专利名称：一种筛选水产源气单胞菌的简便方法
技术领域：
:本发明属于微生物领域，具体涉及一种筛选水产源气单胞菌的简便方法。
背景技术：
:气单胞菌属于气单胞菌科，广泛分布在水环境，也常在人体、水产动物和食物中检出。水产动物源气单胞菌主要有嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌等，同时也是常见的人鱼共患病原菌，能引起人的食物中毒、腹泻、败血症等。气单胞菌具有广泛的致病性，在高温季节，容易单独或者混合感染包括鱼虾类、贝类、爬行两栖类等多种水产动物，是水产养殖中一种危害性较高的病原菌，容易引起水生动物多种细菌病的暴发，且危害程度高于其它细菌性疾病，成为我国淡水水产养殖业发展的主要威胁(唐江芳，气单胞菌及其在水产中的危害，2007)。而临床上的盲目用药，使病原菌在大范围药物选择压力下，渐渐保留了气单胞菌耐药菌株，甚至是多重耐药菌株，致使抗生素疗效下降(蔡丽娟，等，水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析，水产科学，2011)。这不仅导致药物对水生动物疾病的防控能力大大减弱，同时也严重影响水产动物源性食品的质量安全，还存在将耐药性传播给人类致病菌的潜在风险。因此，监测养殖动物和养殖水体中气单胞菌的存在及其耐药性是防治相关水产动物疾病和保证食品安全的重要措施，而如何高效简便的筛选出气单胞菌是目前最需解决的问题。目前筛选气单胞菌的技术有:1、通过普通培养基培养纯化单菌落后利用细菌快速自动鉴定系统进行筛选，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；2、通过普通培养基培养纯化单菌落后利用核酸的检测技术，包括DNA和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，虽然具有快速、简洁和灵敏的特点，但该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；3、经典的生理生化鉴定方法，该法不仅繁琐、耗时，且要求操作人员有良好的专业素质。4、目前也有些商品化的气单胞菌培养基，如RS培养基、AHM培养基和APM培养基等，但分离率和准确率不高(凌红丽，等，嗜水气单胞菌选择性培养基鉴别效果的比较，1998)。 发明内容:本发明的目的是提供一种筛选水产源气单胞菌的简便方法，利用该方法能够简便分离出水产源气单胞菌，且成本低，准确率高，不需特殊仪器，为筛选分离水产源气单胞菌提供了极大的方便。本发明的非疾病诊断和治疗目的的筛选水产源气单胞菌的简便方法，其特征在于，将待检测样品在无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件；然后将增菌液接种到RS培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，如若在RS培养基平板上呈黄色且光滑的菌落，则为气单胞菌疑似菌；将气单胞菌疑似菌接种至胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，再测试培养好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能够在无盐碱性蛋白胨水中生长良好，且菌落在RS培养基平板上呈黄色且光滑，氧化酶试验呈阳性，则判断菌落为水产源气单胞菌，则待检测样品中含有水产源气单胞菌。本发明的待检测样品可以为底泥、环境水样或者动物的组织样品，当是底泥的时候，可以取3g底泥加入到2ml的无菌水中混匀并静止IOmin后取100 μ L上层液体，接种到3ml无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养；当是环境水样的时候，可以取100 μ L水样，接种到3ml无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养；当是动物组织样品的时候，如是动物的鰓、肝脏或病灶，可以取绿豆大小的动物组织接种于3ml无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养。所述的水产源气单胞菌的常规培养条件优选，当在无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养时，其为28°C振荡培养18 20h，当在RS培养基平板或胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行培养时，其为28°C静置培养18 20h。测试菌落的氧化酶活性，可以将菌落划线于氧化酶试纸上，Imin内观察，若划线处呈紫色或紫红色，则为氧化酶阳性，如果不是，则氧化酶阴性。本发明的无盐碱性蛋白胨水、RS培养基和胰蛋白胨大豆琼脂培养基都是现有技术中已知的培养基，可以从试剂公司购买到。本发明是在研究分析现有选择性培养基特性和气单胞菌不同生理生化特性的基础上建立的。通过增加一个用无盐碱性蛋白胨水将嗜盐嗜酸性细菌排除掉，初筛后的细菌经RS培养基培养和氧化酶试验后，如果细菌在无盐碱性蛋白胨水生长，并在RS培养基上呈黄色且光滑，氧化酶试验呈阳性，则可判断该细菌为水产源气单胞菌。利用该方法能简便分离出水产源气单胞菌，且成本低，不需特殊仪器，为筛选分离水产源气单胞菌提供了极大的方便。
具体实施方式
