在杀鲑气单胞菌中，III型分泌系统 的编码基因主要以毒力岛的形式存在于内源性质粒（pAsa5)中。pAsa5丢失或III型分泌 系统内膜结构蛋白编码基因柏勺缺失均导致杀鲑气单胞菌毒力的降低（Burr et al.， 2002; Stuber et al.，2003)。AopN为杀鲑气单胞菌III型分泌系统的调控蛋白，与分子伴 侣Acrl (TyeA)、SycN及YscB形成多蛋白复合体，对该分泌过程进行负调控（Schubot et al·，2004)。AscN 作为 ATPase，为 III 型分泌系统提供能量（Blaylock et al·，2004)。 及mcA韵缺失将导致III型分泌系统紊乱。但以此些III型分泌系统编码基因 作为缺失靶基因构建杀鲑气单胞菌减毒活疫苗未见任何文献报道。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种杀鲑气单胞菌野生毒株 的无标记基因缺失减毒活疫苗株及其制剂及应用，该减毒疫苗株消除了传统活疫苗普遍存 在的潜在产品和环境安全风险，是针对杀鲑气单胞菌引起的养殖鱼类疾病的一种安全、有 效、经济的新型疫苗。
[0014] 按照本发明提供的技术方案，一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒 突变菌株HTAsf-5307,分类命名为Jerofflmas 已保藏于中国典型培养物保藏 中心，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为：CCTCC M 2014527。其特点是，缺失了所 述杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨基酸合成相关基因片段，该菌株表现出芳香族氨基 酸营养缺陷特征。
[0015] 所述杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株，其缺失了杀鲑气单 胞菌野生毒株的芳香族氨基酸合成基因谦]部分片段，如SEQ ID NO. 1所示；和III型分 泌系统编码基因 ao/7#、及韵部分片段，如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 所述菌株制备的杀鲑气单胞菌活疫苗，包括疫苗发酵培养液，和疫苗发酵培养液 经冻干后得到的冻干疫苗。所述冻干疫苗冻干前，即疫苗发酵培养液中的活菌含量不低于 45-80 亿 / 毫升，还含有 NaCl 9g/L，其 pH 为 6. 5-8. 0。
[0017] 将所述冻干疫苗和在药理上可接受的配体复配后得到杀鲑气单胞菌活疫苗制剂， 其菌体细胞浓度为10 4~108CFU/mL。所述药理上可接受的配体为无菌生理盐水；无菌生理盐 水配方为：NaCl 9g/L，pH 为 6. 5-8. 0。
[0018] 所述杀鲑气单胞菌活疫苗的制备方法，其特征是步骤为： 疫苗发酵培养液的制备：用接种环挑取保存于TSA培养基上减毒突变株，接种于装有 液体LB或TSB种子培养基的摇瓶中振荡培养；所述LB或TSB培养基中加入生长因子，所述 生长因子为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，添加量均为5-40mg/L ;然后再取生长旺盛的菌液 接种于新鲜发酵培养基中继续培养；用无菌磷酸盐缓冲液洗涤，离心，最后用无菌磷酸盐缓 冲液重悬，即得到疫苗发酵培养液；发酵培养培养温度均为20~22°C ; 冻干疫苗的制备：取疫苗发酵培养液所得制剂在冻干机内进行冻干；在冻干制备过 程中，添加有生长因子；所述生长因子包括海藻糖、脱脂奶粉和甜菜碱；它们的添加量是每 IOOmL活疫苗中添加 l-5g的海藻糖、I-IOg的脱脂奶粉和0. l-2mM甜菜碱，充分混匀后，放 入已灭菌处理的冻干机内进行冻干，水分降至4%以下即得冻干疫苗。
[0019] 所述杀鲑气单胞菌活疫苗的应用，将其应用于预防鱼类所患由杀鲑气单胞菌导致 的大西洋鲑疖疮病；其中冻干疫苗与配体复配后得到杀鲑气单胞菌活疫苗制剂；杀鲑气单 胞菌活疫苗制剂或疫苗发酵培养液通过腹腔注射和浸泡方式给药； 注射方式给药：菌体浓度为l*l〇6~l*l〇8CFU/mL，注射剂量0. ImL/尾，腹腔注射；浸泡 方式给药：菌体细胞浓度为l*l〇4~l*l〇7CFU/mL，浸泡时间为15~30min，浸泡温度15~18°C。
[0020] 所述鱼类包括大西洋鲑、太平洋鲑、虹鳟等鲑鳟鱼类和非鲑鳟鱼类：斑马鱼、大菱 鲆等。
