专利名称：一种气单胞菌6-38及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物新菌株及其应用，具体涉及一种气单胞菌6-38及其在低温固体废弃物堆肥处理中的应用。
背景技术：
随着有机固体废弃物的日益增多，堆肥技术的作用也越来越大。堆肥化技术实际上是微生物分解利用有机质使其腐熟的过程，微生物是这一过程的主要活动者。微生物的分解代谢活动受环境温度、营养成分、PH等环境因子的影响，它们只有在适宜的环境中，才能进行活跃的代谢活动，分解利用有机废弃物。但是在一些低温地区或春冬季低温时节， 由于低温严重影响了微生物的代谢活动，导致有机废弃物分解周期延长，降低了堆肥的效率。因此目前迫切需要寻找一类低温微生物，它们在低温的环境下仍然能够进行生长代谢活动，降解利用有机物，并且把这类低温微生物接种到有机固体废弃物的堆肥体系中来，在低温条件下发挥它们的降解能力，缩短堆肥时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种气单胞菌6-38及其在固体废弃物堆肥处理中的应用。本发明菌株6-38是从冰冻的畜禽污水中分离筛选到的一株能同时有效分解淀粉，蛋白和脂肪的气单胞菌(Aeromonas sp.)新菌株，已于2010年12月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号CGMCC No. 4402。6-38具体通过如下方法分离得到1、驯化分别取黑龙江哈尔滨市污水处理厂的冰冻畜禽污水的10个样品，每个样品10g， 加入到90mL的无菌水中，在200r/min的摇床中摇30min，放置lh，取IOmL上清液接到90mL 的灭菌的LB液体培养基中，在200r/min的摇床中驯化培养3天，为了使菌株有更强适应性，采取变温驯化培养的方式，即第一天培养温度为5°C，第二天为7°C，后一天为10°C，此为第一个周期的驯化。一个周期后，无菌操作取IOmL的驯化菌液接种到新鲜的驯化培养基中进行第二周期的驯化培养，每个周期都按以上的温度梯度进行驯化，分别驯化一个周期、 四个周期和八个周期共3批样品。2、初筛分别取驯化后的菌悬液lmL，加入到9mL无菌水中，以梯度稀释法制成ΚΓ1，10_2， 10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，10_8的稀释度，取0. ImL平板涂布，每个稀释度涂布3个平板。在 4°C下培养3d，选择菌落分散较好的平板，挑取单菌落，反复3次划线分离纯化，得到的单菌落在4°C下保存。取ImL的无菌水做上述同样的操作，作为对照处理。3、复筛将初筛得到的耐低温菌株在低温下)进行蛋白质、淀粉、脂类和维生素的分解试验，最终筛选出一株能同时有效分解淀粉，蛋白和脂肪的耐低温菌株6-38。6-38具有如下特性革兰氏染色阴性，电子显微镜观察，菌体杆状。单菌落在固体培养基上位乳白色， 直径为4 5mm，表面湿润，中央稍突起，边缘规整。其氧化酶、葡萄糖氧化发酵(发酵型代谢)、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、明胶、v-p、精氨酸、水解酶、苯丙氨酸脱氨酶、七夜灵水解、H2S 等反应呈阳性，酯酶、脲酶等反应呈阴性。本发明菌株6-38的16S rDNA序列与目前发表的气单胞菌的16S rDNA (GenBank 登录号)同源性达到99%。综合形态特征与16SrDNA序列鉴定，6-38为气单胞菌菌新菌株(Aeromonas sp.) 0本发明的还提供含有气单胞菌6-38的生物菌剂，优选的菌剂含有IO8 109cfu/g 活菌数的气单胞菌6-38。本发明还提供制备含有气单胞菌6-38的生物菌剂的方法，包括在种子培养基中发酵气单胞菌6-38，将得到的发酵液和基质混合得到微生物菌剂。其中，所述的种子培养基含有10g/L的蛋白胨、3g/L的酵母膏、5g/L的氯化钠， ρΗ7· O。其中，所述的发酵条件中，发酵温度为15 25°C，转速为120r/min-180r/min，发酵时间为24 48h。本发明还提供气单胞菌6-38菌株在固体废弃物堆肥处理中的应用。本发明提供的气单胞菌6-38菌株适合在环境温度为-10°C 25°C的固体废弃物堆肥处理中的应用，特别适合在15 25°C的固体废弃物堆肥处理中的应用的。具体地，将所述的气单胞菌6-38 制备成IO8 109CfU/ml的液体菌种，按5%。 的接种量接种到堆肥中，提高固体废弃物堆肥的升温速度。其中，优选的固体废弃物堆肥为25 30%，水分55 60%的有机物料堆肥，包括动物粪便、植物秸秆、污泥等的堆肥。本发明从冰冻的畜禽污水中分离筛选到一株能同时有效分解淀粉，蛋白和脂肪的耐低温气单胞菌(Aeromonas sp.) 6_38，此菌株在低温条件下能够快速的降解多种有机物底物，在低温环境中，将其制成菌剂用于畜禽粪便堆肥中，能促进堆肥的升温。加入耐低温菌剂6-38的堆体温度升高速率大于加入中温菌剂Pl (bacillus subtilis)的堆体温度升高速率。在堆肥升温实验进行^h时，加入中温菌剂Pl (bacillus subtilis)的堆体温度达到30. 1°C，而加入耐低温气单胞菌(Aeromonas sp. )6-38的堆体温度达到了 39. 6°C。