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以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。无菌水:将去离子水121°C高压灭菌15min，置冰箱4°C保存备用。无盐碱性蛋白胨水,配方:每升含有蛋白胨20g,硝酸钾0.1g,结晶碳酸钠0.2g,蒸馏水1000ml，将蛋白胨、硝酸钾、结晶碳酸钠称量好之后，使其溶于IOOOml蒸馏水中，121°C高压灭菌15min，或从试剂公司购买，按照其说明书配制，4°C保存备用。胰蛋白胨大豆琼脂培养基,配方:每升含有胰蛋白胨15g，植物蛋白胨5g，氯化钠5g,琼脂15g，蒸馏水1000ml，将胰蛋白胨，植物蛋白胨,氯化钠,琼脂称量好之后,使其溶于IOOOml蒸馏水中，121°C高压灭菌15min，或从试剂公司购买，按照其说明书配制。然后倒平板，4°C保存备用。RS培养基，可以从试剂公司购买，按照其说明书配制，121°C高压灭菌15min。然后倒平板，4°C保存备用。实施例1:对本实验室分离保存的已鉴定的细菌进行筛选鉴定。实验步骤:1、打开菌株冻干保存管，接种至3ml无盐碱性蛋白胨水中进行增菌，28°C振荡培养18 20h，获得增菌液。2、用接种环蘸取增菌液，接种于RS培养基平板上，28°C静置培养18 20h。若菌落在RS培养基平板上呈黄色且光滑，则初步判断为气单胞菌疑似菌。3、挑取RS培养基平板上气单胞菌疑似菌菌落,接种至胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行纯化培养，28°C静置培养18 20h，然后将长出的菌落划于氧化酶试纸条，Imin内观察，若划线处呈紫色或者紫红色，为氧化酶阳性，否则则氧化酶阴性。4、结果记录若菌株在无盐碱性蛋白胨水生长良好，记为“ + ”，不生长记为菌落在RS培养基平板上呈黄色且光滑记为“ + ”，不生长或菌落为绿色或绿黄色记为;氧化酶试验结果阳性记为“ + ”，阴性记为三个实验结果均为“ + ”则可判断该试验菌株为水产源气单胞菌。试验所使用的90株细菌中，有77株为水产源气单胞菌，其中嗜水气单胞菌43株，温和气单胞菌5株,维氏气单胞菌10株,脆弱气单胞菌3株,豚鼠气单胞菌6株,简达气单胞菌3株,中间气单胞菌I株,A.aquariorum (气单胞菌属的国内暂无译文的菌株)5株,其他未定种的气单胞菌属菌株I株；金黄色葡萄球菌等非水产源气单胞菌14株。实验结果显示,除了 2株A.aquariorum和I株脆弱气单胞菌、I株维氏气单胞菌在无盐碱性蛋白胨水不生长外，其他73株水产源气单胞菌均能筛选出来，分离准确率为94.80% ;其他13株非水产源气单胞菌的实验结果均不符合本发明所判定的水产源气单胞菌。结果见表1:表1:实验室分离保存的已鉴定的细菌筛选鉴定结果
权利要求
1.一种非疾病诊断和治疗目的的筛选水产源气单胞菌的简便方法，其特征在于，将待检测样品在无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件；然后将增菌液接种到RS培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，如若在RS培养基平板上呈黄色且光滑的菌落，则为气单胞菌疑似菌；将气单胞菌疑似菌接种至胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，再测试培养好的菌落的氧化酶活性； 如果菌落能够在无盐碱性蛋白胨水中生长良好，且菌落在RS培养基平板上呈黄色且光滑，氧化酶试验呈阳性，则判断菌落为水产源气单胞菌，则待检测样品中含有水产源气单胞菌。
2.根据权利要求1所述的简便方法，其特征在于，所述的待检测样品为底泥、环境水样或者动物的组织样品。
3.根据权利要求1所述的简便方法，其特征在于，所述的水产源气单胞菌的常规培养条件，当在无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养时，其为28°C振荡培养18 20h，当在RS培养基平板或胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行培养时，其为28°C静置培养18 20h。
4.根据权利要求1所述的简便方法，其特征在于，测试菌落的氧化酶活性，是将菌落划线于氧化酶试纸上，Imin内观察，若划线处呈紫色或紫红色，则为氧化酶阳性，如果不是，则氧化酶阴性。 ·
全文摘要
本发明公开了一种筛选水产源气单胞菌的简便方法。它是将待检测样品在无盐碱性蛋白胨水中进行增菌培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件；然后将增菌液接种到RS培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，如若在RS培养基平板上呈黄色且光滑的菌落，则为气单胞菌疑似菌；将气单胞菌疑似菌接种至胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板上进行培养，培养条件为水产源气单胞菌的常规培养条件，再测试培养好的菌落的氧化酶活性；如果菌落能够在无盐碱性蛋白胨水中生长良好，且菌落在RS培养基平板上呈黄色且光滑，氧化酶试验呈阳性，则判断菌落为水产源气单胞菌，则待检测样品中含有水产源气单胞菌。
文档编号C12R1/01GK103194404SQ20131007338
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月7日 优先权日2013年3月7日
发明者邓玉婷, 吴雅丽, 谭爱萍, 姜兰, 罗理, 王伟利, 赵飞, 梁爱玲 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所