杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用，具 体涉及基于一种杀鲑气单胞菌无标记基因缺失减毒突变株的制剂及应用，该疫苗株主要用 于由杀鲑气单胞菌引发的鱼类疥疮病的免疫防治，属于水产养殖动物病害免疫防控领域， 具体属于渔用细菌性基因缺失减毒活疫苗技术领域。
【背景技术】
[0002] 杀鲑气单胞菌（Jerofflmas 属于气单胞菌科（Jerofflmat/aceae)气 单胞菌属（Xeroffioaas),是一种革兰氏阴性短杆菌，最适生长温度为18~22°C。由杀鲑气单 胞菌引起的疖疮病（Furuneulosis)是鲑科鱼类养殖业的重大病害（Janda J.M. ei a乂， 2010，ClinMicrobiol Rev, 23:35-73.)，严重影响了世界范围内以大西洋鲑（feho sahr )为代表的鲑鱼类养殖业的健康发展，是海水鱼类养殖业中最为重大的风险之一，世 界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，0IE)将其列为重点疫病目录。 除此该菌还能感染绝大部分其他鲑鳟鱼类，如，太平洋鲑（Pacific salmon)、枫叶鲑、虹鳟 (Rainbow trout)、银鲑（Coho salmon)等，和非鲑轉鱼类，如金鱼（Goldfish)、鲤（Common carp)、lt(Catfish)和大菱鲆（Turbot)等，给水产养殖业造成了严重的经济损失（Bergh 0.，2008，Fish Diseases. Science Publishers, PP. 239-277.)。
[0003] 鉴于杀鲑气单胞菌对水产养殖业造成的重大危害，人们在过去近40年的以鲑鱼 养殖业为代表的水产养殖业可持续发展中，不断探索针对杀鲑气单胞菌病害的高效防治策 略。以抗生素为核心的化学疗法曾伴随着世界范围内以海水鱼类养殖为代表的水产养殖业 发展历程，为病害防治和减少病害损失发挥过积极贡献。但这种病害防控策略所导致抗药 病原快速蔓延，水产品安全问题(药物残留）和环境污染的负面影响日趋严重。抗生素的大 量使用和滥用所带来的负面影响已经给世界范围水产养殖业的健康和可持续发展产生了 严重制约。
[0004] 而基于鱼类免疫系统的预防性疫病防控措施则是一种非常有效的符合环境友好 的病害防控策略。疫苗作为一种预防性手段，因其可以使宿主长久地抵抗病原体的感染而 被引入水产养殖业。从鱼疫苗的研发历程和当前发展趋势看，鱼类疫苗大致可以分为四种 类型：1)以病原体全细胞为基础的灭活疫苗；2)以全细胞为基础的减毒活疫苗；3)以具 有抗原活性的亚细胞成分为基础的亚单位疫苗；4)以抗原活性成分的编码基因为基础的 DNA疫苗。目前，国际上已商品化的鱼类细菌疫苗基本为灭活疫苗（Bj0rnE. B.，ei a乂， 2013， Fish Shellfish Immunol, 35:1759-1768)。
[0005] 与灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗相比，由于病原体减毒活菌具有完整的免疫 原组分，较灭活病原菌具有更强的细胞免疫潜能，可诱导产生更有效的免疫应答反应；同 时，其仍然保持的侵染性可使减毒活菌可通过口服和浸泡途径免疫，以此开发的减毒活疫 苗在经济上更具竞争性。由于减毒活疫苗兼具高效、给药方便、经济低廉等综合优势，这对 于需要免疫成千上万数量的水产养殖业来说具有现实的商业应用潜力。
[0006] 根据减毒原理的不同，减毒活疫苗可以分为多种不同类型。其中利用同属不同种 的微生物作为减毒株、传代减毒株、病原自然弱毒株、改变体外培养传代的环境减毒株或是 转座子等基因重组技术开发的减毒株，大都具有两个先天致命的缺陷：1)携带抗性标记和 外源基因片段对环境有潜在危害；2)易回复突变，恢复毒力。毒力易回复和不可控的环境 传播风险是这些疫苗应用所必须重视和解决的。鉴于此，该类减毒疫苗被包括中国在内的 各国生物制品安全检查管理机构审批法规认定为具有较高环境安全风险的生物制品，因而 难以进入商业化开发进程。