图1为堆体温度随时间变化图。图2气单胞菌(Aeromonas sp. ) 6-38的生长曲线图。图3气单胞菌(Aeromonas sp. )6-38有机物降解率。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例16-38菌株的鉴定1. 1生理生化测定将分离到的菌株(保藏号为CGMCC No. 4402)进行鉴定，生理生化测定的方法按照标准方法(中国科学院微生物研究所细菌分类组，1978 ；东秀珠、蔡妙英等，2001)，部分的生理生化性状如表1所示。表1菌株生理生化鉴定
麦芽糖海藻糖明胶 v-p
精氨酸水解酶苯丙氨酸脱氨酶七夜灵水解 H2S1. 216S rDNA 序列分析将菌株6-38接种于液体LB培养基中摇培24h后，取ImL菌液于1. 5mL离心管中， 12000r/min离心3min后收集菌体；将菌体加567 μ L TE缓冲液震荡充分悬浮细胞；加入30 μ L 10 ^WSDSJyL 20mg/mL蛋白酶K倒管并充分混勻，37°C水浴lh，每隔20min颠倒混勻一次；力口100 μ L 5Μ 的 NaCl 混勻，加 80 μ L CTAB/NaCl (10% /0. 7M)溶液轻混，65°C水浴 20min,每隔4分钟颠倒混勻一次；加入750 μ L的氯仿/异戊醇04 1)，混勻后12000rpm离心5min ；取上清加入750 μ L的苯酚/氯仿/异戊醇05 24 1),混勻后12000rpm离心 5min ；取上清加入750 μ L的氯仿/异戊醇04 1)，混勻后12000rpm离心5min ；将水相转移到新的离心管，加0. 6倍体积的异丙醇，轻轻混勻，13000rpm离心15min ；去上清，加ImL无水乙醇，轻混，12000rpm离心5min ；去上清，超净工作台吹干，加200 μ L TE溶液溶解沉淀(可在50°C水浴条件下助溶)； 加1 μ L20mg/mL的RNaseA，37 °C水浴浊；加入200 μ L的苯酚氯仿异戊醇 (25 24 1)，混勻后 12000rpm 离心 5min ； 取水相，加200 μ 1的氯仿异戊醇(24 1)，混勻，12000r/min离心5min ；取水
权利要求
1.气单胞菌(Aeromonassp.)菌株 6-38，其保藏号为CGMCCNo· 4402。
2.含有权利要求1所述的气单胞菌6-38的生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，含有气单胞菌6-38的活菌数为IO8 109cfu/go
4.一种制备权利要求2或3所述的菌剂的方法，其特征在于，在LB培养基中发酵气单胞菌，将得到的发酵液和基质混合得到微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵条件中，发酵温度为15 25°C，转速为 120r/min-180r/min，发酵时间为 24 48h。
6.权利要求1所述的气单胞菌6-38在固体废弃物堆肥处理中的应用。
7.权利要求1所述的气单胞菌6-38在环境温度为-10°C 25°C的固体废弃物堆肥处理中的应用。
8.权利要求1所述的气单胞菌6-38在环境温度为15°C 25°C的固体废弃物堆肥处理中的应用。
9.根据权利要求6 8任一项所述的应用，其特征在于，将所述的气单胞菌6-38制备成IO8 109CfU/ml的液体菌种，按5%。 的接种量接种到堆肥中，提高固体废弃物堆肥的升温速度。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的固体废弃物堆肥为25 30%，水分55 60%的有机物堆料。
全文摘要
本发明提供一株气单胞菌(Aeromonas sp.)6-38，从冰冻的畜禽污水中分离得到，其保藏号为CGMCC No.4402。该菌株能同时有效分解淀粉，蛋白和脂肪，在低温环境中，将其制成菌剂用于畜禽粪便堆肥中，能促进堆肥的升温，而且该菌剂的制备工艺简单，发酵周期短和易于保存。
文档编号C12N1/20GK102181377SQ20101062253
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者李季, 王莉瑛 申请人:中国农业大学