来判断扩增结果，有沉淀为存在温和气单胞菌，无沉淀为不存在温和气单胞菌，也可采用实时浊度仪(LA-320C)检测。
[0039]②在试剂盒中含有显色剂的情况下，于反应管内盖加10XSYBR Green I I μ L，小心盖上盖子，于温度为63~65°C，反应时间65min，反应结束后80°C保持5min，在1000转/分钟下离心8秒，观察反应结果，或在反应结束后将反应管冷却，打开盖加入加10 X SYBRGreen I I μ L,盖好盖子,在1000/分钟下离心8秒后观察反应结果。通过观察反应管内颜色的变化来判断扩增结果，橙色为不存在温和气单胞菌，绿色为存在温和气单胞菌。
[0040]③电泳检测:取5 μ L LAMP产物与I μ L6 X Buffer混合，加至2%的琼脂凝胶进行电泳，凝胶置于EB中染色后在凝胶成像系统下观察，观察梯形条带，以判断是否有扩增。
[0041]本发明的有益效果是:
[0042]I)快速高效:整个扩增只用65min即可完成，扩增产量可达IO9~101°个拷贝；
[0043]2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测；
[0044]3)高特异性:本发明根据温和气单胞菌的细胞分裂蛋白基因(zipA基因，Genbank登录号为JN830311.1)设计了六条特异性引物，应用上述六条引物，能特异性识别靶序列8个位点，保证了核酸扩增高度特异性；
[0045]4)高灵敏度:本发明的最低检出限达320fg/mL，是普通PCR的100倍； [0046]5)鉴定简便:本发明可肉眼观察白色沉淀或者通过加入SYBR Green I观察颜色变化来判断是否有特异性扩增与否，无需电泳等其它方法判断是否扩增，省时简便，适合现场检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]图1为实施例3中LAMP检测方法对温和气单胞菌的特异性试验图，其中A、B、C = LAMP特异性实时浊度仪图；D: LAMP特异性的核酸染料法图，A图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:嗜水气单胞菌,4:维氏气单胞菌,5:豚鼠气单胞菌,6:大肠杆菌,7:迟钝爱德华氏菌，8:无乳链球菌；B图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:海豚链球菌，4:金黄色葡萄球菌，5:霍乱弧菌，6:蜡样芽胞杆菌，7:志贺氏菌，8:肺炎克雷伯杆菌；C图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:绿脓杆菌，4:弗氏柠檬酸胞杆菌，5:摩氏摩根菌，D图中1:阴性对照，2:温和气单胞菌，3:嗜水气单胞菌，4:维氏气单菌5、维氏气单菌，6:大肠杆菌，7:迟钝爱德华氏菌，8:无乳链球菌，9:海豚链球菌，10:金黄色葡萄球菌，11:霍乱弧菌，12:蜡样芽胞杆菌13:志贺氏菌14:肺炎克雷伯杆菌15:绿脓杆菌16:弗氏柠檬酸杆菌17:摩氏摩根菌，D图中2为绿色；
[0048]图2为实施例4中LAMP检测方法对温和气单胞菌的灵敏度试验图，其中A和B LAMP灵敏度实时浊度仪图；C:LAMP灵敏度的凝胶电泳图；D:PCR灵敏度的凝胶电泳图，A 图中，1:阴性对照 2:10°3:10、:10-25:10、:10-47:10-5，8:10-6，B 图中1:10_72:10_83:10_94:10_1CI，C 图和 D 图中(M:Markerl:阴性对照，2:10°，3:10—1，4:10_2，5:10-3，6: 1θΛ 7:10-5，8:10-6，9:10-7，10:10-8，11:10-9，12:10-10。
【具体实施方式】
[0049]以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0050]实施例1温和气单胞菌LAMP检测引物组和检测试剂盒的建立
[0051]温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，包括LAMP引物组、LAMP反应液、矿物油、BstDNA聚合酶、阳性对照和阴性对照，产品使用说明书，该试剂盒中还可以含有显色剂SYBRGreen I 。
[0052]I) LAMP引物设计:根据从美国基因数据库检索获得温和气单胞菌(AS) zipA基因序列(Genbank登录号为JN830311.1)为靶基因，选取保守序列，利用在线设计软件PrimerExplorer version4 (http: //primerexplorer.1p/e)设计用于检测温和气单胞菌的特异性引物，其序列见下表1:
[0053]表1引物序列表
[0054]
【权利要求】
1.一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，其特征是:包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID N0.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID N0.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID N0.6中所示。
2.一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述试剂盒包括权利要求1中所述的检测引物组、BstDNA聚合酶、LAMP反应液、封闭液矿物油、阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述的检测引物组中内引物、环引物和外引物的摩尔比为8:4:1。
4.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述的LAMP反应液含IOmM dNTPUOXThermoPol反应缓冲液和150mM MgSOyK溶液。
5.根据权利要求4所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述的IOmMdNTP、10XThermoPol反应缓冲液和150mM MgSO4水溶液的体积比为8:5:2。
6.根据权利要求2所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述的阳性对照为含有温和气单胞菌ZipA序列的重组质粒，所述的阴性对照为无菌去离子水。
7.根据权利要求2-6任一项所述的温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，其特征是:所述试剂盒还包括显色剂SY BR Green I。
【文档编号】C12Q1/68GK103923977SQ201410081114
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月6日 优先权日:2014年3月6日
【发明者】柯浩, 李嘉彬, 马艳平, 刘振兴, 郝乐, 马江耀, 梁志凌 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所