；72°C延伸 5min。PCR 结果如电泳图所 示，具体如下。
[0035] 图1中：M泳道为DL2000 DNA Marker ;A泳道为杀鲑气单胞菌野生株芳香族氨基 酸合成基因片段，大小为876bp ;B泳道为减毒突变株芳香族氨基酸合成基因片段，大小为 507bp〇
[0036] 图2中：M泳道为λ /HindIII DNA Marker ;A泳道为杀鲑气单胞菌野生株三型分 泌系统相关编码基因片段，大小为2080bp ;B泳道为减毒突变株三型分泌系统相关编码基 因片段，大小为509bp。
[0037] (二）减毒活疫苗制备 培养基与生理盐水组成： (1) TSA培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2. 5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二 钾 2. 5g/L，琼脂 15g/L，pH 7. 1 ?7. 5 ; (2) LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH 7. 1?7. 5 ; (3) 种子培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2. 5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二 钾2. 5g/L，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸均为5mg/L-40mg/L，pH 7. 1?L 5 ; (4) 发酵培养基：胰蛋白胨17g/L，大豆胨3g/L，葡萄糖2. 5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二 钾2. 5g/L，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨本均为5mg/L-40mg/L，pH 7. 1?L 5 ; (5) 磷酸盐缓冲液：氯化钠8g/L，氯化钾0. 2g/L，磷酸二氢钠 I. 44g/L，磷酸二氢钾 0· 24g/L，pH7. 1 ?7. 5 ; (6) 生理盐水：氯化钠9g/L，pH 6. 5-8. 0,121°C灭菌20分钟。
[0038] a、疫苗制备：用接种环挑取保存于TSA培养基上减毒突变株，接种于装有IOOmL液 体LB或TSB种子培养基的500mL摇瓶中，在22°C下振荡培养(转速200转/分钟)，24小时 后，取3mL生长旺盛的菌液接种（0D=4. 0左右）接种于IOOmL新鲜发酵培养基，22°C恒温振 荡培养24小时，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，离心收获菌体（2000 X g，15分钟，15°C )，用 无菌磷酸盐缓冲液重悬到一定浓度。
[0039] b、疫苗冻干制备：冻干疫苗制剂制备前活菌含量不低于50亿/毫升，按照每100 毫升活菌疫苗无菌生理盐水重悬液中添加 l_5g的海藻糖、I-IOg的脱脂奶粉和额0. l_2mM 甜菜碱的比例向活菌疫苗中添加海藻糖、脱脂奶粉和甜菜碱作为冻干保护剂(灭菌)，充分 混匀后，放入已灭菌处理的冻干机内，按照如下冻干参数进行冻干制备：预冷至4°C，维持 0. 5h，降温至-45°C后冻结3h，然后升温至-15°C，抽真空并维持8~9h后继续升温至28°C， 维持6~8h (剩余水分降至4%以下，可判结为冻干终点)。真空压盖铝封后于-15°C保存备 用。
[0040] 冻干疫苗制品在给药时是按如下的方法进行的：首先将冻干疫苗制品取出后置于 室温下（15°C ~20°C)，用无菌生理盐水按照冻干粉原液体积进行复水，再用无菌生理盐水 稀释成所需菌密度(此时即可采用注射或浸泡方式给药)。
[0041] 实验例2 :以斑马鱼为实验用鱼的半致死量（LD5tl)的测定。
[0042] 实验用鱼的饲养：从上海嘉定购置的试验用鱼（斑马鱼），试验用鱼先置于SPF (Special Pathogen Free)实验室适应养殖1周，以挑除不正常个体。在感染试验前，再将 SPF试验用鱼放养于感染实验室中IOL感染实验水槽，继续喂养1周，每槽放养10尾(平均 体长2-3cm)。试验水槽每天使用无菌水替换2/3体积养殖水，水温28. 5°C，上下波动2°C。
[0043] 毒力的评价：将试验用鱼随机分组，每组3个水槽平行试验。
[0044] 在感染试验中，每组试验用鱼用一定梯度剂量的毒株：杀鲑气单胞菌野生毒 株 Jerofflmas SDy0701 (5X 102~5X IO5CFU/ 尾），测试条件和结果如表 1所示。减毒株：杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307 (5X 105~5X IO8CFU/尾）通过腹腔注射进行人工感染，测试条件和结果如表2所示。