[0021] 本发明的有益效果： (1)本发明提供的杀鲑气单胞菌减毒活疫苗株因缺失了杀鲑气单胞菌毒株的芳香族氨 基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌相关编码基因的部分片段，相对于其野生 毒株具有明显的低毒性和产品安全性，同时，可有效地保护免疫鱼免受杀鲑气单胞菌致病 毒株的侵害。后文实验表明，该活疫苗免疫效果显著，在实际应用中能很好地防治杀鲑气单 胞菌引发的病害。
[0022] (2)本发明提供的杀鲑气单胞菌活疫苗所使用的无标记基因缺失减毒突变株不携 带任何抗生素标记和其他外源标记和基因片段，因此不存在传播抗生素抗性的潜在危险； 采用基因缺失突变(特别是多基因缺失）手段，毒力相关基因大片段缺失，在理论上认为不 可回复，极大地消除了向环境传播大量毒性病原体的可能性，具有技术上的安全性和产品 上的安全性。
[0023] (3)本发明提供的杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒疫苗株的遗传背 景清楚，减毒机理明确，易于区分疫苗株与野生株，便于对环境进行监控，提高疫苗的环境 安全性和可控性。
[0024] (4)本发明的杀鲑气单胞菌活疫苗可制备成冻干疫苗制品，有实际的商业开发应 用价值。
[0025] 生物材料样品保藏：一株杀鲑气单胞菌野生毒株的无标记基因缺失减毒突变菌株 HTAsf-5307,分类命名为Jerofflmas 已保藏于中国典型培养物保藏中心，地 址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2014年10月29日，保藏编号为：CCTCC M 2014527。
【附图说明】
[0026] 图1为杀鲑气单胞菌野生毒株与减毒突变株芳香族氨基酸缺失部分的PCR检测 结果。
[0027] 图2为杀鲑气单胞菌野生毒株与减毒突变株三型分泌系统相关编码基因片段缺 失部分的PCR检测结果。
[0028] 图3为注射免疫斑马鱼后的免疫保护效果曲线图。
[0029] 图4为注射免疫大西洋鲑后的免疫保护效果曲线图。
[0030] 图5为浸泡免疫斑马鱼后的免疫保护效果曲线图。
【具体实施方式】
[0031] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。
[0032] 实验例1 :疫苗株的验证与制备 本发明选择杀鲑气单胞菌野生强毒株(我国山东烟台地区罹患疥疮病的养殖大西洋鲑 病灶处分离到的一株强致病性毒株Jeroffioaas sahoflicitZa SDy0701为疫苗构建出发株， 以其管家基因 aro?因和T3SS分泌系统中的编码基因为缺失靶基因，其 中因的缺失阻断芳香族氨基酸及其叶酸合成，aCr7、伪分泌系统的调控元件， ATP磷酸酶参与III型分泌系统的组装，它们的缺失将导致T3SS分泌系统功能及效应 物的破坏。涉及杀鲑气单胞菌定植能力和重要毒力因子的关键编码基因的大片段双缺失， 大大降低了应用时由于毒力回复突变带来的环境传播危险，具有可靠和稳定的安全性。同 时，缺失减毒疫苗株不带任何外源的抗生素筛选标记和外源基因片段，易于区分疫苗株和 野生型菌株，便于对疫苗株进行监控，提高疫苗的安全性和可控性。目前，除本发明外，国内 外未见利用无标记基因突变技术缺失基因三型分泌系统相关基因制备杀鲑气单胞 菌减毒疫苗的文献和专利报道。
[0033] (一）疫苗株的验证 通过基因工程手段，在杀鲑气单胞菌野生株Jeroffioaas SDy0701的基础 上获得杀鲑气单胞菌减毒突变株，命名为Xerofflmas HTAsf-5307,其缺失了 杀鲑气单胞野生株的芳香族氨基酸合成相关基因的部分片段，和部分三型分泌系统相关编 码基因的部分片段，通过PCR验证可以将疫苗株与野生株区分开。
[0034] 以杀鲑气单胞菌SDy0701和HTAsf-5307的基因组为模版，利用以下用引物做 PCR ： Pl (5， ACTCGAGATAAGCGAAGCG3，）， P2 (5' GGTGATCATCTCTATGGCTTC3'）， P3 (5，CCAACCATAGGGTCAGTTG3，）， P4 (5， GCCCCGTTCACCGATCAGC 3，）， 其中P1/P2验证芳香族氨基酸合成相关基因片段，P3/P4验证三型分泌系统相关编码 基因片段。PCR反应体系中含lOmmol/L Tris-HCl (pH 8.3)，50mmol/L MgCl2，上下游引物 各100pmol，200μmol/LdNTPs，50ng模板DNA，2·5UDNA聚合酶。PCR反应程序为 ：94°C变 性 5min ;95°C 30s，55°C 15s，72°C 3min，30 个循环