[0007] 为了消除基因重组疫苗产品的环境安全潜在危害，无标记基因缺失突变技术发展 为近年来国际上构建基因缺失减毒活疫苗的先进开发技术（Golovliovl.，ei a/.，2003， FEMS MicrobiolLett, 222:273-280)。该技术构建的减毒活疫苗与以往传统技术路线构 建的减毒活疫苗相比具有如下优点：1)开发出的减毒活疫苗不携带抗性标记和外源基因片 断；2)采用基因定向框内大片断缺失，突变和毒力不可回复；3)突变构建的遗传背景清楚， 减毒机理明确。这些都为无标记减毒活疫苗的环境安全控制提供了更加有力的保障。由于 具有公认的产品和环境安全性，基因无标记缺失减毒疫苗已成为目前国际上流行的活疫苗 构建技术，是疫苗开发的国际前沿领域与主要发展方向之一。
[0008] 基因缺失减毒活疫苗构建开发策略中的基因缺失是其技术关键所在，目前主要采 用两种途径选择缺失靶基因：1)选择缺失病原菌已知的毒力因子相关编码基因；2)选择涉 及病原菌在宿主体内定值和存活相关的已知代谢途径关键功能基因。
[0009] 营养缺陷型（Auxotrophy)细菌是一种需要补充一种或几种生长因子才能存活和 增殖的营养突变体，而某些营养因子在脊椎动物组织中是有限可用的。同时，现代分子生 物学技术的发展和对鱼类病原致病机制的不断深入了解使人们认识到许多在宿主内存活 和增殖所必需的功能基因。这些都为减毒疫苗的构建提供了潜在的目的缺失靶基因。以 芳香代谢产物生物合成缺陷为靶点（如aro儿arM突变株）的减毒突变株构建成 为鱼类开发中的可行技术路线（Wangei a7.，2013; Lienei a7.，2014)。基因突 变技术路线的一个基本假设就是基于两种芳香化合物对氨基苯甲酸和2, 3-二羟基苯甲酸 在宿主体内是有限可用的，这种营养缺陷型已被用于人类和陆地动物减毒疫苗的开发中， 如霍乱、破伤风、利什曼病和伤寒（Stocker B.A·，1988, Vaccine, 6:141-145; Ward S.J·， et ^7.,1999, InfectImmunj 67:2145-152, Malcova U. , et ah, 2009, FEMS Microbiol Lett，291 (I) :44-49)。国外有报道通过转座子插入失活技术或无标记基因缺失技术缺 失杀鲑气单胞菌arW基因，成功构建杀鲑气单胞菌(杀鲑亚种)）减毒活疫苗（Vanghun aA，1993; Marsden a7.，1996)。尚未有缺失杀鲑气单胞菌编码分枝酸合成 酶）的报道。
[0010] 分支酸合成酶（Chorismate synthase)是细菌中莽草酸合成代谢途径（Shikimate pathway)的合成酶，催化5-烯醇式莽草酸-3-磷酸合成分支酸，主要涉及芳香氨基酸的 生物合成（Pitchandi P·，a7·，2013，BMC Pharmacol Toxicol，14:29)，其功能编码 基因!功能失调将导致生物体表现为对芳香氨基酸Phenylalanine、Tyrosine和 Tryptophan的营养缺陷型。沿^^^因及营养缺陷型已在大肠杆菌分 枝杆菌水稻白枯叶病菌（o/yzae)、沙门氏菌（5^7避?/?<977沒） 以及高等植物中进行了深入研究（Betancor L.，ei a/·，2005，Vet Microbiol, 107(1-2):81-9; Song H·，2009，Methods Mol Biol, 465:279-95; Song E.S., et al. , 2012, Microbiol Res, 167(6):326-31; Maeda H., et al. , 2012, Annu Rev Plant Biol, 63:73-105)。
[0011] 有研究表明，病原菌染色体上aro?因的缺失突变将导致受体菌株表现为芳香 氨基酸营养缺陷表型，不能有效合成DNA及蛋白合成所需的叶酸及重要毒力因子铁载体的 前体物质2, 3-二羟基苯甲酸等，从而丧失毒力并极大削弱其在环境中的生存竞争力，无法 在宿主体内增殖存活（Chen Q.，ei ，1994, JBacteriol, 176:4226-4234)。
[0012] III型分泌系统为革兰氏阴性病原菌中一类重要的毒力因子（Corneliset al.， 1998; Galan& Collmer, 1999; Nhieu& Sansonetti, 1999)。Burr 等人鉴定出杀鲑气单胞 菌的ΠΙ型分泌系统（Burr et al.，2002，2003)。