[0045] 表1杀鲑气单胞菌毒株对斑马鱼半数致死量的测定结果
【主权项】
1. 一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307,分类命 名为JeroffiOftas 已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年10 月29日，保藏编号为：CCTCC M 2014527。
2. 如权利要求1所述杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株，其特 征是：其缺失了杀鲑气单胞菌野生毒株的芳香族氨基酸合成基因谦]部分片段，具体如 SEQ ID NO. 1所示；和III型分泌系统编码基因及韵部分片段，具体如SEQ ID NO. 2 所示。
3. 权利要求1所述菌株制备的杀鲑气单胞菌活疫苗，其特征是：包括疫苗发酵培养液， 和疫苗发酵培养液经冻干后得到的冻干疫苗。
4. 如权利要求3所述杀鲑气单胞菌活疫苗，其特征是：所述冻干疫苗冻干前，即疫苗发 酵培养液是含有活菌的磷酸缓冲液，活菌的含量为45-80亿/毫升。
5. 权利要求3所述杀鲑气单胞菌活疫苗制剂，其特征是：将所述冻干疫苗和在药理上 可接受的配体复配后得到杀鲑气单胞菌活疫苗制剂，其菌体细胞浓度为10 4~108CFU/mL。
6. 如权利要求5所述杀鲑气单胞菌活疫苗制剂，其特征是：所述药理上可接受的配体 为无菌生理盐水；无菌生理盐水配方为：NaCl 9g/L，pH为6. 5-8. 0。
7. 权利要求3所述杀鲑气单胞菌活疫苗的制备方法，其特征是步骤为： 疫苗发酵培养液的制备：用接种环挑取保存于TSA培养基上减毒突变株，接种于装有 液体LB或TSB种子培养基的摇瓶中振荡培养；所述LB或TSB培养基中加入生长因子，所述 生长因子为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，添加量均为5-40mg/L ;然后再取生长旺盛的菌液 接种于新鲜发酵培养基中继续培养；用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心，最后用无菌磷酸盐缓 冲液重悬，即得到疫苗发酵培养液；发酵培养培养温度均为20~22°C ; 冻干疫苗的制备：取疫苗发酵培养液所得制剂在冻干机内进行冻干；在冻干制备过程 中，添加有冻干保护剂；所述冻干保护剂包括海藻糖、脱脂奶粉和甜菜碱；它们的添加量是 每IOOmL活疫苗中添加 l-5g的海藻糖、I-IOg的脱脂奶粉和0. l-2mM甜菜碱，充分混匀后， 放入已灭菌处理的冻干机内进行冻干，水分降至4%以下即得冻干疫苗。
8. 权利要求3所述杀鲑气单胞菌活疫苗的应用，其特征是：将其应用于预防鱼类所患 由杀鲑气单胞菌导致的大西洋鲑疖疮病；其中冻干疫苗与配体复配后得到杀鲑气单胞菌活 疫苗制剂；杀鲑气单胞菌活疫苗制剂或疫苗发酵培养液通过腹腔注射和浸泡方式给药。
9. 如权利要求8所述杀鲑气单胞菌活疫苗的应用，其特征是给药方式具体如下：注射 方式给药：菌体浓度为l*l〇6~l*l〇 8CFU/mL，注射剂量0. ImL/尾，腹腔注射；浸泡方式给药： 菌体细胞浓度为l*l〇4~l*l〇7CFU/mL，浸泡时间为15~30min，浸泡温度15~18°C。
10. 如权利要求8所述杀鲑气单胞菌活疫苗的应用，其特征是：所述鱼类包括大西洋 鲑、太平洋鲑、虹鳟等鲑鳟鱼类和非鲑鳟鱼类：斑马鱼、大菱鲆。
【专利摘要】杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用，属于渔用细菌性基因缺失减毒活疫苗技术领域。其包括一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株HTAsf-5307，以及通过该菌株制备的杀鲑气单胞菌活疫苗、制备方法和应用。本发明提供的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗株因缺失了杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌相关编码基因的部分片段，相对于其野生毒株具有明显的低毒性和产品安全性，同时，可有效地保护免疫鱼免受杀鲑气单胞菌致病毒株的侵害。该活疫苗免疫效果显著，在实际应用中能很好地防治杀鲑气单胞菌引发的病害。CCTCC M 201452720141029
【IPC分类】A61P31-04, A61K39-02, C12N1-21, C12R1-01
【公开号】CN104560851
【申请号】CN201410837255
【发明人】不公告发明人
【申请人】江苏海健前沿生物科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日