一种重组大肠杆菌利用甘油生产2,3-丁二醇的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将参与2,3-丁二醇生物合成的三个 基因克隆并与大肠杆菌高拷贝载体PUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌中，使用氨苄青 霉素作为筛选标记，以加强这三个基因在大肠杆菌中的表达量，使2,3_ 丁二醇可以在大肠 杆菌中大量合成。
【背景技术】：
[0002] 2,3_ 丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航 天等领域，可以用于生产塑胶，制备防冻剂，并且是一种很好的溶剂，易于转化为各种化合 物生产橡胶，调味品以及化妆品（Syu M J. 2001)。常温下是一种无色无味的透明液体，相对 分子量为90. 12g/mol，其分子式如下所示。上世纪中期，2, 3-丁二醇的生物技术生产得到 了迅速的发展，由于更为廉价的化学合成法的出现，使得生物技术生产2, 3-丁二醇陷入困 境。但是化学合成法使用石油作为原料生产2, 3-丁二醇。最近二十年来，上升的石油价格 导致化学合成法失去了优势，在能源需求不断扩大、化石能源日益短缺、石油资源供应不稳 定的情况下，以可再生的生物质资源为原料，经过生物发酵的方法生产各种化学品、功能材 料和能源物质的生物技术方法获得了人们的青睐。目前，研究热点都在于以糖质作为原料 生产2, 3- 丁二醇，但是，粮食资源日益紧张的今天，开发以廉价的非粮糖质为原料发酵生 产2,3_ 丁二醇具有很好的发展前景·（Xiu and Zeng2008)
【主权项】
1. 一株可利用甘油生产2,3-丁二醇的大肠杆菌8125141，质粒？800，基因工程菌 BD016156和2, 3- 丁二醇合成相关酶的基因 alsS，alsD和bdh。
2. 根据权利要求1中，利用甘油发酵生产大肠杆菌的方法，包括培养所需条件和培养 基配方。
3. 根据权利要求1中利用甘油发酵生产2, 3- 丁二醇的大肠杆菌基因工程菌的制备方 法，包括： a. 利用设计的引物扩增得到三个相关合成酶的基因片段 b. 利用热击法将构建质粒转化入大肠杆菌的方法 c. 用氨苄青霉素筛选阳性克隆并用于生产的方法。
4. 根据权利要求1中三个2, 3-丁二醇合成酶的相关基因设计的引物为：引物序列1， 2, 3,4, 5,6
5. 根据权利要求1中利用基因工程菌生产2, 3- 丁二醇的发酵方法及培养基： LB 培养基（IL) :Tryptone (胰蛋白胨）：10g，Yeast Extract (酵母提取物）：5g， NaCl (氯化钠）：10g。若配制固体培养基，则再加入15g Agar (琼脂）。 M9培养基（IL) :Na2HP04,7H20(七水合磷酸氢二钠）：12.8g，KH 2P04(磷酸二氢钾）：3g， NaCl (氯化钠）：0.5g，NH4Cl (氯化铵）：lg，Glycerol (甘油）：20g。Yeast Extract (酵母 提取物）：5g，IM MgSO4 · 7H20(七水合硫酸镁）1ML，0. IM CaCl (氯化钙）：1ML。 将所得基因工程菌在3ML含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C，250rpm培养12小时， 转入M9培养基，M9培养基在使用前加入氨苄青霉素，37°C培养3小时，加入4 μ L浓度为 0. 5mM的IPTG诱导，并转入30°C，250rpm培养24-48小时。
6. 根据权利要求5中，利用基因工程菌大量发酵生产2, 3-丁二醇的扩大培养方法，包 括分批补料，流加等发酵方法。
【专利摘要】本发明涉及一种使用重组大肠杆菌利用甘油生产2,3-丁二醇的方法。具有如下步骤：1)克隆参与2,3-丁二醇生物合成的基因alsS，alsD和bdh，2)将这些基因与大肠杆菌高拷贝载体pUC19连接以构建含有2,3-丁二醇生物合成所需蛋白的编码基因的重组载体，3)将重组质粒转入大肠杆菌BW25141中，通过氨苄青霉素的筛选标记，从而获得了大肠杆菌高产2,3-丁二醇的菌株，4)通过发酵生产2,3-丁二醇，并从发酵液中回收2,3-丁二醇。该方法具有环保，高效，稳定，价格低廉等优点。
【IPC分类】C12N1-21, C12P7-18, C12N15-70, C12R1-19
【公开号】CN104560843
【申请号】CN201310488514
【发明人】刘立栋
【申请人】常州邱鸿生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月18日